專利名稱：一種改造除蟲鏈霉菌產(chǎn)生多拉菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域以及微生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一類與多拉菌素生產(chǎn)相關(guān)的基 因以及操作該類基因生產(chǎn)多拉菌素的方法。
背景技術(shù)：
多拉菌素被譽(yù)為阿維菌素家族最為優(yōu)秀的殺蟲藥物，是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗寄 生蟲藥物，對(duì)線蟲、昆蟲和螨均具有高效驅(qū)殺作用。具有高效，用量小，安全范圍高的特點(diǎn)， 其生物活性相對(duì)阿維菌素，殺蟲活性更高，而對(duì)人體以及牲畜的毒性更低，目前已經(jīng)開始用 于皮下注射。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來講其與阿維菌素的差別僅僅在于第25位取代基不同，阿維菌 素Bla在第25位是一個(gè)2-甲基丁基，而多拉菌素在第25位是一個(gè)環(huán)己基，從生物合成的 角度來看造成該部分結(jié)構(gòu)不同的主要原因是催化形成該化合物的聚酮合成酶起始模塊選 擇的底物不同。從阿維菌素生物合成過程來看，阿維菌素的起始模塊包括一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT) 和一個(gè)?；d體蛋白(ACP)，它們識(shí)別甲基丁酰輔酶A或異丁酰輔酶A作為起始單元。已有 工作[Science (1998) 279，199-202]表明阿維菌素生物合成的起始模塊具有選擇底物的寬 泛性，目前多拉菌素的生產(chǎn)也正是利用了這一點(diǎn)，即通過中斷起始單元的生物合成途徑，然 后在發(fā)酵過程中加入環(huán)己基甲酸作為起始單元來達(dá)到產(chǎn)生多拉菌素的目的。但由于起始模 塊的最適底物仍然是甲基丁酰輔酶A或異丁酰輔酶A，所以產(chǎn)物中經(jīng)?；煊邪⒕S菌素。本發(fā)明針對(duì)上述方法的局限性，通過將阿維菌素生物合成起始模塊替換成為來源 于磷氮霉素生物合成的聚酮合成酶中的以環(huán)己烷羧酸鹽為特異底物的起始模塊[中國專 利201010M7279. 7]，然后再將編碼環(huán)己基甲酰輔酶A生物合成酶的基因在替換的突變株 中進(jìn)行異源表達(dá)，成功地得到了產(chǎn)多拉菌素為主的突變株。如果在發(fā)酵的過程中再添加環(huán) 己基甲酸，通過加大前體的供應(yīng)量，會(huì)使得產(chǎn)多拉菌素的量進(jìn)一步提高，相對(duì)于原始菌株直 接喂養(yǎng)環(huán)己基甲酸產(chǎn)生多拉菌素有了顯著的提高，降低了所產(chǎn)組分的復(fù)雜性，并且所產(chǎn)組 分主要是多拉菌素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改造阿維菌素產(chǎn)生菌生產(chǎn)多拉菌素的基因及方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供兩種位于磷氮霉素生物合成基因序列以內(nèi)的基因序列 及其用途。通過在除蟲鏈霉菌中將編碼催化阿維菌素生物合成聚酮酶起始模塊的基因替換 成為編碼催化磷氮霉素生物合成聚酮酶起始模塊的基因，再導(dǎo)入編碼催化形成磷氮霉素生 物合成過程中所需的環(huán)己基甲酰輔酶A的酶的基因，提高了多拉菌素的產(chǎn)量，所述的基因 選自磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因PnATlACPl基因和ρηΡ1，ρηΡ2，ρηΡ3，ρηΡ4， 并且訴述的基因來自磷氮霉素生物合成基因簇[中國專利201010M7279. 7]。本發(fā)明的第二方面，提供一種通過增加前體的供應(yīng)量來提高除蟲鏈霉菌中多拉菌 素表達(dá)量的方法。包括以下步驟在除蟲鏈霉菌基因組中引入編碼催化形成環(huán)己基甲酰輔酶A的酶的基因，并且訴述的基因選自ρηΡ1，ρηΡ2，ρηΡ3，ρηΡ4基因，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 環(huán)己基甲酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的將目的基因在除蟲鏈霉菌基因組上進(jìn)行替換包 括以下步驟(a)構(gòu)建含有需要替換目標(biāo)基因5和3’旁側(cè)序列和磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊 的編碼基因PnATlACPl基因的替換載體。