專利名稱：綿羊fgf5基因的克隆及其慢病表達毒載體的構(gòu)建的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及綿羊FGF5(成纖維細胞生長因子5)基因編碼區(qū)(CDS)的全長cDNA序列克隆。
背景技術：
FGF5是對毛囊生長周期具有重要調(diào)控作用的調(diào)控因子，1994年Hebert1利用胚胎干細胞基因敲除技術，首次在國際著名的Cell雜志上報到了 FGF5基因敲除的純合子小鼠被毛長度比雜合子長50%，其原因是由于毛囊生長VI期延長，同時證明了 go基因就是 FGF5突變的等位基因。FGF5主要在毛囊外根鞘表達。早期的研究證明引起安哥拉鼠被毛變長的原因是由于突變鼠的毛囊生長期延長。aian(1988)2在人的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了第五種成纖維細胞生長因子，并將其命名為FGF5，存在兩種變位剪接體，分別編碼122、267個氨基酸殘基。屬于FGF家族之一，F(xiàn)GF家族包含23個成員，其共同的特征是含有兩個大的內(nèi)含子，兩個內(nèi)含子將功能區(qū)分為三個外顯子，多數(shù)FGFs的N末端具有信號肽。Suzuki[3]用RT-PCR方法檢測到大鼠的皮膚中存在FGF5兩種變位剪接體，F(xiàn)GF5全長mRNA包含3個外顯子，其變位剪接體FGF5S是由于缺失第2個外顯子后，改變閱讀框，提前遇到終止密碼子而產(chǎn)生，F(xiàn)GF5和FGF5S均能于FGF受體1和2結(jié)合。全長的FGF5強烈的抑制生長期的毛乳頭細胞刺激外根鞘細胞的增殖，引發(fā)毛囊進入休止期，而FGF5S與FGF5 競爭性的結(jié)合FGF受體，拮抗FGF5的功能。國內(nèi)高愛琴M等人利用RT-PCR檢測了不同發(fā)育階段絨山羊皮膚中的FGF5表達情況，發(fā)現(xiàn)僅有FGF5全長的mRNA表達，沒有發(fā)現(xiàn)FGF5S。2006年Housley等[5]通過狗常染色體隱性遺傳分離試驗，推測狗的長毛性狀可能是由于FGF5基因的錯義突變引起。2007年James等[6]利用全基因組掃描結(jié)合候選基因的方法，發(fā)現(xiàn)了 FGF5基因四個突變位點與貓的被毛長度相關。同時另外一個研究小組也發(fā)現(xiàn)了 FGF5基因與貓的被毛長度相關的突變[7]。2009年Cadieu等利用全基因組掃描的方法進一步證明了 FGF5基因突變與狗的毛長相關8。國內(nèi)高愛琴等對該基因在綿羊群體中的多態(tài)性進行了檢測，但是未進行與羊毛長度的關聯(lián)分析M。劉海英等在絨山羊群體中檢測了該基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與絨纖維的伸直長度和含絨量相關[1°]。李春笑11
等發(fā)現(xiàn)了該基因的兩個突變位點對兔毛產(chǎn)量有顯著影響。目前對FGF5影響毛長的研究主要集中在小鼠上，在毛和狗上也有比較深入的研究，但是在更能體現(xiàn)毛纖維長度價值的綿羊，絨山羊上，國外鮮有研究報道，雖然國內(nèi)學者分析了綿羊FGF5的多態(tài)性，但是沒有做相關性分析。如不同發(fā)育階段絨山羊皮膚中FGF5基因mRNA表達RT-PCR檢測.高愛琴等華北農(nóng)學報，2008，23(1) :36-37;不同綿羊品種FGF5基因的多態(tài)性分析.高愛琴，李寧，趙興波，李金泉.畜牧獸醫(yī)學報，2006，37G)3^-330;FGF5基因?qū)?nèi)蒙古絨山羊絨毛性狀的影響.劉海英，楊桂芹，張微，朱曉萍，賈志海.遺傳2009，31 (2) 175-179;兔成纖維細胞生長因子5 (FGF5)基因SNP及其與產(chǎn)毛量的相關分析.李春笑等遺傳，2008，30 (7) 893-899的報道等。國內(nèi)外目前由于缺乏綿羊FGF5的序列，還沒有發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5的變位剪接體。因此本發(fā)明利用RT-PCR技術結(jié)合5-RACE和3-RACE技術擴增出綿羊FGF5基因cDNA全長編碼區(qū)，并且確定了其存在變位剪接體FGF5S，為進一步研究該基因影響毛囊生長發(fā)育的生物學功能研究奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于確定并獲取對綿羊FGF5基因的克隆及其慢病表達毒載體的構(gòu)建。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的綿羊FGF5基因的克隆和慢病毒表達載體的構(gòu)建，1) 確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全序列；2)將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表達載體中，獲得FGF5和FGF5S基因慢病毒載體，生產(chǎn)重組病毒，感染細胞，驗證重組蛋白的表達；其中擴增外顯子1的引物上游引物TTCCCCGAGGCTATGTCCAC，下游引物 ATCCATTGACTTTGCCATCCG ；其中擴增5-RACE引物以外顯子1測序結(jié)果設計5-RACE引物上游引物 (CLONTECH, SMART RACE cDNA Amplofication Kit,試劑盒自帶)，下游引物 GSPl CTGCTCTGCTCCAAGCCGCTTC, NGSPl :GAAGAAGAGGAAGACACGGTGCT ；其中擴增外顯子3的引物上游引物CAGATGACTGCAAGTTCAGG，下游引物 CAAAGCGAAACTTGAGTCTGT ；其中擴增3-RACE的引物，以外顯子3測序結(jié)果設計3-RACE引物上游弓丨物(CLONTECH，SMARTRACE cDNA Amplofication