專利名稱：葛根素磷酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葛根素磷酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
葛根素(Puerarin)化學(xué)名為4’，7_ 二羥基_8_ β-D-葡萄糖異黃酮。其毒副作 用小，有較廣泛的生理功能如具有抗心律失常及降血壓；擴張冠狀動脈，保護心肌超微結(jié) 構(gòu)，減少心肌梗死范圍；擴張腦血管，增加腦血流量，改善大腦供氧；改善耳、視網(wǎng)膜等器官 微循環(huán)；抑制血小板聚集，改善血液流變，降低血液黏滯度的作用和低密度脂蛋白被氧化損 傷的程度；能清除自由基和抗氧化作用；保護動脈血管內(nèi)皮細胞，阻止動脈粥樣硬化，防止 血栓形成；有較緩和的降低血糖的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種葛根素磷酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法篩選獲得可催化 Puerarin 為葛根素-6〃 -0-磷酸酯(puerarin-6 〃 -0-phosphate ester)微生物菌株，以 便采用微生物轉(zhuǎn)化的方法，獲得puerarin-6〃 -0-phosphate ester產(chǎn)品。Puerarin轉(zhuǎn)化 % puerarin-6" -0-phosphate ester 的代謝途徑見圖 1。本發(fā)明采用分離及保藏的具有葛根素磷酸酯化酶活力的微生物菌種，接種到培養(yǎng) 液中，進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌體分離。所獲菌體作為靜息細胞，加入到 含有葛根素的轉(zhuǎn)化液中，使葛根素轉(zhuǎn)化為葛根素-6" -0-磷酸酯。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體， 上清液經(jīng)濃縮、低溫干燥處理后，可得到含葛根素-6" -0-磷酸酯的固體(純度>50%)?；?將轉(zhuǎn)化液的上清液用有機溶劑萃取，再用水從有機相中反萃取，獲得的水相萃取液經(jīng)濃縮、 硅膠層析，可得到含葛根素-6" -0-磷酸酯的溶液，再將含葛根素-6" -0-磷酸酯的溶液 經(jīng)濃縮、或低溫處理后，可得到葛根素-6" -0-磷酸酯粉末或晶體(純度> 90%)。上述具有葛根素磷酸酯化酶活力的微生物菌種，是蠟狀芽孢桿菌；具體可以是 Bacillus cereus NT~02> Bacillus cereus ATCC14579> Bacillus cereus ATCC10987、 Bacillus cereus ATCC10876>i aci77y5· cereus ATCC YJrHBacillus cereus ATCC14679、 Bacillus cereus ATCC4342 >Bacillus cereus ATCCl3061> Bacillus cereus ATCC17802、 Bacillus cereus ATCC ？)QY^、BaciIlus cereus ATCC33019>Bacillus cereus ATCC9139、 Bacillus cereus ATCC 55812 中的一種或幾種。其中feci/A/s cereus NT-02 是發(fā)明人篩 選的一株菌株，用于本發(fā)明有更好的效果，該菌株已于2010年11月12日保存于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存號CGMCC No. 4326，分類命名為蠟狀芽孢桿 菌{Bacillus cereus),保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微 生物研究所。上述用于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質(zhì)沒有特別的限制，可以是任何一種適合于 微生物生長的營養(yǎng)介質(zhì)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，或由含質(zhì)量比0. 1%-10%的一 種或幾種氮源混合組成的培養(yǎng)液，PH6-10，如以植物蛋白胨、魚胨、玉米漿等為氮源的培養(yǎng)基。上述葛根素磷酸酯化微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件是30 40°C，10 400rrpm搖瓶振蕩 通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時間9 36小時。上述的發(fā)酵液與菌體分離，可采用離心分離方法獲得菌體。上述的葛根素磷酸酯化靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)可在水相、有機相或水相-有機雙相中 進行。水相轉(zhuǎn)化條件為底物質(zhì)量比濃度大于0.01% (質(zhì)量比)至飽和濃度，在任意一種 PH6 10的偏堿性的緩沖溶液中；有機相為乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺，或其他對細 胞毒性較小的有機溶劑；水相-有機相為上述水相與有機相的任意比例混合物。轉(zhuǎn)化溫度 范圍在30 40°C，10 400rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時間9 36小時，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌體通過離心或過濾分開，可獲得含有葛根素-6 “ -0-磷 酸酯的轉(zhuǎn)化液。上述含有葛根素-6 “ -0-磷酸酯溶液加入正丁醇、乙酸乙酯等有機溶劑，振蕩、萃 取，靜置或離心分層后，有機相部分再用水萃取，萃取液經(jīng)濃縮、硅膠層析分離，可得到含葛 根素-6〃 -0-磷酸酯的溶液，再經(jīng)濃縮、或低溫處理后，可得到葛根素-6〃 -0-磷酸酯粉末 (純度彡90%)。其在DMSO中的1H-NMR和13C-NMR的化學(xué)位移的解析結(jié)果如下表1
表1葛根素-6" -0-磷酸酯的13C- NMR和1H-NMR的解析結(jié)果