(b)將含有基因取代載體的宿主菌株作為供體菌株，通過供體菌株-鏈霉菌接合 轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入到除蟲鏈霉菌中，得到含有基因取代載體的除蟲鏈霉菌轉(zhuǎn)化子。(C)轉(zhuǎn)化子經(jīng)高溫誘導(dǎo)得到單交換突變株，再將單交換傳代后獲得發(fā)生了同源雙 交換的重組除蟲鏈霉菌突變株。(d)所述替換載體中基因的5’端旁側(cè)序列、磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的編碼 基因pnATlACPl基因5’-3’序列和基因3’端旁側(cè)序列按上述順序且按上述方向順次連接。用于構(gòu)建替換載體的出發(fā)載體為任意一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體，如 pKC1139，pKC505，pIJ653，pIJ8154，優(yōu)選為pKC1139。以pKC1139為出發(fā)載體構(gòu)建的基因取 代載體為pWJb7381。本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的將環(huán)己基甲酰輔酶A生物合成酶在除蟲鏈霉菌替 換突變株中異源表達(dá)包括以下步驟(a)構(gòu)建含有編碼環(huán)己基甲酰輔酶A全基因序列和紅霉素啟動(dòng)子的異源表達(dá)載 體。(b)將含有基因取代載體的宿主菌株作為供體菌株，通過供體菌株-鏈霉菌接合 轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入到除蟲鏈霉菌中，得到含有基因取代載體的除蟲鏈霉菌轉(zhuǎn)化子。(c)轉(zhuǎn)化子經(jīng)抗性篩選得到帶有抗性的單克隆，再經(jīng)傳代考驗(yàn)其穩(wěn)定性，得到穩(wěn)定 的突變株(d)所需異源表達(dá)基因在其啟動(dòng)子區(qū)域連上紅霉素啟動(dòng)子序列。按照PermE (紅霉 素啟動(dòng)子)-ρηΡ1-ρηΡ4的順序連接。用于構(gòu)建異源表達(dá)載體的出發(fā)載體任意一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體，如 pKC1139，pKC505，pIJ653，pIJ8154，pSET152，優(yōu)選為 pSET152。以 pSET152 為出發(fā)載體構(gòu)建 的基因取代載體為pWJb835。本發(fā)明的另一優(yōu)選例中宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)多拉菌素的方法，包括下面步驟(1)發(fā)酵本發(fā)明上述的經(jīng)替換以及異源表達(dá)環(huán)己基甲酰輔酶A合成酶的除蟲鏈霉 菌；(2)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離多拉菌素。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的被替換基因位于除蟲鏈霉菌基因組中，且只有 一個(gè)拷貝。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，用于替換的基因以及意愿表達(dá)的基因均來自于磷氮霉素 生物合成基因序列。在本方明的第六個(gè)方面，提供所述的經(jīng)替換以及引入環(huán)己基甲酰輔酶A生物合成 途徑的除蟲鏈霉菌的用途，其特征在于用于生產(chǎn)多拉菌素。
本發(fā)明的其它方面由于本發(fā)明的公開內(nèi)容，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易 見的。


