專利名稱：Vegf-a蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血管內(nèi)皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor-Α, VEGF-A)蛋白及應用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
VEGF-A是以二聚體形式存在的糖蛋白，其分子量約為34 45kDa。VEGF-A能夠 促進血管內(nèi)皮細胞存活、增殖、遷移及分化，并能增加微血管通透性，從而參與新血管生成， 在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。VEGF-A的生物學活性是通過其與細胞 膜上的VEGF受體(VEGF receptor, VEGFR)結(jié)合實現(xiàn)的。VEGF受體包括VEGFRl、VEGFR2 和VEGFR3。非激酶受體neuropiIin-I能夠增強VEGF-A與VEGFR2的結(jié)合能力(Holmes DI and Zachary. Genome Biol. 2005;6:209 ；Takahashi H and Shibuya Μ. Clin Sci. 2005;109:227-241)。圖1所示，VEGF-A基因含有8個外顯子，其中第6、7和8外顯子尚含有近端剪接 位點和遠端剪接位點，并因5’和3’端剪接位點的選擇性差異產(chǎn)生了多種形式的VEGF-A蛋 白。根據(jù)第8外顯子的差異剪接可將VEGF-A蛋白分為VEGFxxx (xxx為VEGF-A蛋白的氨 基酸序列長度)亞家族和VEGFxxxb亞家族，現(xiàn)已證實的VEGFxxx亞家族成員包括VEGF206、 VEGF189, VEGF183、VEGF165、VEGF145, VEGFl 21 和 VEGF111，VEGFxxxb 亞家族成員包括 VEGF189b、VEGF183b、VEGF165b、VEGF145b 和 VEGF121b (Harper SJ and Bates DO. Nat Rev Cancer. 2008;8:880-887 ；Ladomery MR, et al. Cancer Lett. 2007;249:133-142)。 VEGFxxx亞家族成員羧基末端的6個氨基酸為CDKPRR，均具有促進新血管生成活性，而 VEGFxxxb亞家族成員羧基末端的6個氨基酸則為SLTRKD，具有抑制新血管生成的活性(Qiu Y, et al. Biochem Soc Trans. 2009;37:1207-1213)。在正常組織中VEGFxxxb蛋白的表達占優(yōu)勢，如在后根神經(jīng)節(jié)、肺臟、結(jié)腸、皮膚和 玻璃體中VEGFxxxb蛋白占VEGF-A總量的比例分別為71%、擬％、95%、95%和66%，胎盤組織則 是唯一特例僅為1. 4%。相反，在黑素瘤、結(jié)腸癌和膀胱癌等腫瘤細胞中VEGFxxx表達卻占主 導地位。目前研究認為，VEGFxxx和VEGFxxxb之間的比例是決定血管生成的關(guān)鍵因 素，促進外顯子8b剪接、強制高表達VEGFxxxb和給予外源性重組VEGFxxxb等均能通 過改變VEGi7XXX和VEGi7XXXb比例抑制腫瘤血管生成(Nowak DG, et al. J Bio Chem. 2010;285:5532-5540 ；Rennel ES, et al. Future Oncol. 2009;5:703-712 ；Rennel ES, et al. Br J Cancer. 2009 ； 1183-1193 ；Rennel ES, et al. Br J Cancer. 2008;98:1250-1257 ；Rennel ES, et al. Eur J Cancer. 2008；441883-1894 ； Konopatskaya 0, et al. Mol Vis. 2006;12:626-632 ；Woolard J, et al. Cancer Res. 2004;64:7822-7835 ；Bates DO, et al. Cancer Res. 2002;62:4123-4131)02007年Mineur等報道了一種新的VEGFxxx亞家族成員VEGF111，并證實該成 員僅在基因毒干預條件下得以表達。VEGF111編碼序列由外顯子1、2、3、4和8a剪接構(gòu)成。VEGFl 11能夠通過激活VEGFRl和VEGFR2促進血管內(nèi)皮細胞遷移和增殖，且其活性與 VEGF121和VEGF165相當。