Kit,試劑盒自帶)GSP2 CAAGCAATCGGAGCAGCCAGAAC, NGSP2 GAAGTCCTAACACGGTGAAATAC ；其中以5-RACE和3-RACE測序結(jié)果設計擴增FGF5全長的引物上游引物 ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT,下游引物 GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGG GTAACCAAAGCGAAACTTGAGT ；擴增FGF5的全長cDNA序列，測序確定FGF5和FGF5S的全長序列；3)克隆與測序?qū)⒕d羊FGF5基因的擴增產(chǎn)物進行回收純化后，利用T4DNA連接酶將其與連接PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α ；利用氨芐青霉素平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽性克隆測序由上海生物工程公司完成。所述基因的克隆及其慢病表達毒載體的構(gòu)建，擴增外顯子1，3及FGF5全長PCR反應體系(25 μ L) 10 Xbuffer 2. 5 μ L，弓丨物(lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L，dNTP (lOmmol/L) 2 μ L， DNA聚合酶(2. 5U/ μ L) 0. 4 μ L，DNA模板1 μ L，ddH20補至25 μ L。RACE的反應程序參考試劑盒的說明書。所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構(gòu)建，PCR反應程序預變性95°C 5min ；變性 95°C 30sec ；外顯子1和3的退火溫度為56°C，F(xiàn)GF5全長的為60°C，退火時間均為30sec ； 720C 30sec (外顯子 1 和 3)，Imin (FGF5 全長)35 個循環(huán)；72°C IOmin0所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構(gòu)建，構(gòu)建表達載體及慢病毒的生產(chǎn)，感染 293T細胞，驗證重組FGF5/FGF5S表達a、以 PMD-18T-FGF5，PMD-18T-FGF5S 為模板,利用特異性引物 F1，F(xiàn)2 和 FS1，F(xiàn)S2 進行 PCR 反應，其反應體系為luLPMD-18T-FGF5 或 PMD-18T-FGF5S，2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP(各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，luLDMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用ddH20 調(diào)整至 25uL ;PCR 反應條件為94°C 4min，94°C 30s,64 °C 30s, 72 °C lmin，;35 個循環(huán)，72°C IOmin ；取反應液5uL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確認；將綿羊FGF5基因的擴增產(chǎn)物及PLex慢病毒載體同時進行Not I/Xho I雙酶切，分別回收純化后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α ；利用氨芐青霉素進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定測序，新載體命名為PLEX-FGF5和 PLEX-FGF5S；b、四3T細胞培養(yǎng)條件37 °C，5 %的CO2，培養(yǎng)基采用DMEM+10 %的胎牛血清，每 IOcm面積中鋪2-2. 5 X IO6個細胞，第2天細胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達到70-80% ；c、Lipectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染加入1. 5ml預熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例加入轉(zhuǎn)染載體(pLEX-FGF5，pLEX_FGF5S) 12ug、包裝質(zhì)粒(pSPAX》9ug、包膜質(zhì)粒 (pMD2G) 3. 5ug、輕輕混勻，同時將50ul的脂質(zhì)體加入到1. 5mlopti-MEM培養(yǎng)基，室溫放置 5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM 培養(yǎng)基清洗待轉(zhuǎn)染細胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復合物加入細胞；將細胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育；2-4小時后，移去脂質(zhì)體和DNA復合物，在每個培養(yǎng)皿中加入IOml新鮮的培養(yǎng)液，重新將細胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4 后收集病毒；在6孔板中鋪5-6 X IO5個 293T細胞；第2天完全培養(yǎng)液匯合度達到50-70%，第2天加入500ul收集病毒，500ul完全培養(yǎng)基，Iul polybrene (終濃度達到10ug/ml)，將細胞置于32°C孵育14-1 !后，更換為完全培養(yǎng)基，將細胞置于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4 后，收集細胞進行western blot檢測FGF5和 FGF5S表達。