專利名稱：一種用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)體系，尤其是一種用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體 系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在美國(guó)每年有25000例造血干細(xì)胞移植病例，并且這個(gè)數(shù)字還在增加。然而，60% 的需要進(jìn)行干細(xì)胞移植的美國(guó)人找不到配型相符的供體，從而限制了從這種非常具有潛力 的治療手段上受益的患者的數(shù)量。臍帶血被認(rèn)為是這些患有致命疾病而又無法找到合適配型的患者的新的干細(xì)胞 來源。相關(guān)研究表明臍血干細(xì)胞移植對(duì)配型要求較為寬松，所以臍帶血干細(xì)胞移植的應(yīng)用 將會(huì)比現(xiàn)在的移植數(shù)量多一倍。然而這種前景目前并沒有實(shí)現(xiàn)，因?yàn)槟殠а杉?xì)胞(CB)的 數(shù)量較少不足以對(duì)成人進(jìn)行一次成功的移植。因此，開發(fā)對(duì)臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增的 方法和技術(shù)成為其能夠廣泛臍血干細(xì)胞作為一個(gè)理想的干細(xì)胞移植來源為50-60%的需要進(jìn)行干細(xì)胞移植但 是無法找到合適配型的成人患者提供可以應(yīng)用的供體。但是由于每CB單位中HSC數(shù)量不 足以滿足成人移植的需要，導(dǎo)致在成人干細(xì)胞移植中會(huì)發(fā)生延遲植入和移植失敗率的問題 從而限制了它的應(yīng)用。因此，有效的擴(kuò)增CB能夠拓寬其在成人干細(xì)胞移植領(lǐng)域的應(yīng)用前 景。不幸的是，迄今為止并沒有在CB HSC擴(kuò)增以及延遲植入和移植失敗率方面取得明顯的 突破。Pleiotrophin(PTN)屬于肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子家族，是一種可以同肝素結(jié)合的分 泌性的生長(zhǎng)/分化因子，具有刺激細(xì)胞黏附、遷移、存活、生長(zhǎng)和分化的功能。研究發(fā)現(xiàn)通過 RNA干擾方法下調(diào)細(xì)胞的PTN表達(dá)量能夠明顯的降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種通過在體外培養(yǎng)CB細(xì)胞的系統(tǒng)中加 入一定劑量的PTN，從而得到了一種能夠更好地提高細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)和擴(kuò)增效率以及 CD34+細(xì)胞的比率的高效干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于臍帶血造血干細(xì)胞 擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，包括1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、血小板生成素、干細(xì)胞因子SCF、人FMS 樣酪氨酸激酶3配體Flt-3L，還添加了多效生長(zhǎng)因子PTN。各組分的含量如下1640 培養(yǎng)基0. 90mL/mL胎牛血清FBS0. lOmL/mL血小板生成素20ng/mL干細(xì)胞因子125ng/mL人FMS樣酪氨酸激酶3配體Flt-3L50ng/mL
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多效生長(zhǎng)因子PTN50_80ng/mL。所述多效生長(zhǎng)因子PTN來源于人類。所述的用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系在臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增 培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是在現(xiàn)有的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的多效生長(zhǎng)因 子Pleiotrophin (PTN)，從而得到一種能夠在體外更為有效的支持臍帶造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)、 擴(kuò)增，更為重要的是能夠顯著提高造血干細(xì)胞在移植到受體體內(nèi)后的植入能力和造血系統(tǒng) 重建能力，從而為臍血干細(xì)胞(CB)在臨床上的應(yīng)用開辟了新的應(yīng)用前景。有希望應(yīng)用于臍 血干細(xì)胞成人移植的研究中。經(jīng)過這種培養(yǎng)基體外培養(yǎng)后的干細(xì)胞移植進(jìn)入小鼠體內(nèi)后， 表現(xiàn)出更為明顯的增殖能力以及良好的植入和造血系統(tǒng)重建能力。


圖1是應(yīng)用不同培養(yǎng)基體外培養(yǎng)臍帶血⑶34+⑶38-Lin_7天后檢測(cè)結(jié)果 (CD34+CD38-Lin-細(xì)胞比例)。圖2是應(yīng)用不同培養(yǎng)基體外培養(yǎng)臍帶血⑶34+⑶38-Lin_7天后檢測(cè)結(jié)果(細(xì)胞數(shù)
量)O圖3是應(yīng)用不同培養(yǎng)基體外培養(yǎng)臍帶血⑶34+⑶38-Lin_7天后檢測(cè)結(jié)果 (CD;34+CD38-Lin-細(xì)胞數(shù)量)。圖4是人源干細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)4周后檢測(cè)外周血中人源⑶45+細(xì)胞比例。圖5PTN直接注射對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞擴(kuò)增的影響(骨髓細(xì)胞總量)。圖6PTN直接注射對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞擴(kuò)增的影響(KSL細(xì)胞的比例)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，包括1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、 血小板生成素、干細(xì)胞因子SCF、人FMS樣酪氨酸激酶3配體Flt-3L，還添加了多效生長(zhǎng)因 子 PTN。各組分的含量如下1640 培養(yǎng)基0. 90mL/mL胎牛血清FBS0. lOmL/mL血小板生成素20ng/mL干細(xì)胞因子125ng/mL