No.13C-NMR1H-NMRJH-H2153. 08. 3S3123. 4一4175. 4一5126. 67. 9d, J=8. 8Hz6115. 27. 0d, J=8. 8Hz7162. 0一8112. 9一9156. 7一10117. 1一1'123. 0一2' ,6'130. 47. 36d, J=8. IHz3'，5'115. 46. 78d, J=8. 2Hz4'157. 6一1"74. 14. 81d, J=9. 6Hz2"71. 13. 2-4. 783"78. 83. 2-4. 784"70. 43. 2-4. 785"81. 13. 2-4. 786"64. 93. 2-4. 78
MS分析葛根素-6" -0-磷酸酯的分子量為495. 1。本發(fā)明用微生物轉(zhuǎn)化方法獲得的葛根素-6" -0-磷酸酯，其抗氧化活性比葛根素 強30倍，且水溶性是底物的18倍以上，其他的藥理活性都有不同程度的改善。


圖 1 是 Puerarin 轉(zhuǎn)化為 puerarin-6〃 -Ο-phosphate 的代謝途徑。
具體實施例方式實施例1.將IOOml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基放入500ml三角瓶，121°C高壓蒸汽滅菌 后，後XBacillus cereus CGMCC4326菌種，35°C，200rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)18小時后，停止 發(fā)酵，離心分離菌體和發(fā)酵液，取62. 5ml菌液的菌體加入到含有0. 5%葛根素，25ml磷酸 鹽緩沖液(PH7. 5)的250ml三角瓶中，35°C，200rpm振蕩通氣進行葛根素-6〃 -0-磷酸酯 化靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，M小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌體，上清液中含有38%的葛根 素-6〃 -0-磷酸酯。上清液用5ml正丁醇萃取兩次后，葛根素-6〃 - 0 -磷酸酯含量可 達到80%。濃縮液經(jīng)硅膠柱層析分離濃縮后，可得到純度達95%的葛根素-6" -0-磷酸酯 粉末。實施例2.將7L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基放入15L全自動發(fā)酵罐，121°C高壓蒸汽滅菌 后,後)\Bacillus cereus CGMCC4326菌種，37°C，400rpm通氣發(fā)酵，12小時后，停止發(fā)酵， 過濾使菌體和發(fā)酵液分離，取62. 5ml菌液的菌體加入到含有0. 5%葛根素，25ml磷酸鹽緩 沖液(pH7. 5)的250ml三角瓶中，35°C，200rpm振蕩通氣進行葛根素磷酸酯化靜息細胞轉(zhuǎn) 化反應(yīng)，24小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌體，上清液中含有45%的葛根素-6 “ -0-磷 酸酯。上清液用15ml正丁醇萃取兩次后，葛根素-6" -0-磷酸酯含量可達到80%。濃縮色 譜分離后，可得到(純度90%)葛根素-6 “ -0-磷酸酯粉末。實施例3.將50ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基放入250ml三角瓶，121°C高壓蒸汽滅菌 后，後kBaciIlus cereus ATCC14579菌種，37°C，150rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，96小時后，停止發(fā) 酵，過濾使菌體和發(fā)酵液分離，取62. 5ml菌液的菌體加入到含有0. 5%葛根素，25ml磷酸鹽 緩沖液(PH7. 5)的250ml三角瓶中，37°C，150rpm振蕩通氣進行葛根素磷酸酯化靜息細胞轉(zhuǎn) 化反應(yīng)，12小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌體，上清液中含32%的葛根素-6" -0-磷酸 酯。上清液用IOml正丁醇萃取兩次后，葛根素-6" -0-磷酸酯純度可達到80%。濃縮色譜 分離后，可得到(純度90%)葛根素-6〃 -0-磷酸酯粉末。實施例4.將IOOml含(1%)葡萄糖，(2%)植物蛋白胨培養(yǎng)基放入500ml三角瓶， 121°C高壓蒸汽滅菌后，接入feci/A/s cereus ATCC10987菌種，；35 °C，250rpm振蕩發(fā)酵 培養(yǎng)，36小時后，停止發(fā)酵，過濾使菌體和發(fā)酵液分離，取62. 5ml菌液的菌體加入到含有 0. 5%葛根素，25ml磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)的250ml三角瓶中，38°C，250rpm振蕩通氣進行 葛根素-6" -0-磷酸酯化靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。48小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌體，上 清液直接濃縮、干燥后，可得到葛根素-6" -0-磷酸酯粉末(純度為50%)。實施例5.將IOOml含(1%)葡萄糖，(3%)魚胨培養(yǎng)基放入500ml三角瓶共15瓶， 121°C高壓蒸汽滅菌后，接入feci/A/s cereus ATCC10876菌株的孢子，35°C，220rpm通氣 發(fā)酵，16小時后，停止發(fā)酵，過濾使菌體和發(fā)酵液分離，取1500ml菌液的菌體加入到475ml 磷酸鹽緩沖液(PH7. 5)，再加入25ml含40g/L葛根素的二甲基亞砜溶液(混合相中含葛 根素2g/L)分裝入5個500ml三角瓶中。上述混合相于35°C，200rpm振蕩通氣進行葛根 素-6" -0-磷酸酯靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，36小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌體，上清液用 250ml正丁醇萃取兩次后，經(jīng)HPLC制備色譜分離，濃縮結(jié)晶后，可得到0. 6g純度為98%的葛 根素-6" -0 -磷酸酯粉末。實施例6 與實施例1基本相同，但菌種采用feci/^As cereus ATCC 1778。實施例7 與實施例1基本相同，但菌種采用Bacillus cereus ATCC14679。
