專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物Ⅱ及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的鑒定花椰菜抗黑腐病的引物Ii及其利用該引物序列鑒 定花椰菜抗黑腐病的方法。
背景技術(shù)：
黑腐病是由黃單胞桿菌屬細(xì)菌(Xanthomonascam pestrispv. cam pestris)引起， 不僅危害甘藍(lán)類(lèi)蔬菜，且危害其他十字花科蔬菜。在世界多數(shù)地區(qū)，病害的發(fā)生常常是毀滅 性的。近年來(lái)由于人民生活水平的提高，花椰菜種植面積不斷擴(kuò)大，而生態(tài)環(huán)境又適宜該病 的發(fā)生蔓延。因此，花椰菜黑腐病呈逐年加重趨勢(shì)，嚴(yán)重影響花椰菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。該病菌主要危害花椰菜的葉片，有時(shí)也危害花球。幼苗受害時(shí)，子葉呈水浸狀并逐 漸變褐枯萎，或蔓延至真葉，使葉片的葉脈呈長(zhǎng)短不等的小條斑。成株期發(fā)病，病菌多從葉 緣水孔和傷口處入侵，自葉緣開(kāi)始向內(nèi)形成“V”形黃褐色病斑，致病葉發(fā)黃，葉脈變黑，如病 菌侵入莖部維管束，可引起植株萎蔫?；ㄇ蚴芎?，一般從花梗開(kāi)始，顏色變成灰黑色，最后小 花球呈灰黑色干腐狀，失去食用價(jià)值?；ㄒ说目共∮N是提高產(chǎn)量和質(zhì)量的有效途徑之一，抗病品種的選育已成為花 椰菜育種的長(zhǎng)久目標(biāo)，目前采用田間接種鑒定植株抗病性費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且易受環(huán)境等多種 因素的影響，準(zhǔn)確度差。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展可以 為這些研究提供準(zhǔn)確、快捷的輔助手段。由于DNA分子標(biāo)記不存在表達(dá)與否的問(wèn)題，可以直 接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到，不受取材部位、時(shí)間、 發(fā)育時(shí)期和環(huán)境的影響，信息量大，準(zhǔn)確率高，為抗黑腐病品種的早期篩選、縮短抗病育種 年限帶來(lái)廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有篩選抗病品種技術(shù)的不足，提供一種快速、早期篩選花 椰菜抗黑腐病品種的引物序列，和利用該引物鑒定花椰菜抗黑腐病品種的鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下鑒定花椰菜抗黑腐病的引物II，它由引物序列II-S和引物序列II-A組成。一種使用特異引物II鑒定花椰菜抗黑腐病品種的方法，它包括如下步驟(1)花 椰菜基因組DNA提取。O)PCR擴(kuò)增；在0. 2ml PCR專(zhuān)用薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液 2. 5 μ lUOmmol/LdNTPO. 5μ 1、10 μ mol/L 引物序列 II-S 和引物序列 II-A 各 0. 5 μ 1、花椰 菜基因組DNA 50-100ng、Taq聚合酶2U、無(wú)菌水補(bǔ)至25 μ 1，將裝有上述溶液的PCR專(zhuān)用薄 壁離心管放入PCR擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性180秒，94°C變性45秒，56°C退火45 秒、72°C延伸60秒，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸480秒，擴(kuò)增完成。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配置1. 2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0. 5μ g/ml)； 在5μ1擴(kuò)增產(chǎn)物中及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker分別加入Ιμ 6Χ上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒(méi)TBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，120V恒電壓，電泳1800秒 后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長(zhǎng)或在凝膠成像儀上進(jìn)行觀(guān)察。(4)依 照標(biāo)準(zhǔn)DNA marker帶在凝膠上的位置鑒定花椰菜是否抗黑腐病。


圖1是利用特異引物II和方法對(duì)已知抗、感黑腐病花椰菜檢測(cè)結(jié)果的電泳圖，1， 為標(biāo)準(zhǔn)分子量marker，2-10為抗病植株，特異條帶為400bp ； 11-20為感病植株的檢測(cè)結(jié)果， 無(wú)400bp條帶圖2是利用特異引物II和方法進(jìn)行田間隨機(jī)檢測(cè)結(jié)果的電泳圖，顯示400bp條帶 的為抗病植株，未顯示條帶的為感病植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例子和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明利用引物II，對(duì)花椰菜抗黑腐病和感黑腐病植株的檢測(cè)方法，具體步驟如下(1)采用CTAB方法提取花椰菜基因組DNA 取幼嫩花椰菜葉片200mg，在液氮里 研成粉末，移入IOml離心管中，加入^iICTAB裂解液，56°C保溫30分鐘，加入等體積的酚、 氯仿，充分混勻后，離心，取上清加入細(xì)1氯仿、異戊醇，混勻后離心，取上清加入等體積的 異丙醇，-20°C靜止2小時(shí)，IOOOOg離心20分鐘，去上清，沉淀用75 %的乙醇漂洗后風(fēng)干， 加入50 μ L無(wú)菌水溶解DNA沉淀，取5 μ L電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和計(jì)算DNA的含量；(2) PCR擴(kuò) 增在0.2ml PCR專(zhuān)用薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液2. 