專利名稱：植物抗氧化相關(guān)蛋白SsOEP8及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種植物抗氧化相關(guān)蛋白&0EP8及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽堿、干旱、極端溫度等非生物脅迫是嚴(yán)重影響植物生長和發(fā)育造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素。這些脅迫會引發(fā)細(xì)胞內(nèi)超氧化物(R0Q的大量積累從而給植物帶來次級氧化脅迫。在正常情況下，一定濃度的ROS對于植物的生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物及非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)等過程有重要的調(diào)控作用。然而在植物受到外界脅迫后，ROS的過量積累會導(dǎo)致脂膜的氧化、DNA及蛋白質(zhì)的氧化、酶活性的抑制和引發(fā)細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)等(Mittler R(2002)Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science 7:405-410)。因此，控制細(xì)胞體內(nèi) ROS 的含量使之保持在正常水平對于植物的生長發(fā)育具有重大意義。雖然植物耐逆的分子生物學(xué)研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，但已有研究結(jié)果大多是以擬南芥等非鹽生植物為實(shí)驗(yàn)材料，而這些植物中可能不存在那些決定高度耐逆性的關(guān)鍵基因，故不足以用于全面解析植物耐逆的分子機(jī)理。堿蓬(Suaeda salsa)是一種具有高度耐鹽堿能力的真鹽生植物，是研究植物耐逆機(jī)理的模式植物，主要分布在我國北部和沿海地區(qū)的鹽堿地、荒漠、海濱、湖邊等處，是我國最重要的鹽生植物之一。由于堿蓬具有高度的耐逆能力和改良土質(zhì)的能力，其耐逆機(jī)制的研究逐漸受到人們的重視。在分子水平上，抗氧化相關(guān)基因的研究是探索堿蓬耐逆機(jī)理的研究重點(diǎn)之一。趙鳳云等(Zhao FY, Wang XY, Zhao YX, and Zhang H(2006)[Transferring the Suaedasalsa glutathione S-transferase and catalase genes enhances low temperaturestress resistance in transgenic rice seedlings]. Zhi wu sheng Ii yu fen zi shengwu xue xue bao = Journal of plant physiology and molecular biology 32,231-238.)
碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的單基因以及編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和過氧化氫酶(GST+CAT1)的雙基因分別轉(zhuǎn)入低溫敏感水稻品種“中花11號”中，發(fā)現(xiàn)GST和GST+CAT1的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因水稻對低溫脅迫的抗性。發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室利用酵母體系從堿蓬cDNA文庫中篩選出多個(gè)耐逆相關(guān)基因，其中SsTYPAI的表達(dá)受氧化脅迫的誘導(dǎo)，其過量表達(dá)能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗氧化能力(Wang F，Zhong NQ, Gao P，Wang GL, Wang HY, Xia GX(2008)SsTypAl, a chloroplast-specific TypA/BipA-type GTPase from the halophytic plant Suaedasalsa, plays a role in oxidative stress tolerance. Plant Cell and Environment31 :982-994)。另外，堿蓬中還含有一些高效的非酶類抗氧化物質(zhì)，如甜菜紅素。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜紅素的表達(dá)受各種非生物脅迫的誘導(dǎo)，在堿蓬中耐逆過程中起重要作用(Wang CQ, Zhao JQ, Chen Μ, and Wang BS (2006) Identification of betacyanin andeffects of environmental factors on its accumulation in halophyte Suaeda salsa. Zhi wu sheng Ii yu fen zi sheng wu xue xue bao = Journal of plantphysiologyand molecular biology 32，195-201.)。這些研究結(jié)果說明，堿蓬很可能通過高效的抗氧化體系抵御其生長環(huán)境中的高鹽、強(qiáng)堿、強(qiáng)光照和干旱等多種逆境的脅迫。葉綠體外被膜蛋白(outer envelope protein，0EP)是一類分布在葉綠體外被膜上的蛋白。