圖1 阿維菌素生物合成基因起始模塊替換設(shè)計(jì)。Phoslactomycin B -AMMMM, Avermectin :P可會(huì)11 ， Doramectin :^ , Cyclohexanecarboxylic acid圖2 替換除蟲鏈霉菌中阿維菌素生物合成基因序列中aveATlACPl基因置換質(zhì)粒 pffjb7381的構(gòu)建過程。pffJb6-24-4, pWJb6_24_3，pffJb7-62, pWJb6_24_l，pffjb7381 自命名重組質(zhì) 粒；derived from pANT841 以載體 pANT841 出發(fā)構(gòu)建 derived frompGEM-5zf 以載體 pGEM-5zf 出發(fā)構(gòu)建；derived from pKC1139 以載體 pKC1139 出發(fā)構(gòu)建，derived from pAGe-1 以載體 pAGe-1 出發(fā)構(gòu)建。酶切位點(diǎn)HindIII，BglII, XbaI, XhoI0圖3 異源表達(dá)環(huán)己基甲酰輔酶A的質(zhì)粒pWJb835的構(gòu)建過程。pnPl，pnP2，pnP3，pnP4 編碼環(huán)己基甲酰輔酶A合成酶的基因；primer 7， primer8, primer 9，primer 10 :引物 7，引物 8，引物 9，引物 10 ；pffjb7981, pffjb7982, pffjb7942, pffjb7100, pffjb806, pffjb835 自命名重組質(zhì)粒；derived from pANT841 以載 體 pANT841 出發(fā)構(gòu)建；derived from pGEM_5zf :以載體 pGEM_5zf 出發(fā)構(gòu)建；derived from pSP72 以載體pSP72出發(fā)構(gòu)建，derived from pSET152 以載體pSET152出發(fā)構(gòu)建。酶切 位點(diǎn)HindIII，SpeI, BamHI, XbaI, EcoRI。PermE 紅霉素啟動(dòng)子基因。圖4 :aveATlACPl基因置換突變菌株的PCR驗(yàn)證。用引物pnLDF 5' -TTTCTCGAGCG GGTCGAGGTGATCCAG-3，和引物 pnLDR 5，-TTTAGATCTCAGTTCCTCCGCCAGCGC-3，擴(kuò)增出約 1. 2Kb 的序列，切膠回收后用pnLDF和pnLDR為引物測(cè)序驗(yàn)證。泳道1，3，7，9，10，11，12，15，18 1. 2kb區(qū)域顯示信號(hào)，泳道13 :5000bp marker (從上到下依次為5KB，3Kb, 2Kb, 1Kb, 750bp, 500bp)圖5 最終突變菌株與野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分析對(duì)比。(A)HPLC圖譜；⑶柱狀 對(duì)比圖，1代表野生型，2代表最終突變株，均在發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)添加環(huán)己基甲酸(200mg/L)。 Ave B2a 阿維菌素Bh組分，Ave Bla 阿維菌素Bla組分，Dor B2 多拉菌素B2組分，Dor 多拉菌素組分。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了五個(gè)可用于改造除蟲鏈霉菌(阿維 菌素)生產(chǎn)多拉菌素的基因，所述基因?yàn)榱椎顾鼐弁铣擅钙鹗寄K的編碼基因 pnATlACPl, pnpl, pnp2, pnp3, pnp4基因。將所述的磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的 編碼基因pnATlACPl基因在除蟲鏈霉菌基因組中替換掉催化形成阿維菌素的合成酶的 aveATlACPl，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入環(huán)己基甲酸，可大大提高多拉菌素的產(chǎn)量?；谝陨贤瓿?了本發(fā)明。所述基因來自磷氮霉素生物合成的基因簇中。如本發(fā)明所用，所用到的基因編 碼的蛋白為參與磷氮霉素生物合成過程中骨架以及前體合成的次級(jí)代謝過程，新引入的基 因不會(huì)影響除蟲鏈霉菌的生長狀態(tài)。
在本發(fā)明中，所用的“pnATlACPl”是指在磷氮霉素生物合成過程中，編碼催化磷氮 霉素骨架合成過程中負(fù)責(zé)選擇起始單元的選擇的?；D(zhuǎn)移酶和?；d體蛋白的基因。其 控制了磷氮霉素生物合成過程中所利用到的起始單元，并且本發(fā)明就是將該基因替換掉除 蟲鏈霉菌中阿維菌素生物合成過程中編碼負(fù)責(zé)阿維菌素起始單元選擇的模塊基因，經(jīng)替換 后，不影響除蟲鏈霉菌的生長狀態(tài)。在本發(fā)明中，所用的磷氮霉素基因簇中合成環(huán)己基甲酰輔酶A生物合成的基因 "pnl, pn2, pn3, pn4”是指在磷氮霉素生物合成過程中，編碼催化形成起始單元環(huán)己基甲酰 輔酶A的酶的基因，本發(fā)明將這四個(gè)基因按照從pnl-pn4的順序，在起始區(qū)域加一個(gè)紅霉素 啟動(dòng)子后，構(gòu)建到整合型載體PSET152后，導(dǎo)入到替換過的除蟲鏈霉菌替換過的突變株中， 形成最終的突變株，該途徑的引入不會(huì)影響除蟲鏈霉菌的生長狀態(tài)。