由于VEGF111成熟肽序列中沒有纖溶酶切割位點和肝素結(jié)合 位點，所以蛋白穩(wěn)定性和擴散性能均高于其他VEGFxxx亞家族成員(Mineur P, et al. J Cell Biol. 2007 ； 179 1261-1273)。然而，是否存在相對應的 VEGFlllb 蛋白以及 VEGFlllb 是否能夠有效抑制新血管生成至今尚未被證實。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑制新血管生成活性的VEGF-A蛋白，即 VEGFllib。本發(fā)明的目的還在于公開編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列，并提供 一種含有該序列的DNA或含有該DNA的載體或質(zhì)粒。本發(fā)明的再一個目的在于提供本發(fā)明蛋白質(zhì)或基因載體在制備治療腫瘤或血管 生成性視網(wǎng)膜病變藥物中的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對人VEGF-A基因序列進行生物信息學分析和驗證， 獲得了一種VEGF-A蛋白。該蛋白含有111個氨基酸。根據(jù)目前VEGF-A家族成員的命名原 則，本發(fā)明稱該蛋白為VEGFlllb，其氨基酸序列見序列表中的SEQ ID NO. 1 (下文簡稱“序 列1”)。該蛋白的前體蛋白由VEGF-A基因第1、2、3、4和汕外顯子編碼。VEGFlllb前體蛋 白的氨基酸序列見序列表中的SEQ ID NO. :2 (下文簡稱“序列2”)，編碼VEGFlllb前體蛋 白的核苷酸序列見序列表中的SEQ ID NO. :3 (下文簡稱“序列3”)。本申請文本中所用的 術(shù)語“VEGFlllb蛋白”是指一種具有序列表中序列1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了該VEGFlllb蛋白的衍生物。VEGFlllb衍生物包括那些具有在體 內(nèi)抑制新血管生成的、其氨基酸序列為序列3所示氨基酸序列的突變體、序列3的保守取代 形式、增加或缺失一個或幾個氨基酸的形式、氨基端截短的形式、序列3的部分或全部串聯(lián) 重復形式以及上述形式的聚乙二醇修飾形式和上述形式與其他蛋白質(zhì)或細胞因子的融合 蛋白形式。在本申請文本所用的氨基酸三字母或單字母表達方式，采用IUPAC規(guī)定的氨基酸 代碼(Eur J Biochem. 1984;138:9-37)。具體而言，首先對人VEGF-A基因進行生物信息學分析，獲得VEGFlllb編碼信息， 進而設(shè)計引物，并分別在上游引物和下游引物中加入適宜的酶切位點。以人總cDNA為模 板，擴增并分離出約430bp的VEGFlllb cDNA，經(jīng)酶切后克隆至pCEP4質(zhì)粒的多克隆位點 中，得到pCEP4-VEGFlllb質(zhì)粒。給裸鼠接種乳腺癌MCF-7細胞制備荷瘤裸鼠模型，尾靜脈 高壓注射pCEP4-VEGFlllb質(zhì)粒，定期觀測腫瘤體積的變化。結(jié)果表明，尾靜脈高壓注射 pCEP4-VEGFlllb能夠有效抑制腫瘤生長并誘發(fā)腫瘤消退，同時腫瘤組織微血管密度顯著降 低。根據(jù)VEGFlllb成熟肽的編碼信息設(shè)計引物，并分別在上游引物和下游引物中加 入適宜的酶切位點。以人總cDNA為模板，擴增并分離出約340bp的VEGFlllb cDNA。然 后，經(jīng)酶切后連接至pET-22b (+)的多克隆位點中，得到pET22b-VEGFlllb質(zhì)粒。隨后，將 pET22b-VEGFlllb質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566得到含有該質(zhì)粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。經(jīng)誘 導后純化重組VEGFlllb蛋白。給小鼠接種乳腺癌4T1細胞制備荷瘤小鼠模型，腹腔注射純化的VEGFlllb蛋白，定期觀測腫瘤體積的變化。結(jié)果表明，純化的VEGFlllb蛋白能夠明顯 的抑制腫瘤生長并誘發(fā)腫瘤消退，同時腫瘤組織微血管密度顯著降低。VEGFl 1 Ib是一種天然存在的VEGF-A蛋白，能夠競爭性阻斷VEGFxxx亞家族成員的 促新血管生成活性。與已報道的VEGF121b和VEGF16^d相比，VEGFlllb能抵抗纖溶酶和基 質(zhì)金屬蛋白酶等的水解作用，具有較高的生物穩(wěn)定性。同時，由于VEGFlllb分子量較小且 不含有肝素結(jié)合位點，因此具有較強的組織穿透能力。