人FMS樣酪氨酸激酶3配體Flt-3L 50ng/mL多效生長(zhǎng)因子PTN50_80ng/mL。所述多效生長(zhǎng)因子PTN來源于人類。所述的用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系在臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增 培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)路線如下1)人源PTN對(duì)人臍血⑶34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增具有促進(jìn)作用
a)取一份協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司凍存的臍血干細(xì)胞樣品37°C復(fù)蘇。b)取小部分進(jìn)行核細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活力，CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)，并檢測(cè) 外來物以及病原體。c)剩下的細(xì)胞以⑶34+為標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用Isolex 300 磁珠系統(tǒng)進(jìn)行分離，收集⑶34+ 細(xì)胞d)CD34+細(xì)胞按照l*106/ml密度在37°C 5% C02條件下培養(yǎng)，將全部細(xì)胞分為 四組干細(xì)胞培養(yǎng)基(TSF)；干細(xì)胞培養(yǎng)基含20ng/ml的PTN ；干細(xì)胞培養(yǎng)基含50ng/ml的 PTN ；干細(xì)胞培養(yǎng)基含80ng/ml的PTN。其中干細(xì)胞培養(yǎng)基的成分為0. 9mL的1640培養(yǎng)基 其中添加0. ImL胎牛血清(FBS)、20ng血小板生成素(Thrombopoietin)、125ng干細(xì)胞因子 (Stem cell factor，SCF)、50ng人FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt_3)，TSF培養(yǎng)基能夠體外 維持HSC的擴(kuò)增。e)培養(yǎng)7天之后，測(cè)定細(xì)胞總量、⑶34+細(xì)胞在全部細(xì)胞中比例以及克隆形成數(shù)。2)人源PTN對(duì)人臍帶⑶34+細(xì)胞處理后移植植入能力和造血系統(tǒng)重建能力的影響a)取一份協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司凍存的臍血干細(xì)胞樣品37°C復(fù)蘇。b)取一小部分進(jìn)行核細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活力，⑶34+細(xì)胞計(jì)數(shù)，并檢 測(cè)外來物以及病原體c)剩下的細(xì)胞以⑶34+應(yīng)用Isolex 300 磁珠系統(tǒng)進(jìn)行分離，收集⑶34+細(xì)胞d)CD34+細(xì)胞在按照l*106/ml密度在37°C 5% C02條件下培養(yǎng)，將全部細(xì)胞分為 兩組TSF培養(yǎng)基；TSF培養(yǎng)基含80ng/ml的PTNe)七天后將細(xì)胞進(jìn)行處理，然后移植進(jìn)入NOD-SCID小鼠。并且將剛分離的CB細(xì) 胞作為對(duì)照組也移植入一組小鼠中f)在移植后4周時(shí)檢測(cè)人源⑶45細(xì)胞的植入情況g)在移植后8周作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)計(jì)算小鼠的存活率，并且對(duì)存活小鼠外周血細(xì)胞中人 源細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)從而確定移植細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的多向分化能力。3) PTN直接注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)能夠小鼠骨髓細(xì)胞的再生a)將實(shí)驗(yàn)小鼠分成三組給予700cGY TBI，殺死小鼠的骨髓造血干細(xì)胞b)分別對(duì)三組小鼠給予PTN、G-GSF以及生理鹽水，持續(xù)7天c)在第7天和14天檢測(cè)小鼠骨髓細(xì)胞總數(shù)以及骨髓KSL細(xì)胞的數(shù)量下面進(jìn)行詳細(xì)說明實(shí)施例1 取一份協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司存儲(chǔ)的臍血干細(xì)胞樣本37°C水浴復(fù)蘇，4°C 下以lOOOg/min離心5min ；以干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取一小部分進(jìn)行核細(xì)胞計(jì)數(shù)并通過 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活力；剩余細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀篩選CD34+CD38-Lin-細(xì)胞。將細(xì)胞按照 l*106/ml密度在37°C 5% C02條件下培養(yǎng)其中一組使用TSF培養(yǎng)基；其它三組在TSF培 養(yǎng)基中分別加入PTN至終濃度為20、50、80ng/ml。培養(yǎng)7天后收集全部細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)以及CD34+細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，結(jié)果證明 在PTN濃度20-80ng/ml的情況下細(xì)胞總量沒有明顯的差異，但是隨著PTN濃度的增加 CD34+⑶38-Lin-細(xì)胞的數(shù)量和比例明顯提高(圖1、2、3)，所以80ng/ml的PTN濃度是作 用最為明顯的，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)組中⑶34+⑶38-Lin-細(xì)胞的比例明顯增高并且克隆形成細(xì)胞
