專利名稱：抗人cd52的工程抗體、載體、試劑盒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其是一種抗人CD52的工程抗體、載體、試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
白血病是威脅人類生命健康的主要幾種疾病之一，在我國發(fā)病率大約為 2. 76/100000人。其中急性淋巴細胞白血病多見于兒童，急性髓系白血病多見于成年人，而 慢性白血病多發(fā)于40歲以上人群。它是一類起源于造血(或淋巴)干細胞的惡性疾病。由 于干細胞受損，白血病細胞失去進一步分化成熟的能力，或者增殖與分化能力不平衡，而停 滯在細胞發(fā)育的不同階段，具體表現(xiàn)為細胞在體內(nèi)無限增殖，而其分化成熟和凋亡受阻。白 血病與其它癌癥一樣，一直因為沒有特應性的標志導致無法用常規(guī)藥物準確殺傷白血病細 胞。白血病細胞與正常細胞的區(qū)別目前認為主要在于某些生物分子的表達量不同，利用這 些特征，特別是與造血干/祖細胞的區(qū)別可以在一定程度上殺傷白血病細胞而不影響造血 的重建。特異性識別某種細胞膜表面分子的抗體正是實現(xiàn)這一目的的最好工具，目前利用 抗體治療白血病主要是通過以下三種途徑抗體結(jié)合白血病細胞后通過補體依賴的細胞毒 和抗體依賴細胞介導的細胞毒直接殺傷白血病細胞；抗體結(jié)合白血病細胞表面分子，通過 所引發(fā)的下游信號誘導白血病細胞分化或凋亡；通過抗體的靶向作用將殺傷性藥物或效應 物帶入白血病細胞內(nèi)達到局部殺傷的目的等。人類CD52 分子屬于一個未命名的短鏈 GPI(Glycosyl-phosphatidylinositol， 糖基磷脂酰肌醇)錨定糖蛋白家族。它由一條很短的肽鏈組成，只有12個氨基酸殘基 (GQNDTSQTSSPS)，在C末端通過GPI錨定分子連接于細胞膜表面，N末端3位天冬酰胺連接 有一個復雜的糖基。CD52分子是一種分布比較廣泛的抗原，分布于造血系統(tǒng)的淋巴細胞，單 核細胞，嗜酸粒細胞上和單核細胞分化的樹突狀細胞。在雄性生殖系統(tǒng)中的附睪和輸精管 上皮細胞也有CD52分子的表達。在很多淋巴系細胞惡性腫瘤和某些急性髓系白血病細胞 上也都有⑶52分子不同程度的表達。Quigley MM等報道，在92%-100%的毛細胞白血病 細胞上都有⑶52分子表達。最近有報道，血液中存在從細胞表面脫落的可溶性⑶52分子 可以作為慢性淋巴細胞白血病的標志。⑶52在集落形成細胞上沒有顯著表達，而在某些被 認為是淋巴樣祖細胞的⑶34+/⑶38+細胞上有表達，Hale G等總結(jié)了 5000多例用抗⑶52 單抗處理的干細胞移植研究中證明⑶52抗原在造血干/祖細胞(⑶34+/⑶38-)上沒有表 達。CD52分子本身的功能目前并不清楚，其很多間接功能都是通過其相應抗體獲得 的，且都與其自身結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。作為GPI錨定蛋白，CD52分子被其抗體結(jié)合后導致細胞 膜重排盡而引發(fā)下游信號，對細胞產(chǎn)生影響。另外CD52分子在細胞表面往往呈高度有序 排列，并且其分子很小，非常有利于補體的激活。體內(nèi)應用CD52抗體的實驗證明，在體內(nèi)由 CD52抗體介導的靶細胞殺傷主要是通過補體介導的細胞毒作用(CDC)和抗體介導細胞依 賴的細胞毒作用(ADCC)實現(xiàn)的。而⑶52的高表達和有序排列都利于這些作用在體內(nèi)的發(fā) 揮。
最近還有很多證據(jù)表明⑶52分子對惡性白血病細胞可能是必須的高度糖基化 帶來的負電荷具有抗粘附作用，增加了白血病細胞的遷移能力；CD52陰性細胞致瘤率降低 而回輸體內(nèi)CD52分子會重新出現(xiàn)；CD52分子在同一個個體中在惡性細胞表面的表達顯著 高于正常細胞。以上這些事實均表明⑶52分子對于有目的的免疫細胞清除或白血病治療都是一 個良好的靶點，并且對于造血干/祖細胞影響較小，特異性識別CD52分子的抗體具有巨大 的潛在藥用價值。目前白血病治療主要采用控制增殖、誘導凋亡的化療藥物，包括烷化劑、抗代謝藥 物等。這些藥物在殺死白血病細胞的同時，對正常造血細胞也有嚴重損傷，故對機體存在嚴 重的毒副作用。