由此可見，使用VEGFlllb作為新血 管生成抑制劑較VEGF121b和VEGF16^d更具優(yōu)勢。由于本發(fā)明的VEGFlllb蛋白具有抑制新血管形成的作用，因而其具有用于制備 治療腫瘤和血管生成性視網(wǎng)膜病變藥物的用途。所述藥物可為注射劑、粉劑、片劑、膠囊劑、 溶液、懸浮劑、乳劑等。所述藥物的給藥途徑可為口服、經(jīng)皮注射、靜脈注射或肌肉注射。本發(fā)明還相應地提供一種藥物組合物，其含有本發(fā)明公開的VEGFlllb蛋白或其 具有抑制新血管生成活性的衍生物或含有編碼VEGFlllb的核苷酸序列的基因載體；以及 藥學上可以接受的載體。所述可藥用載體包括液體載體如純凈水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖 液、白蛋白溶液等，固體載體如抗氧化劑、淀粉、糊精等。本發(fā)明的藥物組合物還可任選地含 有其他新血管生成抑制劑類生物制品如血管內(nèi)皮抑制素、腫瘤壞死因子。本發(fā)明公布的含有VEGFlllb的藥物組合物制備工藝簡單，可以采用制藥領(lǐng)域中 的常規(guī)技術(shù)和設(shè)備，將本發(fā)明公布的VEGFlllb蛋白配制成藥物組合物。例如，可以將本 發(fā)明公布的VEGFlllb蛋白溶解在無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、白蛋白溶液中，配制成 1 μ g^lOO μ g/mL 的溶液。本發(fā)明公布的VEGFlllb可以參照重組人血管內(nèi)皮抑制素的建議給藥劑量安排給 藥。例如，給藥劑量范圍在Iyg 1000μ g/kg體重/日的范圍內(nèi)，并由執(zhí)業(yè)醫(yī)師根據(jù)患者 的年齡、體重、疾病的嚴重程度、病因和病史等因素在該范圍內(nèi)選擇。


圖1顯示VEGF-A家族成員外顯子剪接示意圖。圖2顯示RT-PCR檢測VEGFlllb的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為目標 片段。泳道1為IOObp DNA Ladder,泳道2為以MCF-7細胞cDNA為模板的PCR產(chǎn)物，泳道 3為陰性對照。圖3顯示RT-PCR擴增VEGFlllb全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為 444bp目標片段。泳道1為IOObp DNA Ladder,泳道2和3為以MCF-7細胞cDNA為模板的 PCR產(chǎn)物。圖4顯示腹腔注射重組VEGFlllb蛋白對乳腺癌荷瘤小鼠模型進行治療后腫瘤體 積的變化。治療組每天腹腔注射VEGFlllb，劑量為100 μ g/kg體重，對照組每天腹腔注射含 有 0. 1% BSA 的 PBS。圖5顯示腹腔注射重組VEGFlllb蛋白對乳腺癌荷瘤小鼠模型進行治療后腫瘤微 血管密度的變化。治療組每天腹腔注射VEGFlllb，劑量為100 μ g/kg體重，對照組每天腹腔 注射含有0. 1% BSA的PBS。圖6顯示尾靜脈高壓注射pCEP4_VEGFlllb對乳腺癌荷瘤裸鼠模型進行基因治療 后腫瘤體積的變化。治療組動物每周尾靜脈高壓注射pCEP4-VEGFlllb質(zhì)粒1次，對照組則采用相同方法給予PCEP4。圖7顯示尾靜脈高壓注射pCEP4_VEGFlllb對乳腺癌荷瘤裸鼠模型進行基因治療 后腫瘤微血管密度的變化。治療組動物每周尾靜脈高壓注射pCEP4-VEGFlllb質(zhì)粒1次，對 照組則采用相同方法給予PCEP4。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明不受下述具體文字描述的限制， 本發(fā)明可在權(quán)利要求所概括的范圍內(nèi)做各種改變，這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實施 例中未注明具體條件者，按常規(guī)或制造商建議的條件進行。本發(fā)明中所述載體、宿主菌等可由商業(yè)途徑得到，如pET_22b購自Novagen公司， pCEP4購自Invitrogen公司，ER2566菌種購自NEB公司。實施例1. VEGFlllb 的 PCR 檢測