實施例8 與實施例1基本相同，但菌種采用Bacillus cereus ATCC4342。實施例9 與實施例1基本相同，但菌種采用feci/A/s cereus ATCC13061。實施例10 與實施例1基本相同，但菌種采用feci/^As cereus ATCC17802。實施例11 與實施例1基本相同，但菌種采用feci/^As cereus ATCC 3018。實施例12 與實施例1基本相同，但菌種采用feci/^As cereus ATCC33019。實施例13 與實施例1基本相同，但菌種采用feciWm cereus ATCC9139。實施例14 與實施例1基本相同，但菌種采用^aciBw1S cereus ATCC 55812。本發(fā)明不限于這些公開的實施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以 及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
1.一種葛根素磷酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法，所述的方法是將具有葛根素磷酯化酶活力的微生物接種到培養(yǎng)液中，30 40°C，10 400rrpm搖瓶 振蕩或通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，發(fā)酵9 36小時；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌體 分離，所獲菌體作為靜息細胞，加入到含有葛根素的轉(zhuǎn)化液中，使葛根素轉(zhuǎn)化為磷酯化葛根 素；其中所說的具有葛根素磷酯化活力的微生物菌種是蠟狀芽孢桿菌；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體，上清液經(jīng)濃縮、低溫干燥處理后，可得葛根素-6 “ -0-磷 酸酯固體；或者將轉(zhuǎn)化液離心所得的上清液用有機溶劑萃取處理，有機溶劑萃取液再用 水反萃取后，經(jīng)濃縮、硅膠層析分離，得到含葛根素-6 “ -0-磷酸酯的溶液，再將含葛根 素-6〃 -0-磷酸酯的溶液經(jīng)濃縮、或低溫處理后，得到葛根素-6〃 -0-磷酸酯粉末或晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葛根素磷酸酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述的 賭狀芽孢桿菌是 feci/A/s cereus CGMCC4326, Bacillus cereus ATCC14579,feci77w5 cereus ATCC10987>i aci77y5· cereus KlCCVMl&、Bacillus cereus ATCC ITTti^Bacillus cereus ATCC14679> Bacillus cereus ATCC4342> Bacillus cereus ATCC13061> Bacillus cereus KK￡Y1 視2、Baci 1 Ius cereus ATCC ？t^l^^Bacillus cereus ATCC33019>i aci'77w5· cereus ATCC9139,feci77w5 cereus ATCC55812 中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葛根素磷酸酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的 用于菌體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液，是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液或LB培養(yǎng)基或由含0. 1%-10%(質(zhì)量 比)的一種或幾種氮源混合組成的培養(yǎng)液，PH6-10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葛根素磷酸酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于發(fā)酵培 養(yǎng)液與菌體分離，采用離心分離方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葛根素磷酸酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述發(fā)酵培 養(yǎng)后獲得的菌體，作為靜息細胞用于葛根素磷酸酯化，轉(zhuǎn)化反應(yīng)在水相、有機相或水相-有 機雙相中進行水相轉(zhuǎn)化條件為底物濃度大于0. 01% (質(zhì)量比)至飽和濃度，在任意一種PH6 10 的偏堿性的緩沖溶液中；有機相為乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺，或其他對細胞毒性較小的有機溶劑；水相-有機相為上述水相與有機相的任意比例混合物；轉(zhuǎn)化溫度范圍在30 40°C，10 400rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧， 反應(yīng)時間9 36小時，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌體離心分開，獲得含有葛根素磷酸酯化的 轉(zhuǎn)化液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的葛根素磷酸酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的萃取 轉(zhuǎn)化液的有機溶劑為正丁醇或乙酸乙酯。
全文摘要
葛根素磷酯化的微生物轉(zhuǎn)化方法將具有葛根素磷酯化酶活力的BacilluscereusNT-02微生物菌種接種到培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌體分離。所獲菌體作為靜息細胞，加入到含有葛根素的轉(zhuǎn)化液中，使葛根素轉(zhuǎn)化為磷酯化葛根素。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體，轉(zhuǎn)化液用有機溶劑萃取處理，或用藥學(xué)上可接受的方法處理，得到葛根素及磷酯化葛根素總異黃酮，經(jīng)色譜分離或藥學(xué)上可接受的分離方法，可得到含量>90％的磷酯化葛根素粉末。
文檔編號C12N1/20GK102093969SQ20101057602
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者葉輝, 楊莉萍, 高芳 申請人:南通大學(xué)