所述基因的克隆及其慢病表達毒載體的構(gòu)建，選用的試劑盒、藥劑均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明是通過比較小鼠與人FGF5的同源性，根據(jù)保守序列設計擴增FGF5部分外顯子1和3的引物，對部分外顯子1和3進行測序，根據(jù)外顯子1和3的測序結(jié)果設計出 5-RACE和3-RACE引物，利用RACE技術擴增出綿羊FGF5基因的5 ‘-UTR和3，-UTR序列； 并以上序列設計擴增FGF5全長編碼區(qū)的引物序列，(從綿羊皮膚組織)擴增FGF5的全長 cDNA序列，獲得了 FGF5的變位剪接體，并測序驗證FGF5和FGF5S的全長序列，進一步構(gòu)建 FGF5，F(xiàn)GF5S慢病毒表達載體，為研究該基因影響毛囊生長發(fā)育的生物學功能研究奠定基礎，彰顯技術進步。


本發(fā)明對照附圖作進一步說明。附圖1為5-RACE的擴增結(jié)果；如圖所示1，2為樣品，M為150bp的marker。附圖2為3-RACE的擴增結(jié)果；如圖所示1，2為樣品，M為150bp的marker。附圖3為FGF5編碼區(qū)的擴增結(jié)果；如圖所示FGF5擴增產(chǎn)物2. 5%凝膠電泳，其中1，2，3，4為擴增的樣品，M為150bp 的 marker。附圖4為FGF5and FGF5s病毒感染細胞的Western Blot檢測結(jié)果；如圖所示M為蛋白 marker，1 為 pLEX 空載體，2 為 pLEX_FGF5，3 為 pLEX_FGF5S。
具體實施例方式本發(fā)明對照實施例作進一步說明。(1)實驗樣品采集與總RNA提取采集細毛羊皮膚組織，裝入凍存管中并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩ＨOOmg組織樣在液氮中研碎，然后按照杭州博日RNA提取試劑盒說明書進行提取。(2) RT-PCR按照反轉(zhuǎn)錄酶M_MLV(寶生物)的說明書，對綿羊皮膚組織RNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系參照說明書的體系。(3)引物設計利用01igo6. 0設計擴增外顯子1和3的，克隆至T載體上送交上海生物工程公司測序，測序結(jié)果見序列表1和2 ；通過外顯子1和3的測序結(jié)果設計擴增5-RACE和3-RACE 的引物，擴增結(jié)果見圖1和2，克隆至T載體上送交上海生物工程公司測序，測序結(jié)果見序列表3和4 ；根據(jù)5-RACE和3-RACE設計擴增FGF5編碼區(qū)全長的引物，擴增結(jié)果見圖3，測序結(jié)果見5 ；根據(jù)測序結(jié)果設計克隆FGF5至慢病毒表達載體的引物，上游引物Fl :ATAGCGGCC GCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT (Not I)下游引物為 F2 GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT(Xho I)，設計克隆FGF5S至慢病毒表達載體的引物，上游引物FSl與Fl相同，下游引物FS2為GGC￡I CGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCTGTAAATTTGGCTTAAC(XhoI)。(4)擴增外顯子 1，3 及 TOF5 全長 PCR 反應體系(25 μ L) 10 X buffer 2. 5 μ L，引物(IOpmol/μ L)各 0. 5 μ L，dNTP (10mmol/L) 2 μ L, DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 0· 4 μ L，DNA 模板1 μ L，ddH20補至25 μ L ；RACE的反應程序參考試劑盒的說明書。(5) PCR反應程序預變性95°C 5min,變性95°C 30sec,外顯子1和3的退火溫度為56°C，F(xiàn)GF5全長的為60°C，退火時間均為30sec，72°C 30sec(外顯子1和3), Imin (FGF5 全長)；35個循環(huán)，72°C IOmin0(6)克隆和測序?qū)⒕d羊FGF5基因的擴增產(chǎn)物進行回收純化后，利用T4DNA連接酶將其與連接 PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α ；利用氨芐青霉素平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽性克隆測序由上海生物工程公司完成；測序鑒定后的質(zhì)粒命名為PMD-18T-FGF5和 PMD-18T-FGF5S。(7)構(gòu)建慢病毒表達載體分別以PMD-18T-FGF5，PMD-18T-FGF5S為模板，利用特異性引物Fl，F(xiàn)2和FSl，F(xiàn)S2進行PCR反應，其反應體系為luLPMD_18T_FGF5或 PMD-18T-FGF5S,2. 5uL 10XPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL， IuL DMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調(diào)整至 25uL。PCR 反應條件為94°C 4min, 94°C 30s,64°C 30s, 72°C lmin，35個循環(huán)，72°C IOmin ；取反應液5uL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確認，將綿羊FGF5基因的擴增產(chǎn)物及pLex慢病毒載體同時進行Not I/Xho I雙酶切，分別回收純化后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a ；利用氨芐青霉素進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定， 經(jīng)過測序驗證后，新載體命名為PLEX-FGF5和pLEX_FGF5S ；