其重要功能是調(diào)控葉綠體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、溶質(zhì)的擴(kuò)散和膜脂的代謝 (Inoue K(2007)The chloroplast outer envelope membrane :The edge of light andexcitement. Journal of Integrative Plant Biology 49:1100—1111)。 最近 的研究表明，葉綠體外被膜蛋白還在質(zhì)體的分裂(Miyagishima SY, Froehlich JE, OsteryoungKff(2006)PDVl and PDV2 mediate recruitment of the dynamin-related protein ARC5to the plastid division site. Plant Cell 18 :2517-2530)、葉綠體的位移(OikawaK, Kasahara Μ, Kiyosue Τ, Kagawa Τ, Suetsugu N, Takahashi F, Kanegae Τ, NiwaY, Kadota A, Wada M(2003)Chloroplast unusual positioningl is essential forproper chloroplast positioning. Plant Cell 15:2805-2815)以及植物抗低溫脅迫 (Fourrier N,Bedard J,Lopez-Juez Ε,Barbrook A,Bowyer J,Jarvis P,WarrenG,Thorlby G(2008)A role for SENSITIVE TO FREEZING2 in protecting chloroplastsagainst freeze—induced damage in Arabidopsis. Plant J 55 :734-745)白勺過禾呈中起關(guān)鍵作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物抗氧化相關(guān)蛋白&0EP8及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，是新的葉綠體外被膜蛋白，獲自鹽地堿蓬(Suaeda salsa)，命名為Ss0EP8，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物抗氧化相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的&0EP8便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc—my c10EQKLISEEDL上述(b)中的&0EP8可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述(b)中的&0EP8的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和 /或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下(1)或(2)或(3)或⑷或(5)所述的DNA分子(1)序列表中序列2自5，末端第93至320位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表中序列2自5，末端第93至323位核苷酸所示的DNA分子；
(3)序列表中序列2所示的DNA分子；(4)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗氧化相關(guān)蛋白的DNA 分子；(5)與⑴限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼植物抗氧化相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG 起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組載體具體可為將所述基因插入載體pPZP-GFP的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒(重組表達(dá)載體)。擴(kuò)增所述基因的全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述基因?qū)肽康闹参镏校玫娇寡趸芰Ω哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述目的植物既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物， 如擬南芥。所述抗氧化能力可表現(xiàn)為如下(I)、(II)、(III)和(IV)中的至少一種(I)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的根的伸長量高于所述目的植物；(II)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的鮮重高于所述目的植物；(III)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量高于所述目的植物；(IV)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的H2A增加量低于所述目的植物。所述氧化脅迫具體可為甲基紫晶(MV)引起的氧化脅迫。利用基因特異性探針進(jìn)行Real-time PCR分析，發(fā)現(xiàn)&0EP8基因特異地受到強(qiáng)氧化劑甲基紫晶(methyl viologen)和過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)，而不受NaCl、LiCl、甘露醇的誘導(dǎo)，表明該基因可能在植物抗氧化脅迫過程中起重要作用。