專利名稱：一種β-1,4-內切葡聚糖酶基因的克隆及重組酶的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一種糖苷水解酶 12家族的β-1，4-內切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆，β-1，4-內切葡聚糖酶 工程菌的構建以及重組β_1，4-內切葡聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬于生物工程技 術領域。
背景技術：
纖維素是植物細胞壁最主要的結構成分，連同半纖維素占據了地球上可再生有 機碳源的一半以上。纖維素酶是指能水解纖維素β _1，4葡萄糖苷鍵生成纖維二糖和葡 萄糖的一組酶的總稱，主要包括內切葡聚糖(end0-l，4-i3-gluCanase，EC 3. 2. 1. 4，簡稱 EG)、外切葡聚糖酶(exo-l,4-^-glucanase, EC 3. 2. 1. 91，簡稱CBH)和β -葡萄糖苷酶 (β -glucosidase,EC 3. 2. 1. 21，簡稱BG) 3大類，在該3種酶的協同作用下可以把纖維素水 解成葡萄糖。目前纖維素酶已被廣泛的應用于食品、飼料、紡織、造紙、生物燃料和發(fā)酵等工 業(yè)領域。纖維素酶的種類繁多，在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases,GH)第3、5、7、8、9、 12等家族中都有分布，其中多數屬于糖苷水解酶第5家族(GH5)和12家族(GH12)；纖維素 酶的來源也很廣，大多數纖維素酶主要來自微生物，自20世紀60年代以來，據不完全統(tǒng)計， 國內外共記錄了產纖維素酶的菌株大約已有53個屬的幾千個菌株，主要包括細菌、真菌和 放線菌。真菌是工業(yè)用纖維素酶的重要來源，主要有里氏木霉(Trichoderma reesei)、綠 色木霄(Trichoderma viride)、康寧木霄(Trichoderma koningii)、黑( (Aspergillus niger)、斜臣卜青霉(Penicillium decumbens)、嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophile)禾口嗜 熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)等，目前研究最多且最清楚的是里氏木霉T. reesei。 但有關來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)GH12的β-內切葡聚糖酶基因(Aus cell2A)的克隆和表達等的研究未見有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種宇佐美曲霉EOOl菌株新型β-1，4_內切葡聚糖酶基因 完整mRNA和DNA序列克隆，β -內切葡聚糖酶工程菌的構建以及重組β -內切葡聚糖酶的 高效表達和純化的方法。生物信息學分析表明，來源于宇佐美曲霉EOOl菌株的一種新型 β -內切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第12家族，命名為Aus Cel 12Α，其相應的基因命名為Aus cell2A。Aus Cell2A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產和應用潛力及 經濟價值。本發(fā)明的技術方案一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株新型 Aus Cel 12A基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。獲 取完整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。A. usamii E001菌株由江南大學篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內向公眾發(fā)放。所述的由完整mRNA序列推導的Aus Cell2A氨基酸序列為SEQ ID NO :3。所述的重組Aus Cell2A的活性測定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 5. 0、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液配制的 質量濃度為0.5%的β-葡聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C預熱lOmin，在A管中加入 0. ImL適當稀釋的酶液，50°C準確反應20min ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸 (DNS)試劑，在B管中再補加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻后各加去離子水5mL， 搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從葡萄糖標準曲線上查出相應的還 原糖(以葡萄糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分 鐘產生1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個β -1,4-葡聚糖酶活性單位(U)。所述的Aus cell2A完整mRNA和DNA序列的克隆和表達方法(I)Aus cell2A 3'端mRNA序列的克隆首先對Aspergillus kawachii (GenBank D12901)、Aspergillus niger(GenBank AJ224451)禾口 Aspergillus terreus (GenBank XM_001214697)GH12的β -內切葡聚糖酶序列進行同源比對，找出兩段約10個氨基酸的保 守序列；再對該兩段氨基酸序列的mRNA進行同源比對，設計兩條正向簡并引物Cell2A-3Fl 和 Cell2A-3F2。Cell2A-3Fl 5' -TA(T/C)GACAG(T/C)GC(G/C)TCGAGCCC-3‘Cell2A-3F2 5‘ -GTGAA(A/G)AGCTACTC(T/G)AACTC-3‘提取A.usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)說明書進行 RT-PCR擴增。將兩輪PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 pUCm-T載體連接(pUCm-T-ce112A3')，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得 至Ij Aus cell2A3'端 mRNA 序列。