使用含有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、50 μ g/mL維生素C、40 μ g/mL慶大霉素的完全 DMEM/F12培養(yǎng)液在37°C、飽和濕度和5% C02 (V/V)條件下培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞。使 用TRIzol (Invitrogen)提取細胞總RNA。使用Oligo (dT) w為引物進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物cDNA為模板，使用上游引物5，-CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA GTA-3，和下游引物 5，-TTC CTG GTG AGA GAT CTG CAT TCA-3，進行 PCR 檢測。PCR 反應條件為IXPCR 緩沖 液，0.5μΜ 上游引物，0.5μΜ 下游引物，2.0yL cDNA, 2U Taq-(iTakaraag)JOyM dATP, 50 μ M dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，用無菌雙蒸水調(diào)反應體系至50 μ L。循環(huán)參數(shù)為 94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，共30個循環(huán)。反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在洲TAE凝膠 上以50V、50mA條件電泳30min，可見條帶，表明MCF-7細胞表達VEGFlllb mRNA (圖 2所示)。實施例2. VEGFlllb真核表達載體的構(gòu)建
以MCF-7細胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，使用上游引物5’ -AAA CTC GAG GCC GCC ACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG C-3，(下劃線為 XhoI 酶切位點)和下游引物 5，-AAA GGA TCC TCA GTC TTT CCT GGT GAG AGA TC TG-3，(下劃線為 BamHI 酶切位點)進 行PCR擴增。PCR反應條件為1 X PCR緩沖液，0. 5 μ M上游引物，0. 5 μ M下游引物，2. O μ L cDNA，0. 25U Pyrobest DNA 聚合酶(Takara 公司)，50 μ M dATP, 50 μ M dTTP,50yM dCTP, 50μΜ dGTP，用無菌雙蒸水調(diào)反應體系至50yL。循環(huán)參數(shù)為94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin,共30個循環(huán)。反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在m TAE凝膠上以50V、50mA條件電泳30min， 可見444bp條帶(圖3所示)?；厥誅NA，以XhoI和BamHI雙酶切，用T4 DNA連接酶克隆至 質(zhì)粒pCEP4的相應酶切位點之間，獲得真核表達載體pCEP4-VEGFlllb。實施例3. VEGFlllb成熟肽的原核表達
以MCF-7細胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用上游引物5’ - AAA CAT ATG GCC ACC ATG GCA GAA GGA GGA-3，(下劃線為NdeI酶切位點)和下游引物5’ -AAA CTC GAG TCA GTC TTT CCT GGT GAG AGA TCT G-3，(下劃線為XhoI酶切位點)進行PCR反應。PCR反應 條件為:1XPCR緩沖液，0. 5μΜ上游引物，0. 5μΜ下游引物，2. Ομ L cDNA，0. 25U Pyrobest DNA 聚合酶(Takara 公司)，50 μ M dATP, 50 μ M dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，用無菌雙蒸 水調(diào)反應體系至50yL。循環(huán)參數(shù)為94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，共30個循環(huán)。反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在洲TAE凝膠上以50V、50mA條件電泳30min，可見354bp條帶?；?收DNA，以NdeI和BioI雙酶切，用T4 DNA連接酶克隆至質(zhì)粒pET_22b⑴的相應酶切位點 之間，獲得原核表達載體pET22b-VEGFlllb。