專利名稱：一種植物葉綠素酶的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物葉綠素酶的純化方法，具體地，依次采用有機(jī)溶劑沉淀、離子 交換層析和非變性凝膠電泳方法，簡潔地從植物蛋白粗提液中分離得到純化的葉綠素酶， 屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葉綠素酶(Chl0r0phyllase，EC 3. 1. 1. 14)，催化葉綠素水解生成脫植醇葉綠素和 植醇。1913年，Willstatter和Moll首次報道了植物中存在葉綠素酶，其后，葉綠素酶的 生理功能及其應(yīng)用研究得到了迅速的發(fā)展，概括為(1)葉綠素酶的生理功能；(2)細(xì)胞內(nèi) 分布；(3)酶的生化動力學(xué)特征；(4)基因克隆與誘導(dǎo)表達(dá)；(5)油脂加工的脫綠。上述研究與應(yīng)用的基礎(chǔ)在于得到純的葉綠素酶蛋白。目前，植物葉綠素酶的分離 純化主要是利用硫酸銨分級沉淀、疏水層析、離子交換、分子篩過濾等方法，過程復(fù)雜，酶收 率低° 例如 Tsuchiya 等(Tsuchiya T, et al. Purification and characterization of two isozymesof chlorophyllase from mature leaves of Chenopodium album. Plant CellPhysiology,1997,38(9) :1026-1031)在分離藜葉綠素酶的過程中采用硫酸銨沉淀、 ToyopealHW-55疏水層析、Con A層析、Heparin層析、Mono Q離子交換色譜和Superdex 200分子篩過濾6步純化，得到純的葉綠素酶，但過多的純化步驟，造成嚴(yán)重的酶活損失，僅 Toyopeal HW-55 —步，酶收率就降低了 91. 4%，最終收率只有0. 24-0. 51%。Shioi 等(Shioi Y, et al. A simple purification method for the preparation ofsolublized chlorophyllase from Chlorella protothecoides, AnalvticalBiochemistry, 1980,105 (1) :74-79)采用硫酸銨分級沉淀、S印harose CL-6B
G-200分子篩層析純化小球藻的葉綠素酶，提高了酶的收率，簡化了純化程序， 但是對于復(fù)雜的植物細(xì)胞體系，該方法所得酶的純度達(dá)不到要求。因此，改良植物葉綠素酶純化的方法，簡化純化步驟，在保持酶活性的同時，達(dá)到 純度要求，具有一定的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種植物葉綠素酶的純化方法，簡化純化步驟，在保持酶 活性的同時達(dá)到葉綠素酶純度的要求。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下(1)有機(jī)溶液沉淀植物蛋白粗提液，在4°C下邊攪拌邊緩慢加入有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑可選用乙醇、甲 醇或丙酮中的任一種，控制有機(jī)溶劑的體積比濃度為20-40% ；隨后10000-12000rpm離心 沉淀，棄去上清液，向每Ig沉淀中加入含有質(zhì)量體積比濃度為0. 的TritonX-IOO磷酸 緩沖液(20mmol/L，pH7. 0) 10_15mL，于4°C下緩慢攪拌lh，隨后10000-12000rpm離心，棄去 沉淀，上清液即為酶液I。
(2)離子交換層析將步驟(1)得到的酶液I上樣于DEAE-kphacel或DEAE-S^harose CL-6B離子交 換層析柱，然后用含有0- . 3g/L NaCl的磷酸緩沖液QOmmol/L，ρΗ7. 0)洗脫，收集具有葉 綠素酶活性的組分，加入超濾濃縮離心管中，3000rpm，4°C離心，得到的濃縮液即為酶液II。(3)非變性凝膠電泳將步驟O)中得到的酶液II與上樣緩沖液OOmmol/L、pH6. 8的Tris-HCl ；質(zhì)量 體積比為10%的甘氨酸；質(zhì)量體積比為0. 的十二烷基磺酸鈉)混合加樣于丙烯酰胺質(zhì) 量濃度為5-6%的濃縮膠及丙烯酰胺質(zhì)量濃度為12-14%的分離膠上，電泳。電泳后將分離 膠每0. 5cm橫向割成條帶，分別放入磷酸緩沖液O0mmol/L，pH7. 0)中，37°C過夜浸出蛋白， 收集有葉綠素酶活性的組分即為純化的葉綠素酶液III。上述酶的純度可采用質(zhì)量濃度為14%的丙烯酰胺，質(zhì)量體積比為的十二烷基 磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為25mmol/L Tris-甘氨酸(pH 8. 3)，以考 馬斯亮藍(lán)R-250染色，甲醇/冰醋酸/蒸餾水(1 1 8)脫色。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明依次采用有機(jī)溶劑沉淀、離子交換層析、非變性凝膠電泳方法純化植物葉 綠素酶，與現(xiàn)有的植物葉綠素酶純化方法相比，純化步驟少。將本發(fā)明純化的酶液按所述檢 測方法檢測，結(jié)果為單一條帶，表明產(chǎn)物純度高。