其細胞培養(yǎng)條件37°C，5%的CO2,培養(yǎng)基采用DMEM+10 %的胎牛血清， 每IOcm面積中鋪2-2. 5X IO6個細胞，保證第2天細胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達到 70-80% ；其Lipectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染加入1. 5ml預熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例加入轉(zhuǎn)染載體(pLEX-FGF5，pLEX_FGF5S) 12ug、包裝質(zhì)粒(pSPAX》9ug、包膜質(zhì)粒 (pMD2G) 3. 5ug、輕輕混勻，同時將50ul的脂質(zhì)體加入到1. 5mlopti-MEM培養(yǎng)基，室溫放置 5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，混合物置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用 Opti-MEM培養(yǎng)基清洗待轉(zhuǎn)染細胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復合物加入細胞，將細胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育，2-4小時后，移去脂質(zhì)體和DNA復合物，在每個培養(yǎng)皿中加入IOml新鮮的培養(yǎng)液，重新將細胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后收集病毒；在6孔板中鋪5-6X IO5個細胞，保證第2天在完全培養(yǎng)液匯合度達到 50-70% ；第2天加入500ul收集病毒，500ul完全培養(yǎng)基，Iulpolybrene (終濃度達到IOug/ ml)，將細胞置于32°C孵育14-1 后，更換新鮮的培養(yǎng)液，將細胞置于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4 后，收集細胞進行western blot檢測FGF5和FGF5S表達。
權利要求
1.綿羊FGF5基因的克隆和慢病毒表達載體的構(gòu)建，其特征在于1)確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全序列；2)將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表達載體中，獲得FGF5和FGF5S基因慢病毒載體，生產(chǎn)重組病毒，感染細胞，驗證重組蛋白的表達；其中擴增外顯子1的引物上游引物TTCCCCGAGGCTATGTCCAC，下游引物 ATCCATTGACTTTGCCATCCG ；其中擴增5-RACE引物以外顯子1測序結(jié)果設計5-RACE引物上游引物 (CLONTECH, SMART RACE cDNA Amplofication Kit,試劑盒自帶)，下游引物 GSPl CTGCTCTGCTCCAAGCCGCTTC, NGSPl :GAAGAAGAGGAAGACACGGTGCT ；其中擴增外顯子3的引物上游引物CAGATGACTGCAAGTTCAGG，下游引物 CAAAGCGAAACTTGAGTCTGT ；其中擴增3-RACE的引物，以外顯子3測序結(jié)果設計3-RACE引物上游引物(CL0NTECH， SMART RACE cDNA Amplofication Kit，試劑盒自帶)GSP2 :CAAGCAATCGGAGCAGCCAGAAC， NGSP2 GAAGTCCTAACACGGTGAAATAC ；其中以5-RACE和3-RACE測序結(jié)果設計擴增FGF5全長的引物上游引物 ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT,下游引物 GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGG GTAACCAAAGCGAAACTTGAGT ；擴增FGF5的全長cDNA序列，測序確定TOF5和FGF5S的全長序列；3)克隆與測序?qū)⒕d羊FGF5基因的擴增產(chǎn)物進行回收純化后，利用T4DNA連接酶將其與連接PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a ；利用氨芐青霉素平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽性克隆測序由上海生物工程公司完成。
2.依據(jù)權利要求1所述基因的克隆及其慢病表達毒載體的構(gòu)建，其特征在于擴增外顯子 1，3 及 FGF5 全長 PCR 反應體系(25 μ L) :10 X buffer 2. 5 μ L，引物(lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L，dNTP (10mmol/L) 2 μ L, DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) O. 4 μ L，DNA 模板 1 μ L, ddH20 補至 25 μ L。RACE的反應程序參考試劑盒的說明書。