此外，白血病細胞常會對化療藥物產(chǎn)生耐藥，同時化療后復發(fā)率較高，嚴重 影響臨床化療藥物治療的有效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗人CD52的工程抗體、載體、試劑盒及其 用途，并可用于白血病和自身免疫性疾病的診斷、預后判斷，清除正常免疫細胞或殺傷白血 病細胞；提供的抗人CD52單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因及其表達產(chǎn)物，兩 者重組后表達產(chǎn)生的抗⑶52kFv片段，能夠特異性結(jié)合人⑶52分子并能夠降低鼠源性抗 人CD52抗體的免疫源性。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗人CD52的工程抗體， 包括SEQ ID NO. 2重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO. 4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。編碼所述SEQ ID NO. 2重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示， 編碼所述SEQ ID NO. 4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。含有編碼所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，分別含有SEQ ID NO. 1所述的重 鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQ ID N0. 3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列的cDNA 的Simple-T載體。含有編碼所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，含有SEQ ID NO. 1所述的重鏈可 變區(qū)VH基因核苷酸序列、SEQ ID N0. 3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列和接頭序列 的 cDNA 的 PET22b (+)載體。所述的抗人CD52的工程抗體或載體在制備白血病診斷試劑、免疫抑制類藥物或 治療白血病的藥物中的應用。一種免疫檢測試劑盒，含有至少一種上述工程抗體或的載體。免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤或自身免疫性疾??；或評價惡性腫瘤或自身免疫 性疾病的發(fā)展和預后；或指導惡性腫瘤或自身免疫性疾病的治療中的用途。CD52高表達在很多白血病惡性細胞表面。有文獻表明，在病人體內(nèi)，惡性細胞表面 的CD52密度遠遠大于體內(nèi)的正常細胞，CD52抗原具有的高度糖基化帶來的細胞表面負電 荷的增加被認為與細胞的惡性程度城正相關(guān)性。還有觀察報道惡性細胞表面CD52抗原分 子可能脫落于血液中，檢測病人血清中的可溶性CD52分子可以作為診斷白血病的一個標
ο⑶52還表達在正常淋巴細胞表面，單核細胞核和多種抗原提呈細胞表面，⑶52表
4達量的多少可以對細胞的分類和免疫力的判斷提供重要指標。當準備使用CD52抗體藥物治療疾病時，檢測細胞表面的CD52表達情況可以為治 療提供數(shù)據(jù)支持，治療過程中繼續(xù)檢測細胞表面的CD52表達情況或者表達CD52的細胞群 狀況有助于幫助了解治療效果和病程進展。


圖1是抗人⑶52單克隆抗體對白血病細胞系生長狀態(tài)的影響。圖2是PCR擴增VL，VH基因片段電泳圖。1 :VL 2 :VH 3 =Marker0圖3是PCR擴增單鏈抗體(ScFv)基因片段圖譜。1-3 =ScFv 4 =Marker0圖4是cFv表達產(chǎn)物的SDS-PAGE (10% )圖譜。1 未誘導菌體蛋白；2 誘導后全 菌蛋白；3 =Marker ；4 包涵體及不溶性全菌蛋白；5 可溶性蛋白。圖5是抗人CD52_ScFv的^festern blot分析。1 未誘導菌體蛋白；2 誘導后全 菌蛋白；3 =Marker ；4 包涵體及不溶性全菌蛋白；5 可溶性蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的詳細說明一種抗人⑶52的工程抗體，包括SEQ ID NO. 2重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO. 4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。