轉(zhuǎn)入擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)并用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，融合蛋白定位于葉肉細(xì)胞的葉綠體被膜上。過量表達(dá) &0EP8可以顯著提高煙草BY-2細(xì)胞和擬南芥的抗氧化能力。氧化脅迫后，轉(zhuǎn)基因植株在根的伸長、植株鮮重和葉綠素含量等方面均明顯高于野生型，同時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中的H2A 含量明顯減少。葉綠體在受到外界脅迫的情況下會發(fā)生位置的改變從而通過影響光的吸收調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生(Wada M, Kagawa T, Sato Y(2003) Chloroplast movement. Annual Review of Plant Biology 54 :455-468)。為了進(jìn)一步研的作用機(jī)理，對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉肉細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的葉綠體發(fā)生了明顯的聚集， 其聚集程度與&0EP8的表達(dá)量成正相關(guān)。Real-time PCR分析結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植物中， 幾個(gè)調(diào)控葉綠體位移的重要基因CHUP1、PHOTl和PH0T2的表達(dá)都受到了抑制，此外幾個(gè)氧化脅迫相關(guān)基因，如1^(13和POX的表達(dá)量都有所提高。這些結(jié)果說明，SsOEPS有可能通過影響葉綠體的位移，降低植物在脅迫狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生，從而提高植株的抗氧化能力。SsOEPS是一個(gè)氧化脅迫相關(guān)蛋白，通過調(diào)控葉綠體的位移控制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而在植物抗氧化脅迫過程中起重要作用。該基因可能作為一種新型目的基因，應(yīng)用于作物抗逆基因工程。本發(fā)明不僅為研究&0EP8在植物抗氧化脅迫過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，而且可能為利用基因工程方法提高作物耐逆能力從而增加土地利用率提供一種新的目標(biāo)基因。


圖1為&0EP8基因氧化脅迫應(yīng)答分析；縱坐標(biāo)表示誘導(dǎo)后的表達(dá)量和誘導(dǎo)前的表達(dá)量的比值(誘導(dǎo)后/誘導(dǎo)前，單位為“倍數(shù)”)；橫坐標(biāo)表示兩種處理的取樣時(shí)間(單位為 “小時(shí)”)；該結(jié)果為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖2為野生型和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞抗氧化能力的檢測；(a) SsOEPS-GFP的表達(dá)水平分析； (b)野生型和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中的抗氧化能力分析；(c)野生型和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在固體培養(yǎng)基中的抗氧化能力分析。圖3為野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥抗氧化能力的檢測；(a)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥氧化脅迫后的表形分析；(b) SsOEPS-GFP的表達(dá)水平分析；(c)根的伸長量；(d)植株鮮重； (e)葉綠素含量；(DH2O2染色分析。圖4為野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉肉細(xì)胞的顯微鏡觀察。圖5為葉綠體位移和氧化脅迫相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析。圖6為Ss0EP8_GFP在葉肉細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位；分別用20 X (a，b，c)、63X (d，e， f)、100X (g，h，i)的物鏡觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片；(a, d，g)為SsOEPS-GFP綠色熒光；(b， e，h)為葉綠素自發(fā)熒光；(c，f，i)為共定位。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
實(shí)施例中所用的堿蓬均為堿蓬屬鹽地堿蓬(Suaeda salsa)；參考文獻(xiàn)Wang B, Luttge U, Ratajczak R(2001)Effects of salt treatment and osmotic stress onV-ATPase and V-PPase in leaves of the halophyte Suaeda salsa. J Exp Bot 52 2355-2365。煙草BY-2 細(xì)胞；參考文獻(xiàn):Nakayama H, Yoshida K, Ono H, Murooka Y, ShinmyoA (2000)Ectoine, the compatible solute of Halomonas elongata, confershyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells.Plant Physiology 122 1239-1247。