在本發(fā)明中，“除蟲鏈霉菌”(Mi^ptomyces avermitilis)是一種能夠產(chǎn)生阿維菌 素(avermectins AVM)的菌，并且經(jīng)過改造只產(chǎn)阿維菌素B組分。在本發(fā)明中，大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體是指一類能由大腸桿菌轉(zhuǎn)到鏈霉菌中的 質(zhì)粒，包括(但是不限于)PKC1139，pSET152。在本發(fā)明中，“基因轉(zhuǎn)移”是指將外源的遺傳物質(zhì)由供體菌導(dǎo)入到受體菌內(nèi)的過 程，其可以通過轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合等手段來實(shí)現(xiàn)?！敖雍限D(zhuǎn)移”是指細(xì)菌通過性 菌毛相互連接溝通，將遺傳物質(zhì)(主要是質(zhì)粒DNA)從供體菌轉(zhuǎn)移給受體菌。本發(fā)明用于替換的磷氮霉素生物合成酶起始模塊基因pnATlACPl如核苷酸序列 表序列1所示；本發(fā)明用于異源表達(dá)的磷氮霉素基因簇中合成環(huán)己基甲酰輔酶A生物合成的基 因pnl-pn4如核苷酸序列表序列2所示。本發(fā)明提供的替換質(zhì)粒的構(gòu)建方法，系由載體和在多克隆位點(diǎn)上加入需要替換的 目的基因旁側(cè)序列和用于替換的基因序列組成，載體為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可以 為pKC1139、p0J260、pWHM3等及其類似的載體。本發(fā)明提供的異源表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，系由載體在多克隆位點(diǎn)加入需要異源表 達(dá)的目的基因和紅霉素啟動(dòng)子基因序列組成，在題為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可以為 PSET152等其類似的載體。進(jìn)一步的描述如下本發(fā)明的基因能夠增強(qiáng)多拉菌素的生物合成，當(dāng)將該類基因引入到除蟲鏈霉菌中 后(替換阿維菌素生物合成起始模塊和直接導(dǎo)入編碼環(huán)己基甲酰輔酶A生物合成酶基因)， 可以提高多拉菌素的產(chǎn)量。并且本發(fā)明人選擇了合適的接合轉(zhuǎn)移載體，即帶有溫敏型復(fù)制 子的質(zhì)粒PKC1139，利用同源重組技術(shù)，得到了穩(wěn)定的基因替換突變株，再通過利用穩(wěn)定的 整合型載體PSET152導(dǎo)入環(huán)己基甲酰輔酶A的生物合成途徑，得到穩(wěn)定的最終突變株。在檢測(cè)阿維菌素產(chǎn)量時(shí)，可通過測(cè)量出發(fā)菌株和改良菌株產(chǎn)生的有效組分 Bla(avemectin Bla)的含量為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)多拉菌素的產(chǎn)生以及產(chǎn)量是否提高。本發(fā)明中所用于實(shí)施例或其他內(nèi)容所顯示的成分用量、反應(yīng)條件等數(shù)字均為大約 數(shù)值。因此除非文中特別注明，本說明書的上述數(shù)字參數(shù)均為近似值，其可根據(jù)所需得到的 本發(fā)明的結(jié)果而加以變化。除特別說明外。文中所用到的專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或者均等的方法及材料均可應(yīng)用于本發(fā)明的方法之中。實(shí) 驗(yàn)中未注明的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件或者按照制造廠商所建 議的條件。本發(fā)明的主要特點(diǎn)在于1.發(fā)現(xiàn)了兩種應(yīng)用于改造除蟲鏈霉產(chǎn)生多拉菌素的基因。2.發(fā)現(xiàn)將阿維菌素生物合成起始模塊基因替換為磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊 的編碼基因PnATlACPl基因可以大大改善除蟲鏈霉菌的多拉菌素的產(chǎn)量。3.發(fā)現(xiàn)將環(huán)己基甲酰輔酶A生物合成酶基因?qū)氲教鎿Q突變株中可以進(jìn)一步提 高多拉菌素的產(chǎn)量4.