專利名稱：一種利用海洋鏈霉菌發(fā)酵制備溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用海洋鏈霉菌發(fā)酵制備溶菌酶的方 法。
背景技術(shù)：
飼料中大量添加亞治療量的抗生素和促生長(zhǎng)劑，造成了動(dòng)物的耐藥性的產(chǎn)生。由 于這種多抗性、頑固病菌的出現(xiàn)，使傳統(tǒng)抗生素面臨重大挑戰(zhàn)。面向未來(lái)，必須開(kāi)拓全新路 徑。溶菌酶是被認(rèn)為替代抗生素的最有前途的產(chǎn)品。它是一種具有殺菌和免疫功能的無(wú)毒 蛋白質(zhì)。它可選擇性地分解微生物細(xì)胞壁的同時(shí)不破壞其他組織，且本身無(wú)毒無(wú)害，因而它 是一種天然的安全性能很好的殺菌劑、防腐劑，可廣泛應(yīng)用于飼料加工、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、畜 牧業(yè)、啤酒工業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域；可替代抗生素在飼料中應(yīng)用，具有龐大的市場(chǎng)。目前溶菌酶主要從蛋清中提取，由于來(lái)源有限，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，溶菌酶產(chǎn)量十分有 限，價(jià)格居高不下，難以滿足越來(lái)越大的市場(chǎng)需求。另一方面，溶菌酶只能破壞G+細(xì)菌的細(xì) 胞壁，而對(duì)G-細(xì)菌作用不大，原因在于G+細(xì)菌與G-細(xì)菌結(jié)構(gòu)差別和細(xì)胞壁中肽聚糖含量 不同G+細(xì)菌細(xì)胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而G-細(xì)菌內(nèi)壁層為肽聚糖，外面還有一層脂 多糖和脂蛋白保護(hù)膜，阻止了溶菌酶分子進(jìn)入內(nèi)層。殺菌譜太窄，活性較低和不能進(jìn)行大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)制約了溶菌酶應(yīng)用。因此，面向未來(lái)，必須開(kāi)拓全新路徑。海洋環(huán)境獨(dú)特，其高壓、高鹽、低營(yíng)養(yǎng)、低溫的特點(diǎn)，這種生命活動(dòng)的極端環(huán)境環(huán)境 造就了微生物種類及代謝途徑特異性，可產(chǎn)生完全不同于陸地微生物的新穎生物活性物 質(zhì)。海洋微生物將是今后獲得新的醫(yī)用、農(nóng)用抗菌素的重要資源。近年來(lái)，借助于海洋生物高新技術(shù)手段，海洋酶研究得到了快速發(fā)展而成為各國(guó) 優(yōu)先發(fā)展的新領(lǐng)域。而就酶蛋白合成的調(diào)控而言，海洋微生物生長(zhǎng)環(huán)境所起的作用是巨大 的，從"有實(shí)際或潛在用途或價(jià)值"的觀點(diǎn)看，海洋微生物是一類種類繁多的可再生的遺 傳基因庫(kù)，是獲取新型酶的重要資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供利用海洋鏈霉菌發(fā)酵制備溶菌酶的方法。海洋鏈霉菌菌株是從近海污泥中分離純化獲得的，該菌株最適生長(zhǎng)溫度為觀 300C，最適pH值為6 7，最適生長(zhǎng)NaCl濃度為3 7%。本發(fā)明方法的具體步驟為步驟(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備取保存在液氮罐中的海洋鏈霉菌菌種接種于固體培養(yǎng) 基中，在觀 30°C條件下培養(yǎng)96 120小時(shí)，選取單菌落作為種子液菌種；固體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉0. 1 0. 5%,NaCl 3 4%、MgS04,0. 01 0. 05%、 KH2PO4O 0. 5%、KNO3O 0. 2%、FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 1%、CuS040. 002 0. 01%、瓊脂 粉2 3 %，余量為人工海水；然后用NaOH或HCl將基液的pH值調(diào)至6. 5 7. 0，最后在115 121°C條件下滅菌15 20分鐘，冷卻至常溫，得到固體培養(yǎng)基。步驟( 制備海洋鏈霉菌的種子液將種子液菌種接種于置于容器中的液體培養(yǎng) 基中進(jìn)行培養(yǎng)，種子液菌種與液體培養(yǎng)基的重量比為1 3 100，容器置于轉(zhuǎn)速為140 200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中，在觀 30°C條件下培養(yǎng)36 48小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成細(xì) 菌濃度為IO8 IO9CfVL(colony forming units，指每升發(fā)酵液中含有的細(xì)菌群落總數(shù)) 的種子液；液體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉0. 