使用pET22b_VEGFlllb轉(zhuǎn)化ER2566感受態(tài)細 胞，獲得能夠表達VEGFlllb成熟肽的工程菌。將攜帶pET22b-VEGFlllb質(zhì)粒的ER2566工程菌劃線接種于含100 μ g/mL氨芐青 霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，37°C、飽和濕度條件下培養(yǎng)16h，挑取生長狀態(tài)良好的單個菌落， 含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物以1%接種量 接種于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl值達到0. 5 0. 8 時，加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為ImM，誘導6小時，每個小時取樣 ImL, 8000g離心lOmin，棄上清，收獲菌體。每管加入50 μ L雙蒸水重懸菌體，加入2 X SDS Loading Buffer, 100°C水浴 lOmin, 12000g 離心 15min 后取上清進行 SDS-PAGE。電泳結(jié)束 后，使用考馬斯亮藍染色、脫色，并對凝膠進行薄層掃描分析，可見約12. SkDa處有新生條 帶，誘導表達4 他時約占菌體總蛋白的25%。將發(fā)酵后收獲的菌體以1:3(W/V)比例重懸于pH8. 0的含蔗糖25g/L、Triton-X100 10g/L的50mmol/L Tris-HCl緩沖液(Α液)中，加入適量溶菌酶和DNase I，冰浴中超聲破 碎菌體，4°C條件下以IOOOOg離心30min。將沉淀重懸于含20g/L Tween-20的TE緩沖液(B 液)中，超聲混勻，4°C條件下以IOOOOg離心30min。使用含10mmol/L DTT的TE緩沖液(C 液)洗滌沉淀2次，4°C條件下以IOOOOg離心30min，收獲沉淀即為粗制包涵體。將粗制包 涵體以1:3 (W/V)比例重懸于含尿素8. 5mol/L和DTT lOmmol/L的溶液中，4°C攪拌8h后， 4°C條件下以IOOOOg離心30min，收獲上清即為包涵體溶解液。使用kphacryl S200層析柱對包涵體溶解液進行初步純化后，以1:50 (V/V)比 例與pH8. 0含15ymol/L CuC12的25mmol/L Tris-HCl緩沖液混合，室溫放置復性Mh。以 10000:1 (V/V)加入0. 5mol/L EDTA pH8. 0，充分混勻后室溫放置12h。超濾濃縮，用Imol/ L妝2朋03調(diào)整？!1值至7.4。用Q-kpharose HP層析柱進行離子交換層析，進一步純化后 凍干濃縮。用Superdex-75 PG凝膠層析柱進行純化，收集VEGFlllb 二聚體，分裝保存?zhèn)溆谩?經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分析，VEGFlllb 二聚體純度達95%以上。實施例4. VEGFlllb蛋白抑制荷瘤小鼠腫瘤生長和血管化
使用含有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、50 μ g/mL維生素C、40 μ g/mL慶大霉素的完全 RPMI1640培養(yǎng)液在37°C、飽和濕度和5% C02 (V/V)條件下培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細胞。以 1 X IO6個細胞/只的劑量給BALB/c小鼠腹部皮下注射對數(shù)生長期的4T1細胞，制備4T1荷 瘤小鼠模型。用含有0. 1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH8. 0將實施例3所述 純化的VEGFlllb蛋白配制成1. 0mg/mL的溶液作為下述注射用樣品。將4T1荷瘤小鼠模型 20只隨機分成兩組，治療組每天腹腔注射VEGFlllb，劑量為100 μ g/kg體重，對照組每天腹 腔注射含有0. 1% BSA的PBS。連續(xù)注射觀天，隔日用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計 算腫瘤體積[長徑X短徑X (長徑+短徑)X0. 5]，根據(jù)腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線。結(jié) 果表明腹腔注射VEGFlllb蛋白能夠顯著抑制腫瘤生長并誘發(fā)腫瘤消退(圖4所示)。腫瘤 組織固定、切片后進行⑶31免疫組化分析計算微血管密度，結(jié)果表明治療組腫瘤組織的微 血管密度顯著低于對照組(圖5所示)。