發(fā)現(xiàn)在突變株發(fā)酵時(shí)往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入環(huán)己基甲酸，可以抑制阿維菌素組分 的產(chǎn)生，改善組分的數(shù)量。5.本發(fā)明采用接合轉(zhuǎn)移的手段將替換質(zhì)粒以及異源表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到受體菌中，誘 導(dǎo)發(fā)生雙交換，得到了穩(wěn)定的基因型突變株。下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，所用實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中所用培養(yǎng)基，除特殊說明外，液體均用YEME培養(yǎng)基，固體均用MS培養(yǎng)基。實(shí)施例一替換aveAT IACPl基因1 左右交換同源臂的獲得以 Sti^ptomyces avermitilis 的基因組為模板，采用引物 5，-TTTAAGCTTACGCCCG GCGCGGGCTGAG-3，和引物 5，-TTTCTCGAGCCCGGGAGCGTCCGGCGAG-3，擴(kuò)增得到左臂約 2kb 的 PCR產(chǎn)物，平端連入pGEM-5zf的多克隆位點(diǎn)中的EcoRV切口中，再用引物5，-TTTAGATCTGCG GCGCTCGGCCACCTC-3，和引物 5，-TTTTCTAGAATCCCCCGCGTCCCGGCG-3，得到右臂約 2kb 的 PCR 產(chǎn)物，平端連入PANT841的多克隆位點(diǎn)MuI切口中。2 磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因pnATlACPl片段的獲得以包含有該段基因的粘粒為模板，采用引物5‘ -TTTCTCGAGCGGGTCGAGGTGATCCAG-3'和引物 5，-TTTAGATCTCAGTTCCTCCGCCAGCGC-3'擴(kuò)增得到約 1. 15Kb 的 PCR 產(chǎn)物，平端連 入pGEM-5zf的多克隆位中的EcoRV切口中。3 重組質(zhì)粒pWJb7381的獲得將左臂從載體中用核酸內(nèi)切酶HindIII和B10I切出來，將右臂用核酸內(nèi)切 酶BglII和^CbaI從構(gòu)建的質(zhì)粒中切出來，將磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因 pnATIACPl從載體中用BglII和XhoI切出，所得到的片段一起連入用HindIII和XbalI切 好的PKC1139中，具體構(gòu)建可見附圖1。4 替換aveAT IACPl基因突變株的獲得將用于替換的重組質(zhì)粒pWJb7381轉(zhuǎn)入到大腸桿菌ET12567中，通過大腸桿菌和鏈 霉菌之間的屬間接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到鏈霉菌中，37°C整合后松弛誘導(dǎo)發(fā)生雙交換， 雙交換突變株利用PCR驗(yàn)證，基因型驗(yàn)證結(jié)果見圖2，由于替換的基因片段本身與原來的基 因相差不大，因此將擴(kuò)增出的目標(biāo)帶回收后測(cè)序驗(yàn)證，得到突變株2。實(shí)施例二 導(dǎo)入環(huán)己基甲酰輔酶A的生物合成途徑
1 基因片段的獲得以包含該基因片段的粘粒為模板，用引物5 ’ -AAGCTTACCGACGCCATCGAATCG-3， 和引物5，-CCTGCTGGATCCGGACAC-3，擴(kuò)增得到pnpl的5，端約1Kb的片段，平端連入到 PANT841多克隆位點(diǎn)中的MuI切口中。用核酸內(nèi)切酶BamHI和EcoRI切上述模板粘粒， 得到一條包含了 pnpl的3’端一部分以及完整的pnp2，pnp3和pnp4的5’端一部分共 5. 482Kb的片段，將其連入到pSP72多克隆位點(diǎn)中的BamHI和EcoRI雙酶切切口中。用引物 5，-GGCGGAATTCGCCGAGAC-3，和弓丨物 5，-TCTAGACGCACGTTCTCACCCCAC-3，，以上述粘粒為模 板，擴(kuò)增得到pnp4余下的部分約800bp序列，平端連入到pGEM-5zf多克隆位點(diǎn)中的EcoRV 切口中。