1 0. 5%,NaCl 3 4%、MgS04,0. 01 0. 05%、 KH2PO4O 0. 5%、KNO3O 0. 2%、FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 1%、CuS040. 002 0. 01%、余量 為人工海水；然后用NaOH或HCl將基液的pH值調(diào)至6. 5 7. 0，最后在115 121 °C條件 下滅菌15 20分鐘得到液體培養(yǎng)基。步驟( 將種子液進(jìn)行放大發(fā)酵取上述種子液接種置于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基 中，種子液菌種與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比為1 3 100，發(fā)酵罐中攪拌器的轉(zhuǎn)速為140 200 轉(zhuǎn)/分鐘，在觀 30°C條件下培養(yǎng)60 72小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵液中的細(xì)菌濃度 為IO8 109cfu/L (colony forming units，指每升發(fā)酵液中含有的細(xì)菌群落總數(shù))。發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法與液體培養(yǎng)基的配置方法相同。步驟(4)發(fā)酵液中溶菌酶的分離純化將發(fā)酵液通過(guò)陶瓷膜微濾法除去菌體，濾 液通過(guò)超濾濃縮截流分子量10 30kDa之間的組分，去除色素、雜蛋白和無(wú)機(jī)鹽，獲得濃 縮液；將濃縮液置于kphedex G-50層析柱中，再用pH值為6. 5 7. 0、摩爾濃度為0. 1 0. 5M的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液以0. 1 0. 3ml/min的流速對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液， 冷凍干燥后獲得溶菌酶產(chǎn)品。超濾濃縮采用Millipore超濾膜。本發(fā)明方法制備的溶菌酶的理化性質(zhì)如下分子量為16800道爾頓，等電點(diǎn)為 9. 2，最適溫度為45°C，最適pH值為7，其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，pH值在2 11劇烈變化時(shí)， 結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定不變。遇熱也很穩(wěn)定，在PH值6 8，100°C處理lmin，仍保持原酶活性。在堿 性環(huán)境中對(duì)熱穩(wěn)定性較差。其一級(jí)結(jié)構(gòu)由136個(gè)氨基酸組成，維持其結(jié)構(gòu)的主要作用力為 二硫鍵、氫鍵和疏水鍵。本發(fā)明方法制備的溶菌酶具有安全、廣譜、高效等特性。在飼料加工、醫(yī)學(xué)、食品工 業(yè)、畜牧業(yè)、啤酒工業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。該產(chǎn)自鏈霉菌的溶菌酶具有高活 性(酶活比目前市售的蛋清溶菌高10倍)和比蛋清溶菌酶更寬的抑菌譜(能殺滅蛋清溶 菌酶不能殺滅的大腸桿菌(Escherichia coli)、傷寒沙門氏菌(Salmonella)等革蘭氏陰 性菌等革蘭氏陰性菌)的特點(diǎn)。本發(fā)明方法用陶瓷膜微濾串連切向超濾濃縮工藝，將分離和濃縮同步進(jìn)行，顯著 縮短了濃縮時(shí)間和生產(chǎn)周期，降低了能耗和生產(chǎn)成本，提高了酶比活與產(chǎn)出效益，具有傳統(tǒng) 工藝無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式從近海污泥中分離純化獲得海洋鏈霉菌菌株，該菌株最適生長(zhǎng)溫度為觀 30°C， 最適PH值為6 7，最適生長(zhǎng)NaCl濃度為3 7%。利用該鏈霉菌菌株發(fā)酵制備溶菌酶。實(shí)施例1