載體pPZP-GFP ；參考文獻(xiàn)Hajdukiewicz P, Svab Ζ, Maliga P (1994) The Small, Versatile Ppzp Family of Agrobacterium Binary Vectors for Plant Transformation. Plant Molecular Biology 25 :989_994。甲基紫晶(MV) :sigma-aldrich，貨號 856177。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Columbia ecotype Arabidopsis thaliana, col—Ο)購自英國 Nottingham. Arabidopsis Stock Centre。實(shí)施例1、植物耐逆相關(guān)蛋白&0EP8及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)利用酵母體系從鹽地堿蓬(Suaeda salsa)中篩選出一個(gè)8. 4kDa的耐逆性相關(guān)蛋白，如序列表的序列1所示，其編碼基因如序列表的序列2所示。將序列1所示的蛋白質(zhì)命名為&0EP8蛋白，由76個(gè)氨基酸殘基組成。將&0EP8 蛋白的編碼基因命名基因，其開放閱讀框如序列表的序列2自5’末端第93至 323位核苷酸所示。實(shí)施例2、Ss0EP8基因的表達(dá)分析五周大的鹽地堿蓬(Suaeda salsa)小苗用20mM過氧化氫(H2O2)處理0、4、8、16、 24小時(shí)；五周大的鹽地堿蓬(Suaeda salsa)小苗用20μΜ甲基紫晶(MV)處理0、4、8、16小時(shí)；分別提取總RNA進(jìn)行&0ΕΡ8基因表達(dá)量分析。Real-Time PCR反應(yīng)使用Τ0Υ0Β0公司的RealTime PCR Master Mix試劑盒，并按照說明進(jìn)行操作。堿蓬A(yù)ctin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)。結(jié)果見圖1。&0EP8基因特異地受到甲基紫晶和過氧化氫誘導(dǎo)，表明該基因可能在植物抗氧化脅迫過程中起重要作用。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定NT培養(yǎng)基(ρΗ5· 8)每升培養(yǎng)基中含MS鹽4. 3g，KH2PO4 200mg,維生素 Bl(Thiamin)Img,肌醇(inositol) lOOmg，2，4_D 0.2mg，甘氨酸(Glycine) 2mg，蔗糖 30g。NT篩選培養(yǎng)基NT培養(yǎng)基+卡那霉素(Km) 100mg/l+羧芐青霉素(Crb) 200mg/l。一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建USs0EP8基因的克隆提取鹽地堿蓬(Suaeda salsa)的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用 Primer-F和I^rimer-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收250bp左右的目的片段(序列表中序列2自5’末端第93 至320位核苷酸所示的&0EP8基因)。Primer-F :5，-CGGGATCCGAGCTCATGAAGAAAGAAGCAACA-3‘(下劃線標(biāo)注 BamHI 酶切識別位點(diǎn))；
Primer-R 5' -TCCCCGCGGCCACCTCTAGAAGAACGTTGTTGATCATC-3’ (下劃線標(biāo)注 SacII酶切識別位點(diǎn))。PCR 擴(kuò)增體系(50yl):cDNA 1 μ 1, IOXbuffer 5 μ 1，dNTP (IOmM) 1 μ 1， Primer-Fl μ 1，Primer-R 1 μ 1, Pfu DNA Polymerase (TaKaRa) 1 μ 1，Ckffl2O 40 μ 1。PCR 擴(kuò)增條件94°C 3min ；94°C 30s，50°C 30s, 72°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 10m。2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建①用限制性內(nèi)切酶BamH I和Mc II雙酶切步驟1的目的片段，回收酶切產(chǎn)物。②用限制性內(nèi)切酶BamH I和Me II雙酶切載體pPZP_GFP，回收載體骨架。③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒(骨架載體為 pPZP-GFP，在BamHI和Me II酶切位點(diǎn)之間插入了序列表中序列2自5’末端第93至 320位核苷酸所示的&0EP8基因，&0EP8基因與骨架載體上的GFP編碼基因融合，表達(dá) Ss0EP8-GFP融合蛋白)。