編碼所述SEQ ID NO. 2重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示， 編碼所述SEQ ID NO. 4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。含有編碼所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，分別含有SEQ ID NO. 1所述的重 鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQ ID N0. 3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列的cDNA 的Simple-T載體。含有編碼所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，含有SEQ ID NO. 1所述的重鏈可 變區(qū)VH基因核苷酸序列、SEQ ID N0. 3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列和接頭序列 的 cDNA 的 PET22b (+)載體。所述的抗人CD52的工程抗體或載體在制備白血病診斷試劑、免疫抑制類藥物或 治療白血病的藥物中的應用。一種免疫檢測試劑盒，含有至少一種上述工程抗體或的載體。免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤或自身免疫性疾??；或評價惡性腫瘤或自身免疫 性疾病的發(fā)展和預后；或指導惡性腫瘤或自身免疫性疾病的治療中的用途。實施例1小鼠抗人⑶52單克隆抗體的制備及熒光標記以分離的人扁桃腺細胞為抗原，常規(guī)方法免疫6周齡Balb/c小鼠，首次基礎(chǔ)免疫 使用福氏完全佐劑，每隔3周進行一次基礎(chǔ)免疫，共三次，2 X IO7細胞/只 次，最后一次基 礎(chǔ)免疫后3周后脾內(nèi)注射加強免疫，1 X IO7細胞/只；3天后取脾，與NSl小鼠骨髓瘤細胞進 行融合，按常規(guī)雜交瘤制備方法進行。融合12天后，收集單克隆生長的融合孔上清，利用間 接免疫熒光法，選擇CD52陽性的靶細胞系進行篩選鑒定，選擇反應性好，生長狀態(tài)好的雜 交瘤細胞進行亞克隆，得到穩(wěn)定分泌抗人CD52單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為HI52， 液氮凍存。于1996年提交國際白細胞分化抗原會議，被確認為識別人類CD52抗原。采用
5小鼠腹腔內(nèi)誘生法，將HI52細胞株接種Balb/c小鼠腹腔，1. 5X IO6/只，1周后采集腹水， 經(jīng)ftOtein G Sepharose4FF親和層析柱層析，制備HI52抗體純品。利用共價連接的方法把熒光素偶聯(lián)到抗體上，經(jīng)分離純化制備出偶聯(lián)復合物，即 熒光標記抗體。實施例2抗人⑶52單克隆抗體檢測白血病細胞系細胞表面的⑶52表達情況取生長良好的REH細胞離心收集，用PBS調(diào)制1 X 107ml，每100 μ 1加入流式管， 一管加入PE標記⑶52抗體，一管加入PE標記的小鼠IgGl同型對照，室溫避光反應20分 鐘。加入約2mlPBS洗一次，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入300 μ 1PBS,流式細胞儀檢測。實施例3抗人CD52單克隆抗體可以在體外有效抑制白血病細胞系的生長取生長良好的⑶52陽性白血病細胞系，用含20% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至 1 X 105/ml，按每孔100 μ 1加入96孔培養(yǎng)板。將細胞分為4組。對照組1 不添加任何抗 體；對照組2 加入20 μ g/ml羊抗鼠第二抗體；實驗組1 加入10 μ g/ml Campath-I ；實驗 組2:加入lOyg/ml Campath-I和20 μ g/ml羊抗鼠第二抗體。置37 °C，5%二氧化碳培養(yǎng) 箱培養(yǎng)144小時。(1)細胞形態(tài)變化。白血病細胞系與HI52共培養(yǎng)后，可明顯表現(xiàn)出分散形態(tài)，不再 具有聚集生長的特征。HI52單獨或聯(lián)合第二抗體作用時，細胞數(shù)目雖然相對對照組有一定 的減少，但細胞的聚集生長形態(tài)特征仍可見。見圖1。(2)胎盼蘭拒染法檢測細胞生長。HI52可抑制多種白血病細胞系的增殖。