3.依據(jù)權利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構(gòu)建，其特征在于PCR反應程序預變性95°C 5min ；變性95°C 30sec ；外顯子1和3的退火溫度為56°C，F(xiàn)GF5全長的為60°C，退火時間均為30sec ；72°C 30sec(外顯子1和3), Imin(FGF5全長)35個循環(huán)； 720C IOmin。
4.依據(jù)權利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構(gòu)建，其特征在于構(gòu)建表達載體及慢病毒的生產(chǎn)，感染細胞，驗證重組FGF5/FGF5S表達a、以PMD-18T-FGF5，PMD-18T-FGF5S為模板，利用特異性引物Fl，F(xiàn)2和FSl，F(xiàn)S2進行 PCR 反應，其反應體系為luLPMD-18T-FGF5 或 PMD-18T-FGF5S，2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 IuL，luLDMSO，IUTaq酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20調(diào)整至 25uL ；PCR 反應條件為94°C 4min, 94°C 30s,64°C 30s, 72°C lmin, 35 個循環(huán)，72°C IOmin ； 取反應液5uL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確認；將綿羊FGF5基因的擴增產(chǎn)物及pLex慢病毒載體同時進行Not I/Xho I雙酶切，分別回收純化后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α ；利用氨芐青霉素進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定測序，新載體命名為pLEX-FGF5和pLEX_FGF5S ；b,293T細胞培養(yǎng)條件37°C，5%的CO2,培養(yǎng)基采用DMEM+10%的胎牛血清，每IOcm面積中鋪2-2. 5 X IO6個細胞，第2天細胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達到70-80% ；c、Lipectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染加入1. 5ml預熱的Opti-ΜΕΜ培養(yǎng)基后，按下列比例加入轉(zhuǎn)染載體(pLEX-FGF5，pLEX-FGF5S) 12ug、包裝質(zhì)粒(pSPAX》9ug、包膜質(zhì)粒 (pMD2G) 3. 5ug、輕輕混勻，同時將50ul的脂質(zhì)體加入到1. 5mlopti-MEM培養(yǎng)基，室溫放置 5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM 培養(yǎng)基清洗待轉(zhuǎn)染細胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復合物加入細胞；將細胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育；2-4小時后，移去脂質(zhì)體和DNA復合物，在每個培養(yǎng)皿中加入IOml新鮮的培養(yǎng)液，重新將細胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4 后收集病毒；在6孔板中鋪5-6 X IO5個 293T細胞；第2天完全培養(yǎng)液匯合度達到50-70%，第2天加入500ul收集病毒，500ul完全培養(yǎng)基，Iul polybrene (終濃度達到10ug/ml)，將細胞置于32°C孵育14-1 后，更換為完全培養(yǎng)基，將細胞置于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4 后，收集細胞進行western blot檢測FGF5和 FGF5S表達。
5.依據(jù)權利要求1所述基因的克隆及其慢病表達毒載體的構(gòu)建，其特征在于選用的試劑盒、藥劑均為市售產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明的綿羊FGF5基因的克隆和慢病毒表達載體的構(gòu)建，確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全序列；將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表達載體中，獲得FGF5和FGF5S基因慢病毒載體，生產(chǎn)重組病毒，感染293T細胞，驗證重組蛋白的表達；其中擴增外顯子1的引物；擴增5-RACE引物；擴增外顯子3的引物；擴增3-RACE的引物；以外顯子3測序結(jié)果設計3-RACE引物其中以5-RACE和3-RACE測序結(jié)果設計擴增FGF5全長的引物擴增FGF5的全長cDNA序列，測序確定FGF5和FGF5S的全長序列；克隆與測序?qū)⒕d羊FGF5基因的擴增產(chǎn)物進行回收純化后，利用T4DNA連接酶將其與連接PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α；利用氨芐青霉素平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽性克隆測序由上海生物工程公司完成。
文檔編號C12N15/867GK102181448SQ20101058004
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權日2010年12月9日
發(fā)明者劉明軍, 張寧, 張雪梅, 李文蓉, 賀三剛 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心