二、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的獲得和鑒定1、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的獲得(1)將步驟一得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 (鼎國MCC(^6)，得到重組農(nóng)桿菌；將重組農(nóng)桿菌單菌落接到5ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600 = 0.8左右(36-48小時(shí))，即為重組農(nóng)桿菌菌液；(2)取IOml培養(yǎng)4_6天的煙草BY_2懸浮細(xì)胞液，轉(zhuǎn)入IOOml無菌三角瓶中；(3)離心收集菌體，用20mlLB液體培養(yǎng)基重懸，每瓶BY-2懸浮細(xì)胞液加Iml重組農(nóng)桿菌菌液，搖勻，靜置4小時(shí)，然后再加IOml新鮮的LB液體培養(yǎng)基搖床中暗培養(yǎng) 28-36小時(shí)；(4)離心收集細(xì)胞，吸出上清，再加入新鮮的NT液體培養(yǎng)基重懸，洗1次，最后挑取少許細(xì)胞至固體NT篩選培養(yǎng)基上，用液體NT培養(yǎng)基將其稀釋均勻鋪在板上，吸去多余的液體；(5)細(xì)胞避光培養(yǎng)至有抗卡那霉素團(tuán)塊出現(xiàn)，用鑷子挑取抗卡那霉素的細(xì)胞團(tuán)塊至新培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，隨機(jī)選取兩個(gè)細(xì)胞系(0EP8-2、0EP8-4)進(jìn)行抗氧化能力檢測。2、轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞系的獲得用載體pPZP-GFP轉(zhuǎn)化煙草BY-2細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞系，作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的對照，進(jìn)行抗氧化能力檢測。3、Wfestern 雜交鑒定分別提取煙草BY-2細(xì)胞(WT)、0EP8_2細(xì)胞和0EP8-4細(xì)胞的粗蛋白，進(jìn)行Wfestern 雜交鑒定。一抗為兔抗GFP(1 1000)中，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(l 5000)。結(jié)果見圖加。0EP8-2細(xì)胞和0EP8-4細(xì)胞中均有目標(biāo)蛋白(&0EP8-GFP融合蛋白)生成。4、抗氧化能力的檢測將兩個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(0EP8-2、0EP8-4)、轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞系和煙草BY_2細(xì)胞(野生型)分別進(jìn)行如下檢測取指數(shù)生長期的細(xì)胞，沉淀后用NT液體培養(yǎng)基稀釋至50%(體積百分含量)，取200微升加入10毫升含100 μ M甲基紫晶的NT液體培養(yǎng)基搖床中暗培養(yǎng)20小時(shí)；用FDA熒光染料進(jìn)行活細(xì)胞染色(Nakayama H，Yoshi da K，Ono H， Murooka Y, Shinmyo A(2000)Ectoine, the compatible solute of Halomonaselongata, confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells.PlantPhysiology 122 1239-1247)；染色后在熒光顯微鏡下觀察、照相并通過計(jì)數(shù)器計(jì)算活細(xì)胞百分比。激發(fā)波長為480nm。結(jié)果見圖2b。野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞只有很少量存活；但轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的存活率能達(dá)到70%以上。將兩個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(0EP8-2、0EP8-4)和煙草BY-2細(xì)胞(野生型，WT)分別進(jìn)行如下檢測取指數(shù)生長期的細(xì)胞，用NT液體培養(yǎng)基稀釋至50% (體積百分含量)，分別取 30 μ 1滴在含20 μ M甲基紫晶的NT固體培養(yǎng)基和NT固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2周。結(jié)果見圖2c，煙草BY-2細(xì)胞(野生型)的生長受到MV的嚴(yán)重抑制，而兩個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的細(xì)胞卻能夠正常生長。三、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定1、重組農(nóng)桿菌的獲得用步驟一得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 (鼎國MCC(^6)，得到重組農(nóng)桿菌。2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得然后利用重組農(nóng)桿菌，通過花浸泡法(Clough, S. J.，and Bent, Α. F. (1998). Floral dip :a simplified method for Agrobacterium—mediated transformation ofArabidopsis thaiiana. Plant J 16，7；35_743.)基因?qū)敫鐐惐葋喩鷳B(tài)型擬南芥，得到Tl代種子。Tl代種子收獲后在MS培養(yǎng)基(含有50mg/L卡那霉素)中篩選抗性植株，將抗性植株移栽到土中，收獲T2代種子。將T2代種子培育為植株(T2代植株)，提取葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用 Primer-F和I^rimer-R進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的植株即為T2代轉(zhuǎn)基因植株。T2代轉(zhuǎn)基因植株自交產(chǎn)生T3代種子。隨機(jī)選取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株株系(0EP8-3、 0EP8-1)的T3代種子進(jìn)行步驟4的鑒定。