實施例4抗人⑶52單克隆抗體可以誘導白血病細胞系凋亡取生長良好的⑶52陽性白血病細胞系，用含20% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至 1 X 105/ml，按每孔100 μ 1加入96孔培養(yǎng)板。將細胞分為4組。對照組1 不添加任何抗體； 對照組2 加入20 μ g/ml羊抗鼠第二抗體；實驗組1 加入10 μ g/ml HI52 ；實驗組2 加入 10 μ g/ml HI52和20 μ g/ml羊抗鼠第二抗體。置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時。 收集細胞，PBS 洗滌，Annexin-V 試劑盒(Annexin-V-FLOUS staining Kit ；ROCHE)檢測細 胞早期凋亡。經(jīng)檢測，HI52對白血病細胞系作用48小時后，白血病細胞的早期凋亡率明顯 增高。見下表1。表lArmexin V試劑盒檢測HI52單獨或聯(lián)合第二抗體作用于⑶52陽性細胞系時 誘導細胞凋亡的結(jié)果，表中所示為早期凋亡陽性率。對照組3.49%第二抗體2.62%抗人CD52單克隆抗體2. 72%抗人CD52單克隆抗體+第二抗體8.43%實施例5抗⑶52抗體的輕重鏈可變區(qū)基因克隆(I)RNA提取采用Trizol —步法，1)取雜交瘤細胞約106，加入ImlTrizol，吹打混 勻，室溫靜置5分鐘。2)加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。3) 12000rpm, 4°C，離心15分鐘。4)取上清，加入0. 5ml異丙醇室溫靜置15分鐘。5) 12000rpm，4°C，離心 15分鐘。6)棄上清，加入lml75%的乙醇洗，7500rpm，4°C，離心5分鐘。7)棄上清，沉淀晾 干，加入30 μ LDEPC水溶解。
(2)逆轉(zhuǎn)錄為 CDNAQOy 1)取 2. 5mMdNTP4y l，5Xfirst strandbuffer 8μ 1, DTT4 μ 1，01igodT2 μ 1，水16. 6 μ 1，混勻后加入RNA約2 μ g，65°C水浴5分鐘，快速冰浴2-3 分鐘。加入 50u/yl RNasinO. 4 μ 1, Superscript II QOOu/μ 1) 1 μ 1 混勻后 37°C 水浴 > 1 小時。取出后70°C水浴10分鐘。-20°C保存。(3) PCR擴增抗⑶44抗體的輕重鏈可變區(qū)基因輕鏈可變區(qū)基因PCR擴增反應體系(50μ 1)設(shè)計通用簡并引物，上游引物5’_GAC ATT GTG CTC ACC CAG WCT 51\^-3，；下游引物5，-0^ TTAGAT CTC CAR BTT KGT SCS-3，。以 cDNA為模板，高保真PfuDNA聚合酶擴增。PCR循環(huán)程序為94°C 5分鐘；94°C 30秒，55°C 30 秒，72°C 30秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。重鏈可變區(qū)基因PCR擴增反應體系(50 μ 1)上游引物5，-CAG GTS MARCTG CAG SAG TCff GG-3，；下游引物 5，-TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC-3，。以 cDNA 為模板，高 保真PfuDNA聚合酶擴增。PCR循環(huán)程序為94°C 5分鐘；94°C，30秒，55C，30秒，72°C，30秒， 共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。(4)測序載體的構(gòu)建=Simple-T載體購白大連寶生物公司。將輕重鏈可變區(qū)基因 PCR產(chǎn)物回收，與Simple-T載體連接后，按常規(guī)方法氯化鈣轉(zhuǎn)化，以100 μ g/ml氨芐濃度篩 選陽性克隆，送測序，該基因完全符合蛋白數(shù)據(jù)庫中抗體所具有的若干保守的框架氨基酸 的特點，該序列為抗體基因序列。分別命名為T-VH及T-VL。實施例6單鏈抗體基因表達載體PET22b (+) ScFv的構(gòu)建根據(jù)輕、重鏈可變區(qū)的酶切圖譜及構(gòu)建載體PET22b(+)的酶切位點，設(shè)計并合成 了用于VH，VL基因擴增和拼接的引物。