步驟(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備取保存在液氮罐中的海洋鏈霉菌菌種接種于固體培養(yǎng) 基中，在條件下恒溫培養(yǎng)120小時(shí)，選取單菌落作為種子液菌種。固體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (MM)2SO4I %、甘油 2%、酵母粉 0.5%、NaC14 %、MgSO4,0. 02 KNO3O. 2%, FeSO4. 7H20 0. 05%,CuS040. 008%、瓊脂粉2%，余量為人工海水；然后用NaOH將基液的pH值調(diào)至7. 0， 最后在121°C條件下滅菌15分鐘，冷卻至常溫，得到固體培養(yǎng)基。步驟( 制備海洋鏈霉菌的種子液將種子液菌種接種于置于容器中的液體培養(yǎng) 基中進(jìn)行培養(yǎng)，種子液菌種與液體培養(yǎng)基的重量比為1 100，容器置于轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分 鐘的搖床中，在條件下恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成細(xì)菌濃度為IO8Cfu/ L的種子液。液體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (MM)2SO4I %、甘油 2%、酵母粉 0.5%、NaC14 %、MgSO4,0. 02 KNO3O. 2%, FeSO4. 7H20 0. 05%, CuS040. 008%，余量為人工海水；然后用NaOH將基液的pH值調(diào)至7.0，最后在 115°C條件下滅菌20分鐘得到液體培養(yǎng)基。步驟( 將種子液進(jìn)行放大發(fā)酵取上述種子液接種置于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基 中，種子液菌種與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比為3 100，發(fā)酵罐中攪拌器的轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘， 在30°C條件下恒溫培養(yǎng)60小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵液中的細(xì)菌濃度為1. 5 X IO8Cfu/ L。發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法與液體培養(yǎng)基的配置方法相同。步驟(4)發(fā)酵液中溶菌酶的分離純化將發(fā)酵液通過(guò)陶瓷膜微濾法除去菌體， 濾液通過(guò)超濾濃縮截流分子量10 30kDa之間的組分，去除色素、雜蛋白和無(wú)機(jī)鹽，獲得 濃縮液；將濃縮液置于kphedex G-50層析柱中，再用pH值為6. 5、摩爾濃度為0. IM的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液以0. lml/min的流速對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后獲 得溶菌酶產(chǎn)品。超濾濃縮采用Mi 11 ipore超濾膜。實(shí)施例2步驟(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備取保存在液氮罐中的海洋鏈霉菌菌種接種于固體培養(yǎng) 基中，在30°C條件下恒溫培養(yǎng)96小時(shí)，選取單菌落作為種子液菌種；固體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (NH4)2S042%、甘油 3%、酵母粉 0.1%, NaCl 3%, MgSO4 0. 01%, KH2PO4O. 3%, FeSO4.7H20 0. 01%,CuS040. 01 %、瓊脂粉3%，余量為人工海水；然后用HCl將基液的pH值調(diào)至6. 5，最 后在115°C條件下滅菌20分鐘，冷卻至常溫，得到固體培養(yǎng)基。步驟( 制備海洋鏈霉菌的種子液將種子液菌種接種于置于容器中的液體培養(yǎng) 基中進(jìn)行培養(yǎng)，種子液菌種與液體培養(yǎng)基的重量比為3 100，容器置于轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分 鐘的搖床中，在30°C條件下恒溫培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成細(xì)菌濃度為IO9Cfu/ L的種子液。液體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (NH4)2S042%、甘油 3%、酵母粉 0.1%, NaCl 3%, MgSO4jO. 01%, KH2PO4O. 3%, FeSO4. 7H20 0. 01%,CuS040. 01 %、瓊脂粉3%，余量為人工海水；然后用HCl將基液的pH值調(diào)至6. 5，最 后在121°C條件下滅菌15分鐘得到液體培養(yǎng)基。步驟( 將種子液進(jìn)行放大發(fā)酵取上述種子液接種置于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子液菌種與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比為1 100，發(fā)酵罐中攪拌器的轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分鐘， 在條件下恒溫培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵液中的細(xì)菌濃度為108cfu/L。