5(CFC)的數(shù)量比對(duì)照組高4倍。這說明PTN對(duì)臍帶⑶34+⑶38-Lin-細(xì)胞的擴(kuò)增有明顯的促 進(jìn)作用。以下將含80ng/ml PTN的TSF培養(yǎng)基稱為高效干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。實(shí)施例2 取一份協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司臍血干細(xì)胞樣本37°C水浴復(fù)蘇，4°C下以 1000g/min離心5min ；以干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取一小部分進(jìn)行核細(xì)胞計(jì)數(shù)并通過臺(tái)盼 藍(lán)染色檢測(cè)活力，應(yīng)用流式細(xì)胞儀篩選CD34+CD38-Lin-細(xì)胞。將細(xì)胞按照l*106/ml密度在 370C 5% C02條件下培養(yǎng)其中一組使用TSF培養(yǎng)基；另一組使用高效干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后將細(xì)胞移植進(jìn)入NOD-SCID小鼠中，一共分為三組(1)移植當(dāng)天分離 細(xì)胞直接移植；( 以干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)7天的細(xì)胞；C3)以高效干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)7 天的細(xì)胞。按照每個(gè)小鼠移植500個(gè)細(xì)胞的比例，移植4周后檢測(cè)小鼠外周血中人源CD45+ 細(xì)胞，結(jié)果(見圖4)移植(3)細(xì)胞的小鼠外周血細(xì)胞中的人源CD45+細(xì)胞的數(shù)量是移植 ⑵細(xì)胞的3倍。而8周后檢測(cè)小鼠外周血移植⑴細(xì)胞的13只小鼠中只有1只能夠檢 測(cè)到人源細(xì)胞(8%)；在移植(2)細(xì)胞的13只小鼠中有6只能夠檢測(cè)到人源細(xì)胞(46%)； 而在移植(3)細(xì)胞的13只小鼠中全部能夠檢測(cè)到人源細(xì)胞(100% )。以上實(shí)驗(yàn)充分證明人源臍帶⑶34+⑶38-Lin-細(xì)胞經(jīng)過高效干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基 體外培養(yǎng)后具有明顯增強(qiáng)的移植植入能力，并且能夠更好的實(shí)現(xiàn)造血系統(tǒng)的重建。實(shí)施例3 對(duì)小鼠進(jìn)行700cGy的輻射處理，殺死90%以上的骨髓造血干細(xì)胞。將小鼠分為三 組分別給予2 μ g/d的PTN ;2 μ g/d的G-GSF ；腹腔注射生理鹽水，持續(xù)7天。7天之后對(duì)所有小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5、6 經(jīng)過PTN處理的組中小 鼠的骨髓細(xì)胞總數(shù)明顯的高于其它兩組；并且PTN組中的骨髓KSL細(xì)胞的數(shù)量增加了 3倍； 第14天時(shí)PTN組中的KSL細(xì)胞的數(shù)量分別是其它兩個(gè)組中的4倍和4. 3倍。以上實(shí)驗(yàn)說 明PTN能夠在體內(nèi)明顯的發(fā)揮作用，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞的增殖。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，包括1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、血小 板生成素、干細(xì)胞因子SCF、人FMS樣酪氨酸激酶3配體Flt-3L，其特征在于，還添加了多效 生長(zhǎng)因子PTN。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，其特征在于，各組 分的含量如下1640 培養(yǎng)基0. 90mL/mL胎牛血清FBS0. lOmL/mL血小板生成素20ng/mL干細(xì)胞因子125ng/mL人FMS樣酪氨酸激酶3配體Flt-3L 50ng/mL 多效生長(zhǎng)因子PTN50-80ng/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述 多效生長(zhǎng)因子PTN來源于人類。
4.如權(quán)利要求1所述的用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系在臍帶血造血干細(xì)胞 的體外擴(kuò)增培養(yǎng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系及其應(yīng)用，包括1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、血小板生成素、干細(xì)胞因子SCF、人FMS樣酪氨酸激酶3配體Flt-3L，還添加了多效生長(zhǎng)因子PTN。在現(xiàn)有的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的PTN，從而得到一種能夠在體外更為有效的支持臍帶造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)、擴(kuò)增，更為重要的是能夠顯著提高造血干細(xì)胞在移植到受體體內(nèi)后的植入能力和造血系統(tǒng)重建能力，從而為臍血干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用開辟了新的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK102080065SQ201010580960
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者侯士芳, 張宇光, 王雪蓮, 陳曉波, 韓洪起, 黃家學(xué) 申請(qǐng)人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司