VH上游引物5' -GAC TCG CCATGG ACC AGG TGC AGC TGC AGG AA-3'；VH下游引物5' -ACC TCC AGA GCC TCC ACC TCC AGA TCC ACC TCC ACC TGA GGA GAC GGT GACAGG-3，。VL上游引物5' -GGA TCT GGA GGT GGAGGC TCT GGA GGT GGA GGC TCT GAC ATT GTG ATG ACC CAG-3，；VL下游引物5， -CTCGAG CCG TTT GAT TTC CTG-3，。引入克隆用的Nco I/Xho I限制性酶切位點及單鏈抗體的linker序列(采用最廣 泛的(GGGGS) 3為linker)。從所構(gòu)建的T-VH及T-VL載體中PCR擴增VH，VL片段，回收后， 經(jīng)重疊延伸拼接法(SOE)通過PCR直接合基因。將PET2^(+)載體及回收的kFv 基因分別用Nco I/Xho I雙酶切，回收后按常規(guī)方法進行連接和轉(zhuǎn)化構(gòu)建抗人⑶52 kFv表 達載體PET22b(+) ScFv。陽性克隆用Nco I/Xho I雙酶切鑒定后測序確定。正確的克隆用 于表達。測序結(jié)果表明正確，按氨基酸序列推測738bp，kFv約為26. 8KD的蛋白，見圖3、4實施例7抗人⑶52kFv抗體片段的表達、純化(1)抗人⑶52單鏈抗體(ScFv)在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE分析在3ml含 100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種一陽性單菌落，37°C震蕩培養(yǎng)過夜后，接種30 μ 1于3ml含100μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)約4小時后，加IPTG至終 濃度為0. lmmol/L, IPTG誘導7小時后收獲菌液，加入細菌滲透性釋放液(Tris-HCl 25mM, EDTA ImM, PMSF O.lmM，蔗糖(20%，w/v)，NaCl 200mM) 20ml，4°C輕搖 1 小時。12000g 再次 離心，分別收集上清和菌體。各取適量，加入20 μ 1 2XSDS上樣buffer，100°C煮沸5min。 取5μ 1上樣，10% SDS-PAGE檢測表達蛋白，考馬斯亮藍染色。實驗證明實現(xiàn)了重組質(zhì)粒 pET22b (+) ScFv在大腸桿菌中的表達，738bp片段表達出約^Kd的帶(His) 6的蛋白，見圖 7。(2)抗人⑶52單鏈抗體(ScFv)純化將按上步收集的菌體沉淀重懸于1/10培養(yǎng) 體積的冰預冷20mmol/L Tris-HCl (PH 7. 2)，超聲破碎細胞，13000rpm，4°C離心30min，取上
清用于純化。上步收集的上清直接用于純化。蛋白采用Pharmacia公司的Chelating Sepharose Fast Flow進行純化，按操作 手冊平衡鎳柱，掛鎳，清洗。將粗分離的樣品加入鎳離子親合層析柱，使目的蛋白結(jié)合到柱 子上，洗滌后，用6倍柱床體積的含500mM咪唑的Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫液用PBS緩沖 液透析48小時。(3) Western blot鑒定主要參考分子克隆方法進行^iestern印跡，結(jié)果證明條帶 為表達產(chǎn)物，見圖5 實施例8抗人⑶52kFv抗體活性測定競爭性免疫熒光抑制試驗1)細胞系檢測?、?2表達陽性細胞HPB-ALL細胞系，制成IX IO6細胞懸液；加入不同量的 HI52-ScFv,室溫避光孵育1小時；再加入0. 5 μ g PE標記的HI52單克隆抗體，室溫避光孵 育20分鐘；加入2ml冷PBS緩沖液，重懸，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；加入300 μ 1 含多聚甲醛的PBS緩沖液，流式細胞儀檢測。2)正常人外周血檢測每管加入正常人抗凝外周血100μ 1，加入不同量的HI52-ScFv，室溫避光孵育1小 時；再加入0. 5 μ g PE標記的抗人⑶52單克隆抗體，室溫避光孵育20分鐘；加入2ml溶血 素室溫避光反應10分鐘后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；加入2ml冷PBS緩沖液，重 懸，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；加入300μ 1含多聚甲醛的PBS緩沖液，流式細 胞儀檢測。