2 紅霉素啟動(dòng)子基因序列的獲得用核酸內(nèi)切酶HindIII和EcoRI切含有紅霉素啟動(dòng)子的質(zhì)粒pLL6214，得到約 500bp的紅霉素啟動(dòng)子序列3 異源表達(dá)質(zhì)粒pWJb835的構(gòu)建將pnpl的5’端用HindIII和BamHI切出來，包含有pnpl余下部分，pnp2，pnp3 以及pnp4的5 ‘端一部分的片段用BamHI和EcoRI切出來，三片段連入到載體pGEM-3zf的 多克隆位點(diǎn)中的HindIII和EcoRI雙酶切切口中，再將連好的這個(gè)片段(包含完整的pnpl， pnp2, pnp3以及pnp4的5’端的片段)用HindIII和EcoRI切出來得到約6. 5Kb片段，將 pnp4的3’端從克隆載體中用)(bal和EcoRI切出來，將這兩個(gè)片段連入到pGEM_3zf的多 克隆位點(diǎn)中的HindIII和^CbaI雙酶切切口中。再將這個(gè)質(zhì)粒用HindIII和)(baI切出來得 到約7. 3Kb (包含完整的pnpl-pnp4)的片段，連同紅霉素啟動(dòng)子基因序列(用HindIII和 EcoRI切出)，連入到pSET152多克隆位點(diǎn)中的)(bal和EcoRI雙酶切切口中，得到最終重組 質(zhì)粒 pWJb8;35。4 最終突變株的獲得將用于異源表達(dá)的重組質(zhì)粒pWJb835轉(zhuǎn)入到大腸桿菌ET12567中，通過大腸桿菌 和鏈霉菌之間的屬間接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到鏈霉菌突變株2中，得到帶有阿布拉抗性 的突變株，這就是最終突變株。3 突變株和原始出發(fā)菌株產(chǎn)多拉菌素效價(jià)比測(cè)定在相同發(fā)酵條件下對(duì)比出發(fā)菌株和突變后的菌株產(chǎn)多拉菌素Bla的量分析。將保存好的孢子解凍后，涂于平板培養(yǎng)基上，平板培養(yǎng)基配方為葡萄糖(國藥集 團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)1. 5%、天門冬酰氨(華美生物工程公司)0. 05%、進(jìn)口牛肉浸膏(中 國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司)0.3%、磷酸二氫鉀(天津市化學(xué)試劑六廠)0. 05%、瓊 脂1. 8%。30°C培養(yǎng)五天后，用打孔器取一小塊放到種瓶?jī)?nèi)。種子培養(yǎng)基配方為玉米淀粉3%、豆粕粉0.8%、花生餅粉1%、酵母浸提物 0.4%、氯化鈷(中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司，的溶液)0.3%、淀粉酶4y/g淀 粉。配制時(shí)先將玉米淀粉糊化(玉米淀粉用少量水溶解，加入淀粉酶，攪拌均勻，倒入 約1/2總量的沸水中，煮沸)，加入其他原料(也用冷水調(diào)勻)，定容后調(diào)pH值6. 8 7，分 裝40ml/250ml三角瓶，121°C滅菌25min。28°C，200rpm培養(yǎng)兩天后，吸取1. 5ml到搖瓶中。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米淀粉14%、豆粕粉2.8%、酵母粉1 %、鉬酸鈉
12(1% )2. 2%。、硫酸錳(0. 1% )2. 3%。、硫酸銨(5% )5%。、氯化鈷(1% )2%。。配制時(shí)先將玉米淀粉用冷水溶解調(diào)勻，加入淀粉酶(1. 5 2單位沒克淀粉)，水 浴加熱，變稀后計(jì)時(shí)保溫12min (在升溫過程中，料液會(huì)由乳白色變?yōu)榘胪该鳚{糊狀，此時(shí) 開始計(jì)時(shí))，取出，加入其它原料(先用冷水調(diào)勻)，加入環(huán)己基甲酸O00mg/L)，定容，調(diào) PH至7. 5，然后加入碳酸鈣0. 8%。，攪拌均勻，邊攪拌邊分裝30ml/250ml三角瓶，121°C滅菌 25min。搖瓶在，200rpm的條件下培養(yǎng)十天，取Iml菌液，加^il甲醇，超聲lOmin，離 心取上清，HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件為檢測(cè)波長UV = 245nm ；柱子VARIAN 250/4.6SN 282566MICR0S0RB-MV 100-5C18R008620005 ；流動(dòng)相條件v = lmL/min ；A 溶液=H2O ；B 溶 液=CH3OH ；洗脫條件為85% B, 15% A，洗脫時(shí)間為20min。分析HPLC結(jié)果可以看出，原始出發(fā)菌株多拉菌素的產(chǎn)量約為15ug/ml，突變株的 產(chǎn)量為60ug/ml，增產(chǎn)為300%。具體的HPLC圖譜以及產(chǎn)量對(duì)比柱形圖見附圖5。