發(fā) 酵培養(yǎng)基的配置方法與液體培養(yǎng)基的配置方法相同。步驟(4)發(fā)酵液中溶菌酶的分離純化將發(fā)酵液通過(guò)陶瓷膜微濾法除去菌體， 濾液通過(guò)超濾濃縮截流分子量10 30kDa之間的組分，去除色素、雜蛋白和無(wú)機(jī)鹽，獲得 濃縮液；將濃縮液置于kphedex G-50層析柱中，再用pH值為7. 0、摩爾濃度為0. 3M的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液以0. 2ml/min的流速對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后獲 得溶菌酶產(chǎn)品。超濾濃縮采用Mi 11 ipore超濾膜。實(shí)施例3步驟(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備取保存在液氮罐中的海洋鏈霉菌菌種接種于固體培養(yǎng) 基中，在^rc條件下恒溫培養(yǎng)loo小時(shí)，選取單菌落作為種子液菌種；固體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (MM)2SO4L 5%、甘油 4%、酵母粉 0. 3%、NaCl 3. 5 MgSO4jO. 05 KH2PO4O. 5 KNO3O. 1%, FeSO4. 7H20 0.1%, CuS040. 002%、瓊脂粉 2. 5%，余量為人工海水；然后用 HCl 將基液的PH值調(diào)至6. 8，最后在118°C條件下滅菌18分鐘，冷卻至常溫，得到固體培養(yǎng)基。步驟( 制備海洋鏈霉菌的種子液將種子液菌種接種于置于容器中的液體培 養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，種子液菌種與液體培養(yǎng)基的重量比為1 50，容器置于轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn) /分鐘的搖床中，在^TC條件下恒溫培養(yǎng)40小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成細(xì)菌濃度為 1. 5XlO8CfVL的種子液。液體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為 (MM)2SO4L 5%、甘油 4%、酵母粉 0. 3%、NaCl 3. 5 MgSO4jO. 05 KH2PO4O. 5 KNO3O. 1%, FeSO4. 7H20 0.1%, CuS040. 002%、瓊脂粉 2. 5%，余量為人工海水；然后用 HCl 將基液的PH值調(diào)至6. 8，最后在118°C條件下滅菌18分鐘得到液體培養(yǎng)基。步驟( 將種子液進(jìn)行放大發(fā)酵取上述種子液接種置于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基 中，種子液菌種與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比為1 50，發(fā)酵罐中攪拌器的轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘， 在^TC條件下恒溫培養(yǎng)66小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵液中的細(xì)菌濃度為109cfu/L。發(fā) 酵培養(yǎng)基的配置方法與液體培養(yǎng)基的配置方法相同。步驟(4)發(fā)酵液中溶菌酶的分離純化將發(fā)酵液通過(guò)陶瓷膜微濾法除去菌體， 濾液通過(guò)超濾濃縮截流分子量10 30kDa之間的組分，去除色素、雜蛋白和無(wú)機(jī)鹽，獲得 濃縮液；將濃縮液置于kphedex G-50層析柱中，再用pH值為6. 8、摩爾濃度為0. 5M的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液以0. 3ml/min的流速對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后獲 得溶菌酶產(chǎn)品。超濾濃縮采用Mi 11 ipore超濾膜。本發(fā)明方法制備的溶菌酶與現(xiàn)有相關(guān)產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)性能比較如下表
權(quán)利要求