經(jīng)抗人CD52 ScFv競爭后，ΗΙ52與HPB-ALL細胞系結(jié)合的陽性率降低為未競爭 時的33%，與外周血白細胞反應時熒光強度明顯下降，證明抗人CD52 kFv可競爭性抑制 HI52與HPB-ALL細胞系及正常人外周血白細胞的結(jié)合，即抗人⑶52 ScFv能夠與細胞表面 的⑶52抗原特異性結(jié)合，見圖9。結(jié)合變性細胞膜⑶52分子活性的Wfestern Blot檢測取生長良好的HPB-ALL細胞約IX 107，用冰冷的PBS洗滌細胞，4°C，3000g離心5 分鐘。向細胞沉淀中加入200ul預冷的IX細胞裂解液裂解細胞，4°C，30分鐘。4°C離心， 10000g，10分鐘，取上清。盡快加入40ul 6X加樣緩沖液，沸水浴10分鐘。室溫IOOOOg離 心10分鐘，棄沉淀取上清。上樣，每孔加50ul上清，進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后， 分別應用抗人CD52單克隆抗體和抗人CD52 ScFv，進行western blot檢測。結(jié)果顯示抗人⑶52 ScFv與抗人⑶52單克隆抗體的反應性一致，均能識別分子量
8大約為30KD的蛋白。
權(quán)利要求
1.一種抗人⑶52的工程抗體，其特征是包括SEQ ID NO. 2重鏈可變區(qū)氨基酸序列和 SEQ ID NO. 4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人⑶52的工程抗體，其特征是編碼所述SEQID NO. 2重鏈 可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼所述SEQ ID NO. 4輕鏈可變區(qū) 氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.含有編碼權(quán)利要求1所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，其特征是分別含有SEQ ID NO. 1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因 核苷酸序列的cDNA的Simple-T載體。
4.含有編碼權(quán)利要求1所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，其特征是含有SEQID NO. 1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷 酸序列和接頭序列的cDNA的PET22b(+)載體。
5.權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗人CD52的工程抗體或3、4中任一項所述的載體在 制備白血病診斷試劑、免疫抑制類藥物或治療白血病的藥物中的應用。
6.一種免疫檢測試劑盒，其特征是含有至少一種權(quán)利要求1-2工程抗體或權(quán)利要求 3-4的載體。
7.權(quán)利要求6所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤或自身免疫性疾??；或評價惡 性腫瘤或自身免疫性疾病的發(fā)展和預后；或指導惡性腫瘤或自身免疫性疾病的治療中的用 途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人CD52的工程抗體、載體、試劑盒及其用途，能夠在體內(nèi)外特異性結(jié)合人類CD52抗原，通過多種機制單獨或協(xié)調(diào)作用，有目的清除正常免疫細胞活殺傷白血病細胞。本發(fā)明涉及抗人CD52單克隆抗體HI52重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備用于白血病或自身免疫病的診斷和治療藥物中的應用。重鏈和輕鏈可變區(qū)基因來自抗人CD52單克隆抗體。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)成功制備人源化單鏈抗人CD52基因工程抗體，為白血病和免疫系統(tǒng)疾病的診斷和治療提供了一種新的有效藥物。
文檔編號C12Q1/68GK102079787SQ20101058095
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者侯士芳, 屈浩, 張宇光, 朱衛(wèi)彬, 石琳, 黃麗華 申請人:協(xié)和干細胞基因工程有限公司