專利名稱：轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取與檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)基因作物植酸酶的提取與檢測方法優(yōu) 化，具體是一種適用于轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取與檢測方法。
背景技術(shù)：
自1990年，美國孟山都公司和迪卡公司首次獲得轉(zhuǎn)基因玉米以來，轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn) 業(yè)取得了巨大的成功。2009年，全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積1. 58億公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物 種植面積的26%。2009年，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米獲得農(nóng)業(yè)部正式頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn) 應(yīng)用安全證書。植酸酶(Phytase)屬于磷酸水解酶，是將植物中的植酸及其鹽類水解為可 以利用的無機磷酸和肌醇的酶的統(tǒng)稱。植酸酶有3種類型肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶、肌 醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸鹽單酯磷酸水解酶。植酸酶的生物功能主要表現(xiàn)在(1)植酸酶能夠催化分解植酸，提高植酸磷的利 用率，減少環(huán)境磷污染；(2)消除植酸對礦物元素、蛋白質(zhì)、營養(yǎng)作用，提高植物的營養(yǎng)價值。磷是動物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)元素，磷的缺乏會影響動物生長，導(dǎo)致動物的生產(chǎn) 性能下降。由于單胃動物(如豬，家禽和魚類等)消化道缺乏分解植酸這種有機磷的酶類， 幾乎不能利用飼料中豐富的植酸。因此需要在飼料中添加價格昂貴的磷酸氫鈣等無機磷來 滿足動物的需要。這樣既造成磷源浪費，又導(dǎo)致未被利用的植酸隨動物糞便排泄造成嚴(yán)重 的環(huán)境污染。因此，將植酸酶基因轉(zhuǎn)入到植物中，可以獲得植酸酶含量較高的飼料原料，減 輕浪費和環(huán)境污染。目前飼料中植酸酶活性測定已有國家標(biāo)準(zhǔn)，但是植物中植酸酶活性測 定方法尚無國家規(guī)定的方法。本發(fā)明對植物中植酸酶活性測定中的提取方法與檢測方法進(jìn) 行研究，目的是優(yōu)化提取條件與檢測條件，為測定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保證。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，從2009年10月1日起，由國家質(zhì)檢總局(CN-GB)發(fā)布的 GB/T 18634-2009《飼用植酸酶活性的測定一分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)正式實施。然而，在對現(xiàn)有 專利和文獻(xiàn)的分析中發(fā)現(xiàn)，還沒有任何轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取與檢測方法 的專利和文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶提取的最佳條件，本發(fā) 明的另一個目是研究優(yōu)化植酸酶的最佳檢測方法，以克服在測定植酸酶活性的過程中發(fā)生 的酶活性變化較大，數(shù)值不穩(wěn)定的弊端，為進(jìn)一步測定植酸酶活性結(jié)果準(zhǔn)確性提供保障。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法， 其特征在于提取液PH為5. 50，料液比為1 4，提取時間為15min。一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的檢測方法，其特征在于將上述提取物與 濃度為0. lmmol/L的底物應(yīng)用液在pH為5. 50的乙酸緩沖溶液中反應(yīng)30min。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在提取和檢測過程中容易受到多種因素的影響和制約。本發(fā)明采用正交試驗法對轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶的提取方法和檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，主要研究 了 PH值、料液比和提取時間等因素對植酸酶提取的影響，以及反應(yīng)時間、底物應(yīng)用液濃度、 PH值等因素對植酸酶測定的影響。本發(fā)明的有益效果是優(yōu)化轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，在《飼用 植酸酶活性的測定--分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行優(yōu)化實驗，最終確定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉 米籽粒中植酸酶提取與測定的最佳方法，為構(gòu)建轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米安全評價體系提供相關(guān) 數(shù)據(jù)。