1. 一種利用海洋鏈霉菌發(fā)酵制備溶菌酶的方法，其特征在于該方法具體步驟為 步驟(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備取保存在液氮罐中的海洋鏈霉菌菌種接種于固體培養(yǎng)基 中，在觀 30°C條件下培養(yǎng)96 120小時(shí)，選取單菌落作為種子液菌種；固體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為(MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉 0. 1 0. 5%、NaCl 3 4%、MgSO4,0. 01 0. 05%, KH2PO4O 0. 5%,KNO3O 0. 2%,FeSO4. 7H20 0. 01 0. 1%,CuS040. 002 0. 01%、瓊脂粉 2 3%， 余量為人工海水；然后用NaOH或HCl將基液的pH值調(diào)至6. 5 7. 0，最后在115 121°C 條件下滅菌15 20分鐘，冷卻至常溫，得到固體培養(yǎng)基；步驟( 制備海洋鏈霉菌的種子液將種子液菌種接種于置于容器中的液體培養(yǎng)基中 進(jìn)行培養(yǎng)，種子液菌種與液體培養(yǎng)基的重量比為1 3 100，容器置于轉(zhuǎn)速為140 200 轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中，在觀 30°C條件下培養(yǎng)36 48小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成細(xì)菌濃 度為IO8 IO9CfVL的種子液；液體培養(yǎng)基的配置方法是首先配置基液，基液中各組分的重量含量為(MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉 0. 1 0. 5%、NaCl 3 4%、MgSO4,0. 01 0. 05%, KH2PO4O 0. 5%,KNO3O 0. 2%,FeSO4. 7H20 0. 01 0. 1%,CuS040. 002 0. 01%、余量為人工海水； 然后用NaOH或HCl將基液的pH值調(diào)至6. 5 7. 0，最后在115 121°C條件下滅菌15 20分鐘得到液體培養(yǎng)基；步驟C3)將種子液進(jìn)行放大發(fā)酵取上述種子液接種置于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 種子液菌種與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比為1 3 100，發(fā)酵罐中攪拌器的轉(zhuǎn)速為140 200轉(zhuǎn) /分鐘，在觀 30°C條件下培養(yǎng)60 72小時(shí)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵液中的細(xì)菌濃度為 IO8 109cfu/L ；發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法與液體培養(yǎng)基的配置方法相同；步驟(4)發(fā)酵液中溶菌酶的分離純化將發(fā)酵液通過(guò)陶瓷膜微濾法除去菌體，濾液通 過(guò)超濾濃縮截流分子量10 30kDa之間的組分，去除色素、雜蛋白和無(wú)機(jī)鹽，獲得濃縮液； 將濃縮液置于kphedex G-50層析柱中，再用pH值為6. 5 7. 0、摩爾濃度為0. 1 0. 5M 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液以0. 1 0. 3ml/min的流速對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，冷凍 干燥后獲得溶菌酶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用海洋鏈霉菌發(fā)酵制備溶菌酶的方法。目前溶菌酶主要從蛋清中提取，產(chǎn)量有限。本發(fā)明方法首先將海洋鏈霉菌菌種接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，將種子液菌種接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制成種子液；然后將種子液進(jìn)行放大發(fā)酵獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液通過(guò)陶瓷膜微濾法除去菌體，濾液通過(guò)超濾濃縮截流分子量10～30kDa之間的組分，獲得濃縮液，將濃縮液層析純化并進(jìn)行洗脫，洗脫液冷凍干燥后獲得溶菌酶產(chǎn)品。本發(fā)明方法制備的溶菌酶具有安全、廣譜、高效等特性。在飼料加工、食品工業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明方法顯著縮短了濃縮時(shí)間和生產(chǎn)周期，降低了能耗和生產(chǎn)成本，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102102095SQ20101056892
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者王首鋒, 趙小立 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)