3、轉(zhuǎn)空載體植株的獲得用出發(fā)質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒，其它同步驟2，得到轉(zhuǎn)空載體植株的T3代種子，作為轉(zhuǎn)基因植株T3代種子的對照。4、Wfestern 雜交鑒定分別提取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株株系(0EP8-3、0EP8-1)的T3代植株和野生型擬南芥 (WT)的粗蛋白，進(jìn)行Western雜交鑒定。一抗為兔抗GFP (1 1000)中，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(l 5000)。結(jié)果見圖3b。0EP8-3、0EP8-1中均有目標(biāo)蛋白(&0EP8-GFP融合蛋白)生成。5、抗氧化能力鑒定兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株株系(0EP8-3、0EP8-1)的T3代植種子(每個(gè)株系50粒)，轉(zhuǎn)空載體植株的T3代植種子(50粒)，野生型擬南芥(WT)的種子(50粒)，分別進(jìn)行如下抗氧化能力鑒定將各個(gè)株系植株的種子同時(shí)播種在MS培養(yǎng)基平板上；萌發(fā)6天后將幼苗等分為兩組，第一組繼續(xù)在MS培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)28天，第二組轉(zhuǎn)移到含有1 μ M甲基紫晶的MS培養(yǎng)基平板上脅迫處理7天再移至MS培養(yǎng)基平板上恢復(fù)21天；觀察拍照(第二組的表型見圖3a)，測量植株的根長(見圖3c，縱坐標(biāo)指的是該株系第二組比第一組的值)、鮮重(見圖3d，縱坐標(biāo)指的是該株系第二組比第一組的值)和葉綠素含量(Chla+Chlb)(見圖3e，縱坐標(biāo)指的是該株系第二組比第一組的值)。葉綠素含量的檢測方法①取新鮮的植物葉片，擦除其表面的污物，剪碎后混勻。②稱取剪碎的新鮮樣品0. 1克，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2 :3ml 80%丙酮，研成勻漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白，靜置3分鐘。③取濾紙1張，置漏斗中，用丙酮濕潤，沿玻璃棒把提取液轉(zhuǎn)移到漏斗中，過濾到 25ml棕色容量瓶中，最后定容到25ml容量瓶中。④將葉綠素提取液轉(zhuǎn)移到比色杯中，以80%丙酮為空白，分別在波長663nm、 646nm、470nm測定其光吸收。⑤計(jì)算葉綠素含量，公式如下Chla = 12. 21D663_2. 8ID646 ；Chlb = 20. 13D646_5. 03D663。第一組中0EP8-3的葉綠色含量為6193微克/克(鮮重)，0EP8_1的葉綠色含量為5707微克/克(鮮重)，野生型擬南芥的葉綠色含量為5910微克/克(鮮重)。第二組中0EP8-3的葉綠色含量為沈44微克/克(鮮重)，0EP8-1的葉綠色含量為3065微克/ 克(鮮重)，野生型擬南芥的葉綠色含量為1085微克/克(鮮重)。第一組中0EP8-3的鮮重為0. 0367g/株，0EP8-1的鮮重為0. 0373g/株，野生型擬南芥的鮮重為0. 0395g/株。第二組中0EP8-3的鮮重為0. 0070g/株，0EP8-1的鮮重為 0. 0170g/株，野生型擬南芥的鮮重為0. 0045g/株。第一組中0EP8-3的根的伸長量為62. 5毫米，0EP8-1的根的伸長量為69毫米，野生型擬南芥的根的伸長量為68毫米。第二組中0EP8-3的根的伸長量為5. 75毫米，0EP8-1 的根的伸長量為11. 875毫米，野生型擬南芥的根的伸長量為1. 375毫米。與第一組(未脅迫處理的對照)相比，第二組轉(zhuǎn)基因植株根的伸長量、植株鮮重和葉綠素含量明顯高于野生型，野生型植株和轉(zhuǎn)空載體植株沒有顯著差異。植株的抗氧化能力與&(^ 8的表達(dá)量成正相關(guān)。這些結(jié)果表明，&0EP8的過量表達(dá)可以抑制脅迫導(dǎo)致的葉綠體中ROS的大量積累，從而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力。6、H2O2 的含量用DAB染色的方法檢測未脅迫和脅迫后的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片中H2A的含量，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株株系(0EP8-3、0EP8-1)的T3代植種子(每個(gè)株系50粒)，轉(zhuǎn)空載體植株的T3代植種子(50粒)，野生型擬南芥(WT)的種子(50粒)，分別進(jìn)行H2A的含量測定將各個(gè)株系植株的種子同時(shí)播種在MS培養(yǎng)基平板上；萌發(fā)6天后將幼苗等分為兩組， 第一組(未脅迫)繼續(xù)在MS培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過夜，第二組(脅迫后)轉(zhuǎn)移到含有10 μ M 甲基紫晶的MS培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過夜；通過DAB染色進(jìn)行H2A的含量測定。DAB染色的方法①取2周大的小苗，置于小燒杯中，用ddH20清洗3次；②再浸泡于DAB染色液(DAB lmg/ml，50mM TB緩沖液配制/pH 7. 6)中，暗處理M 小時(shí)；