圖1為本發(fā)明的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。橫坐標(biāo)為無機磷的量，縱坐標(biāo)為吸光度值。直 線回歸方程為 y = 0. 366X+0. 0054，R2 = 0. 9999。圖2為本發(fā)明的不同料液比對植酸酶活性的影響示意圖。橫坐標(biāo)為不同料液比， 縱坐標(biāo)為植酸酶活性。圖3為本發(fā)明的不同提取時間對植酸酶活性的影響示意圖。橫坐標(biāo)為提取時間， 縱坐標(biāo)為植酸酶活性。圖4為本發(fā)明的不同PH值對植酸酶活性的影響示意圖。橫坐標(biāo)為不同pH值，縱 坐標(biāo)為植酸酶活性。圖5為本發(fā)明的反應(yīng)時間比對植酸酶活性檢測的影響示意圖。橫坐標(biāo)為不同反應(yīng) 時間，縱坐標(biāo)為植酸酶活性。圖6為本發(fā)明的不同底物應(yīng)用液濃度對植酸酶活性檢測的影響示意圖。橫坐標(biāo)為 底物濃度，縱坐標(biāo)為植酸酶活性。圖7為本發(fā)明的不同pH值對植酸酶活性檢測的影響示意圖。橫坐標(biāo)為不同pH值， 縱坐標(biāo)為植酸酶活性。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。此實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于 限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件操作。一實驗材料轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米及其受體玉米種植在國家轉(zhuǎn)基因植物中試與產(chǎn)業(yè)化基地(公 主嶺)，玉米籽粒采集成熟期的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米及其受體玉米，粉碎機粉碎，放于_70°C 冰箱中保存。二試劑植酸酶標(biāo)準(zhǔn)品(30U/g)，購于sigma公司，植酸鈉、無水乙酸鈉、鉬酸銨、偏釩酸銨 均購于BBI公司。磷酸二氫鉀GBW13104購于中國計量科學(xué)研究院。三主要儀器設(shè)備1457A MP8-2 電子分析天平，SARTORIUS GMBH G0TTINGEN ；HZS-H超級水浴恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；KQ-500VDV型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-754型紫外可見分光光度計，山東高密彩虹分析儀器有限公司。
四實驗方法和過程1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取0. 6804g在105°C恒重的基準(zhǔn)磷酸二氫鉀于IOOml容量瓶中，用pH5. 50 的乙酸緩沖溶液溶解，并定容至刻度，濃度為50.0mmol/L。用提取液倍比稀釋成濃度為 25. 0mmol/L、12. 5mmol/L、6. 25mmol/L、3. 125mmol/L、l. 5625mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在試管中分別加入上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0. Iml, 0. 9ml乙酸緩沖溶液，37 °C保溫 5min,加入底物應(yīng)用液2. 0ml，準(zhǔn)確計時30min，最后加入顯色劑2. 0ml，充分混勻，IOmin后 在415nm波長下測定吸光度值。以無機磷的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，列出直線回歸方程。2正交試驗法優(yōu)化植酸酶的提取方法(1)料液比對植酸酶活性的影響準(zhǔn)確稱取5. Og的玉米籽粒樣品6份，按料液比1 1、1 2、1 3、1 4、1 5、 1 6的比例向6份樣品中分別加入5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30mlpH5. 50的提取液，超 聲提取15min，水浴震蕩15min，得提取物備用；在試管中依次加入0. 9ml乙酸緩沖溶液，0. Iml提取物，37°C保溫5min，加入底物 應(yīng)用液2. 0ml，準(zhǔn)確計時30min，最后加入顯色劑2. 0ml，充分混勻，IOmin后在415nm波長下 測定吸光度值，同時做樣品空白，即先加入顯色劑2. 0ml，然后再加入底物應(yīng)用液2. Oml0(2)提取時間對植酸酶活性的影響準(zhǔn)確稱取5. Og玉米籽粒樣品6份，加入pH5. 50的提取液20. 0ml，超聲提取時間分 別為5min、10min、15min、30min、45min、60min，水浴震蕩相同的時間。檢測籽粒中植酸酶活 性。檢測方法同2(1)。(3) pH值對植酸酶活性的影響準(zhǔn)確稱取5. Og玉米籽粒樣品6份，分別加入pH為4. 00,4. 50,5. 00,5. 50,6. 00、 6. 50的提取液20. 0ml，超聲提取15min，水浴震蕩15min。檢測籽粒中植酸酶活性。檢測方 法同2⑴。(4)正交試驗根據(jù)影響植酸酶活性的單因素分析結(jié)果確定正交試驗的實驗因素水平，采用 L9(33)正交表優(yōu)化提取條件。3正交試驗法優(yōu)化植酸酶的檢測方法(1)反應(yīng)時間對植酸酶活性檢測的影響準(zhǔn)確稱取5. Og玉米籽粒樣品1份，加入提取液20. Oml。超聲提取時間15min，水 浴震蕩15min，得提取物備用；分光光度法檢測籽粒中植酸酶活性。取0. Iml提取物，加到 0. 