權(quán)利要求
1.一種改造除蟲鏈霉菌產(chǎn)生多拉菌素的方法，其特征在于利用磷氮霉素聚酮合成酶起 始模塊的編碼基因PnATlACPl置換阿維菌素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因aveATlACPl， 同時(shí)將磷氮霉素基因簇中合成環(huán)己基甲酰輔酶A的生物合成基因ρηΡ1-ρηΡ4在置換突變株 中異源表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因pnATlACPl具有如下 核苷酸序列
3.如權(quán)利要求1所述的磷氮霉素基因簇中合成環(huán)己基甲酰輔酶A的生物合成基因 ρηΡ1-ρηΡ4基因具有如下核苷酸序列
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因 PnATlACPl基因置換除蟲鏈霉菌中阿維菌素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因包括如下步 驟(1)以除蟲鏈霉菌的基因組為模板，采用PCR方法獲得基因置換所須的左臂包括上游 序列及部分相應(yīng)基因序列約21Λ ；(2)以除蟲鏈霉菌的基因組為模板，采用PCR方法獲得基因置換所須的右臂包括下游 序列及部分相應(yīng)基因序列約21Λ ；(3)以包含磷氮霉素聚酮合成酶起始模塊的編碼基因pnATlACPl的粘粒為模板，采用 PCR方法獲得基因置換所須的目的基因約1. 2Kb ；(4)將得到的左右臂序列和目標(biāo)基因片段通過相應(yīng)的酶切位點(diǎn)克隆入PKC1139載體 中構(gòu)建成基因置換重組質(zhì)粒；(4)將C3)獲得的重組質(zhì)粒以接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入除蟲鏈霉菌中，經(jīng)整合、松弛培養(yǎng) 誘導(dǎo)發(fā)生雙交換及篩選鑒定后完成目標(biāo)基因替換。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將磷氮霉素基因簇中合成環(huán)己基甲酰輔酶A 的生物合成基因ρηΡ1-ρηΡ4在置換突變株中異源表達(dá)包括如下步驟(1)以包含該基因的粘粒為模板，采用PCR方法獲得基因異源表達(dá)所須的pnPl的部分 序列約Ikb ；(2)以包含該基因的粘粒為模板，采用PCR方法獲得基因異源表達(dá)所須的pnP4部分序 列約0. 8kb ；(3)以包含該基因的粘粒為模板，采用酶切方法獲得基因異源表達(dá)所須的pnPl以及 pnP4基因余下部分序列還有完整的pnP2，pnP3序列約5. 2Kb ；(4)將得到的序列和紅霉素啟動(dòng)子基因序列通過相應(yīng)的酶切位點(diǎn)克隆入PSET152載 體中構(gòu)建成基因置換重組質(zhì)粒；(5)將(4)獲得的重組質(zhì)粒以接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入阿維菌素生物合成起始模塊替換 的突變株中，經(jīng)抗性篩選鑒定后完成目標(biāo)基因異源表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用磷氮霉素生物合成基因改造阿維菌素生物合成途徑生產(chǎn)多拉菌素的技術(shù)，具體地說是一種通過對(duì)阿維菌素產(chǎn)生菌進(jìn)行改造產(chǎn)生多拉菌素的技術(shù)。對(duì)阿維菌素生物合成途徑中聚酮合成酶起始模塊進(jìn)行替換，再將合成環(huán)己基甲酰輔酶A的生物合成途徑引入可以使得除蟲鏈霉菌獲得發(fā)酵生產(chǎn)多拉菌素的能力。所述用來替換的編碼起始模塊以及編碼環(huán)己基甲酰輔酶A的生物合成酶的基因pnAT1ACP1和pnP1，pnP2，pnP3，pnP4均來自于磷氮霉素的生物合成基因簇。本發(fā)明還公開了利用上述基因構(gòu)建產(chǎn)生多拉菌素突變菌種的方法和應(yīng)用，相應(yīng)突變菌種發(fā)酵獲得的多拉菌素產(chǎn)量以及純度與未經(jīng)改造的菌株相比有大幅提高。
文檔編號(hào)C12P17/18GK102093997SQ20101056876
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者唐功利, 王健博 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所