5μ l、10mmol/L dNTP 0. 5μ1、 ΙΟμπιοΙ/L引物序列II-S和引物序列II-A各0.5 μ 1、花椰菜基因組DNA 80ng、Taq聚合 酶2U、無(wú)菌水補(bǔ)至25μ 1，將裝有上述溶液的PCR專(zhuān)用薄壁離心管放入PCR擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增 條件為94°C預(yù)變性180秒，94°C變性45秒，56 °C退火45秒，72°C延伸60秒，擴(kuò)增30個(gè)循 環(huán)，最后72°C延伸480秒，擴(kuò)增完成。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配置1. 2% 的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5μ1擴(kuò)增產(chǎn)物中及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性 Marker中分別加入1 μ 1 6X上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒(méi)TBE 電泳液的瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，120V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外 燈下(紫外波長(zhǎng)沈5歷)或在凝膠成像儀上進(jìn)行觀(guān)察。(4)依照標(biāo)準(zhǔn)DNA marker帶在凝膠 上的位置鑒定花椰菜是否抗黑腐病。圖1為已知感抗黑腐病花椰菜植株的檢測(cè)，1為分子量 標(biāo)準(zhǔn)marker，箭頭示500bp ；2-10為抗黑腐病花椰菜植株，具有400bp的條帶，11-20為不抗 黑腐病的花椰菜植株；21為陽(yáng)性對(duì)照，圖2為田間隨機(jī)采集的抗、感黑腐病的花椰菜植株， 與陽(yáng)性對(duì)照相比，凡是具有400bp條帶的為花椰菜抗黑腐病植株。
權(quán)利要求
1.鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物II，其特征在于它由引物序列II-S 5，ATACAGGCACAGACACACTCGC3，和引物序列 II-A :5，TGTCCCTCCCTCAAAGCCATCT3，組成。
2.一種使用權(quán)利要求1的鑒定花椰菜抗黑腐病的方法，包括如下步驟(1)提取花椰菜 基因組DNA;(2)基因組DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(3)特異引物PCR擴(kuò)增，在PCR 擴(kuò)增專(zhuān)用離心管中加入PCR緩沖溶液、dNTP、引物序列II-S和引物序列II-A、花椰菜基因 組DNA、Taq聚合酶、無(wú)菌水補(bǔ)至25微升，將裝有上述液體的PCR專(zhuān)用薄壁離心管放入PCR 擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增條件為94°C變性180秒，后進(jìn)行94°C變性30秒，56°C退火45秒，72°C延伸 60秒的擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)數(shù)為30，最后在72°C延伸480秒，擴(kuò)增完成。G)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)配置1. 2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0. 5微克/毫升)； 在5微升擴(kuò)增產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker中分別加入1微升6X上樣緩沖液，混勻，用移液器 將上述混合液分別加入浸沒(méi)TBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，120V恒電壓，電泳1800 秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長(zhǎng)或在凝膠成像儀上進(jìn)行觀(guān)察。(5) 結(jié)果判讀依照標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產(chǎn)物的遷移位置判斷花椰菜 抗、感黑腐病情況。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一對(duì)用于花椰菜抗黑腐病鑒定的特異引物II和鑒定方法，引物II由引物序列II-S5’ATACAGGCACAGACACACTCGC3’和引物序列II-A5’TGTCCCTCCCTCAAAGCCATCT 3’組成。使用上述引物II鑒定花椰菜抗黑腐病的方法包括4個(gè)步驟(1)花椰菜基因組DNA的提取及檢測(cè)；(2)特異引物對(duì)的PCR擴(kuò)增；(3)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)；(4)結(jié)果判讀依據(jù)被檢測(cè)花椰菜基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果鑒定被檢花椰菜是否抗黑腐病。采用上述方法鑒定的結(jié)果與田間吻合率達(dá)95％以上。該方法在花椰菜抗黑腐病種質(zhì)或植株篩選上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108401SQ20101058119
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者孫德嶺, 宋文芹, 王春國(guó), 郝擘, 陳成彬 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)