9mlpH為5. 50的乙酸緩沖溶液中，保溫5min后，加入底物應(yīng)用液2. 0ml，37 °C水浴中準(zhǔn) 確反應(yīng)10min、20min、30min、40min、50min，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色劑2. Oml0充分混勻，靜置 IOmin后，在415nm波長下測定吸光度值。同時做樣品空白，即先加入顯色劑，然后再加入底 物應(yīng)用液。(2)底物反應(yīng)液濃度對植酸酶活性檢測的影響提取方法同3(1)。取0. Iml提取物，加到0. 9ml pH值為5. 50的乙酸緩沖溶液中， 保溫5min后，加入0. 05mM、0. lmM、0. 15mM、0. 2mM的底物應(yīng)用液2. 0ml，37°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)
530min，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色劑2. Oml0充分混勻，靜置IOmin后，在415nm波長下測定吸光 度值。同時做樣品空白即先加入顯色劑，然后再分別加入上述濃度的底物應(yīng)用液。(3) pH值對植酸酶活性檢測的影響提取方法同3(1)。取0. Iml提取物，加到0. 9mlpH值分別為6. 50、6. 00、5. 50、 5. 00,4. 50,4. 00乙酸緩沖溶液中，保溫5min后，加入底物應(yīng)用液2. 0ml，37°C水浴中準(zhǔn)確反 應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色劑2. 0ml。充分混勻，靜置IOmin后，在415nm波長下測定吸 光度值。同時做樣品空白即先加入顯色劑，然后再加入底物應(yīng)用液。(4)正交試驗根據(jù)影響植酸酶活性的單因素分析結(jié)果確定正交試驗的實驗因素水平，采用 L9(33)正交表優(yōu)化植酸酶活性的檢測方法。五實驗結(jié)果及分析1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以無機磷的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。直線回歸方程為y = 0. 366x+0. 0054，R2 = 0. 9999 (見附圖 1)。2正交試驗法優(yōu)化植酸酶的提取方法(1)不同料液比對植酸酶活性的影響料液比對植酸酶活性的影響見圖2。從圖2中可以看出，當(dāng)料液比是1 3、1 4、 1 5時，植酸酶的活性較高。故選擇料液比為1 3、1 4、1 5作為正交試驗的實驗因 素水平(見附圖2)。(2)不同提取時間對植酸酶活性的影響提取時間對植酸酶活性的影響見圖3。從圖3中可以看出，當(dāng)提取時間是15min、 30min、45min時，植酸酶的活性較高。故選擇提取時間是15min、30min、45min作為正交試驗 的實驗因素水平(見附圖3)。(3)不同pH值對植酸酶活性的影響pH值對植酸酶活性的影響見圖4。從圖4中可以看出，pH對植酸酶活性的影響的 變化不大，參照文獻(xiàn)的方法，選擇PH5. 00,5. 50,6. 00最為正交試驗的實驗因素水平(見附 圖4)。(4)正交試驗L9(33)實驗因素水平表見表1，L9 (33)正交試驗試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見 表3。對表2進(jìn)行直觀分析可見，最佳的超聲提取條件是A2B2C3，即在提取液pH為5. 50， 料液比為1 4，提取15min時植酸酶活性最高。影響植酸酶的活性的主次因素為C > A >B，即料液比 > 提取時間> !1值。由表3的方差分析結(jié)果可知，三個因素的P值均大于 0. 05，表明其對植酸酶提取效率的影響均無顯著差異。表IL9 (33)實驗因素水平表
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，其特征在于提取液PH為5. 50， 料液比為1 4，提取時間為15min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法涉及的提取物 中植酸酶的檢測方法，其特征在于將提取物與濃度為0. lmmol/L的底物在pH為5. 50的乙 酸緩沖溶液中反應(yīng)30min。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取與檢測方法，其特征在于提取液pH為5.50，料液比為1∶4，提取時間為15min；將上述提取物與濃度為0.1mmol/L的底物應(yīng)用液在pH為5.50的乙酸緩沖溶液中反應(yīng)30min。本發(fā)明的有益效果是優(yōu)化轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，在《飼用植酸酶活性的測定--分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行優(yōu)化實驗，最終確定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶提取與測定的最佳方法，為構(gòu)建轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米安全評價體系提供相關(guān)數(shù)據(jù)。
文檔編號C12N9/16GK102127527SQ20101057175
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者于壯, 劉娜, 夏蔚, 宋新元, 康嶺生, 張明, 張欣芳, 李蔥蔥, 李靜, 李飛武, 董立明, 趙寧, 邢珍娟, 邵改革 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院