③把染色后的小苗切分成根、莖和葉，用固定液甲醛和0.25%戊二醛，0. OlM 磷酸緩沖液配制)4°C固定過夜；④乙醇系列脫水后包埋于樹脂(Leica)中，用薄片切片機(jī)(Leica)切片；⑤顯微鏡觀察、照相。結(jié)果見圖3f。未脅迫處理的野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片中H2A的含量都很低，MV處理過夜后所有葉片中的H2A含量都有所增加，但是轉(zhuǎn)基因植株葉片中H2A增加的幅度比野生型葉片中的小得多，野生型植株和轉(zhuǎn)空載體植株沒有顯著差異。7、轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠體位置的變化由于植物可以通過改變?nèi)~綠體的位移調(diào)節(jié)光吸收從而控制ROS的產(chǎn)生，所以對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉肉細(xì)胞進(jìn)行了顯微鏡觀察。觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的葉綠體發(fā)生了明顯的聚集(圖4)。而且Real-time PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植物中，幾個(gè)調(diào)控葉綠體位移的重要基因CHUP1、PHOTl和PH0T2的表達(dá)都受到了抑制，此外幾個(gè)氧化脅迫相關(guān)基因，如1^(13和POX的表達(dá)量都有所提高(圖幻。這說明&0EP8的過量表達(dá)可能通過調(diào)控葉綠體在細(xì)胞中的位置從而降低ROS的含量。實(shí)施例4、Ss0EP8的亞細(xì)胞定位分析為研究&0EP8蛋白的亞細(xì)胞定位，將實(shí)施例3的步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒用農(nóng)桿菌滴花轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至擬南芥植株中，并用confocal熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。GFP的激發(fā)波長為488nm，葉綠素自發(fā)熒光的激發(fā)波長為M3nm。通過觀察轉(zhuǎn)基因植株的葉片可以看到， SsOEPS-GFP特異的定位在葉綠體膜上(見圖6)。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗氧化相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下(1)或(2)或(3)或(4)或 (5)所述的DNA分子(1)序列表中序列2自5’末端第93至320位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表中序列2自5’末端第93至323位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表中序列2所示的DNA分子；(4)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗氧化相關(guān)蛋白的DNA分子；(5)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼植物抗氧化相關(guān)蛋白的 DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求2或3所述基因插入載體pPZP-GFP的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗氧化能力高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求4或 5所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述抗氧化能力表現(xiàn)為如下(I)、(II)、 (III)和(IV)中的至少一種(I)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的根的伸長量高于所述目的植物；(II)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的鮮重高于所述目的植物；(III)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量高于所述目的植物；(IV)在氧化脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植株的H2A增加量低于所述目的植物。
10.如權(quán)利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物抗氧化相關(guān)蛋白SsOEP8及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗氧化相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。SsOEP8是一個(gè)氧化脅迫相關(guān)蛋白，通過調(diào)控葉綠體的位移控制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而在植物抗氧化脅迫過程中起重要作用。本發(fā)明不僅為研究SsOEP8在植物抗氧化脅迫過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，而且可能為利用基因工程方法提高作物耐逆能力從而增加土地利用率提供一種新的目標(biāo)基因。
文檔編號C12N1/21GK102485750SQ20101057002
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者仲乃琴, 夏桂先, 王麗麗, 王昉, 王海云 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所