具體實施例方式實施例1利用本發(fā)明的方法純化銀杏葉綠素酶，具體為(1)有機(jī)溶劑沉淀將銀杏葉蛋白粗提液在4°C下，邊攪拌邊緩慢加入丙酮，丙酮的體積百分比濃度 為40%，10000rpm離心后傾去上清液，收集沉淀部分，向每Ig沉淀加入含有質(zhì)量體積比 為 0. 24% 的 TritonX-100 磷酸緩沖液(20mmol/L，ρΗ7· 0) IOmL,于 4°C下緩慢攪拌 Ih,隨 后IOOOOrpm離心，收集上清液，棄去沉淀，上清液為銀杏葉綠素酶液I ；此步酶的回收率為 20. 5%。(2)離子交換層析將步驟(1)的酶液I上樣于DEAE-S印hacel，用含14. 6g/L NaCl的磷酸緩沖液 (20mmol/L,pH7. 0)洗脫，收集含有葉綠素酶活性的組分，加入超濾濃縮離心管中，3000rpm， 4°C離心，得到濃縮液，濃縮液即為銀杏葉綠素酶液II ；此步酶的回收率為10.8%。(3)非變性凝膠電泳將步驟⑵中的酶液I I與上樣緩沖液(20mmol/L、pH6. 8的Tris-HCl ；質(zhì)量體積 比為10%的甘氨酸；質(zhì)量體積比為0. 的十二烷基磺酸鈉)混合加樣于丙烯酰胺質(zhì)量濃 度為5%的濃縮膠和丙烯酰胺質(zhì)量濃度為14%的分離膠上，電泳。電泳后將分離膠每0. 5cm 橫向割成條帶，分別放入磷酸緩沖液O0mmol/L，pH7.0)中37°C過夜浸出蛋白，收集合有葉 綠素酶活性的組分即為純化的銀杏葉綠素酶液III，此步得到的葉綠素酶液III經(jīng)質(zhì)量濃 度為14%的丙烯酰胺，質(zhì)量體積比為的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為 單一蛋白條帶。
實施例2與實施例1基本相同，其不同之處在于使用的植物材料為菜椒；步驟(1)中使用的有機(jī)溶劑為乙醇，體積百分比濃度為30% ；步驟O)中的離子交換介質(zhì)為DEAE-kpharose CL-6B。實施例3與實施例1基本相同，其不同之處在于使用的植物材料為豌豆葉；步驟(3)中濃縮膠的丙烯酰胺質(zhì)量濃度為6%，分離膠的丙烯酰胺質(zhì)量濃度為 12. 5%。
權(quán)利要求
1.一種植物葉綠素酶的純化方法，其特征在于，依次采用有機(jī)溶劑沉淀、離子交換色譜 和非變性凝膠電泳等方法，純化植物蛋白粗提液中的葉綠素酶。
2.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的有機(jī)溶劑沉淀方法，其特征在于，有機(jī)溶劑選用丙酮、甲 醇、乙醇中的任一種，其在植物蛋白粗提液中的體積比濃度為20-40 %。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子交換色譜方法，其特征在于，所述離子交換介質(zhì)分別優(yōu) 選 DEAE-Sephacel、DEAE-Sepharose CL-6B。
4.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的非變性凝膠電泳方法，其特征在于，濃縮膠中丙烯酰胺的 質(zhì)量濃度為5-6%，分離膠中丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為12-14%。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種植物葉綠素酶的純化方法。本發(fā)明以植物蛋白粗提液為材料，依次采用有機(jī)溶劑沉淀、離子交換色譜和非變性凝膠電泳方法，純化葉綠素酶。利用本發(fā)明的植物葉綠素酶純化方法，步驟簡單、周期短、操作方便，克服了經(jīng)典方法存在的步驟多、酶失活等缺陷。
文檔編號C12N9/16GK102115736SQ20101057640
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者唐蕾, 張宏建, 張建華, 毛忠貴 申請人:江南大學(xué)