實施例5. VEGFlllb基因治療抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長和血管化
使用含有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、50 μ g/mL維生素C、40 μ g/mL慶大霉素的完全 DMEM/F12培養(yǎng)液在37°C、飽和濕度和5% C02 (V/V)條件下培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞。取 體重為2(Γ25克的雌性裸鼠，皮下包埋劑量為1. 7mg的17 β -雌二醇緩釋片(Innovative Research公司) 小時后，以2X IO7個細胞/只的劑量皮下注射對數(shù)生長期的腫瘤細胞，制 備MCF-7荷瘤裸鼠模型。將MCF-7荷瘤裸鼠模型20只隨機分成兩組，待腫瘤體積達到300mm3 時，應用尾靜脈高壓注射法每周給予治療組動物pCEP4-VEGFlllb質(zhì)粒基因治療1次，對照 組則采用相同方法給予PCEP4，隔日用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積[長 徑X短徑X(長徑+短徑)X0.5]，根據(jù)腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果表明VEGFlllb 基因治療能夠顯著抑制腫瘤生長并誘發(fā)腫瘤消退(圖6所示)。腫瘤組織固定、切片后進行 ⑶31免疫組化分析計算微血管密度，結(jié)果表明治療組腫瘤組織的微血管密度顯著低于對照 組(圖7所示)。本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制，本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)做 各種改變。這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種人源性VEGF-A蛋白，其從N端到C端的氨基酸序列為APMAEGGGQN HHEVVKFMDV YQRSYCHPIE TLVDIFQEYP DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVP TEESNITMQI MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRSLTRK D。
2.—種核酸分子，其特征在于編碼權(quán)利要求1所述蛋白氨基酸序列的DNA核苷酸序列。
3.一種基因載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述核酸分子。
4.權(quán)利要求1所述蛋白在制備治療腫瘤或血管生成性視網(wǎng)膜病變藥物中的用途。
5.權(quán)利要求3所述基因載體在制備治療腫瘤或血管生成性視網(wǎng)膜病變藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述用途，其特征是所述藥物為注射劑、粉劑、片劑、膠囊劑、溶 液、懸浮劑或乳劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述用途，其特征是所述藥物的給藥途徑為口服、經(jīng)皮注射、靜 脈注射或肌肉注射。
8.—種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1所述蛋白，以及藥學上可以接受的載體。
9.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求3所述基因載體，以及藥學上可以接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)蛋白以及編碼該蛋白的多核苷酸。該蛋白具有抑制新血管生成的生物活性。該蛋白的氨基酸序列中沒有肝素結(jié)合位點、基質(zhì)金屬蛋白酶識別位點和纖溶酶識別位點，因此生物穩(wěn)定性較高。同時，該蛋白分子量較小，易于穿透組織到達病灶發(fā)揮其抗血管生成作用。本發(fā)明還公開了該蛋白和編碼該蛋白的核酸在制備治療腫瘤或新血管生成性視網(wǎng)膜病變的藥物中的用途。
文檔編號C12N15/12GK102070712SQ20101058106
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者李立文 申請人:李立文