(2)Aus cell2A 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端mRNA 序列，設計兩條反向引物Cell2A-5Rl和Cell2A_5R2。Cell2A-5Rl 5' TTGTCCTGCTTCCATTCCAC-3‘Cell2A-5R2 5' ACATCACTCACGAGCTTCTT-3‘按照TaKaRa 5' -Full RACE Kit說明書進行5' -RACE。將兩輪PCR產物用1 %瓊 脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cell2A5')，轉化JM109， 經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus cell2A 5'端mRNA序列。(3)Aus cell2A 5'端啟動子序列的克隆采用先前我們發(fā)明的一種T載體介導 的PCR方法，以經處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以T-PrimerF和 Cell2A-5Rl為引物，第二輪PCR以T-PrimerF ^P Cell2A_5R2為引物。將兩輪PCR產物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cell2AP)，轉化JM109， 經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus cell2A 5'端啟動子序列。(4)Aus cell2A 3'端轉錄終止區(qū)的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端 mRNA序列，設計兩條正向引物Cell2A-3F3和Cell2A_3F4。Cell2A-3F3 5' -GTGTCAGAAAGCCCTATCAA-3‘Ge112A-3F4 5‘ -CAGCTATCTCACTCAGAACC-3‘采用先前我們發(fā)明的一種T載體介導的PCR方法，以經處理的A. usamii EOOl基因
5組DNA為模板，第一輪PCR以Cell2A-3F3和T-PrimerR為引物，第二輪PCR以Cell2A_3F4 和T-PrimerR為引物。將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 pUCm-Τ連接(pUCm-T-ce112A3T)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus cell2A 3'端轉錄終止區(qū)序列。(5) Aus eel 12A的生物信息學分析將Aus eel 12A的5 ‘和3 ‘端mRNA序列進行 拼接，得到自轉錄起始位點至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架(Open ReadingFrame)進行分析，進而推導出Aus Cell2A的氨基酸序列；進行信號肽預測。將Aus cell2A的編碼區(qū)DNA序列與其兩側序列進行拼接，獲得完整DNA序列，并對其5'端啟動子 區(qū)域和3'端轉錄終止區(qū)的功能進行預測。(6) Aus cell2A內含子序列的測定基于上述得到的Aus eel 12A完整mRNA序列， 設計一對引物 Cell2A-Fl 和 Cell2A_R。Cell2A-Fl 5' GAATTCATGAAGCTCCCTGTGACAC-3 ’，含 EcoR I 酶切位點Cell2A-R 5' GCGGCCGCCTAGTTGACACTGGCGGTC-3 ’，含 Not I 酶切位點以 A. usamii EOOl 基因組 DNA 為模板，Cell2A_Fl 和 Cell2A_R 為引物進行 PCR，將 其產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cell2A-DNA)， 轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus eel 12A的編碼區(qū)DNA序列。將編 碼區(qū)DNA序列與mRNA序列用DNAMAN 6. O進行序列比對，得出Aus cell2A的2個內含子序 列。(7)含編碼Aus Cell2A成熟肽基因的表達質粒的構建基于上述得到的Aus cell2A完整mRNA序列以及預測的信號肽序列，設計一條正向引物Cel 12A-F。Cell2A-F 5' -GAATTCCAGACGATGTGCTCTCAAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用說明書進行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor I^rimer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和 Cell2A-F為引物進行第一輪PCR;以Cell2A_F和Cell2A_R為引物進行第二輪PCR。 將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-Τ連接 (pUCm-T-ce112A)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-cel 12A與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進 行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pPIC9K-cell2A(圖2)，并對重組質粒進行序列測定。(8)GS115/cell2A的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K_cell2A 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ cell2A ；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定β -1,4-內切葡聚糖酶活性； 發(fā)酵液經冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，得到電泳純的重組β_1，4-內切 葡聚糖酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種宇佐美曲霉EOOl菌株新型β-1，4-內切葡 聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列克隆，β -內切葡聚糖酶工程菌的構建以及重組β _內切 葡聚糖酶的高效表達和純化的方法，并對序列進行生物信息學分析。生物信息學分析表明 來源于宇佐美曲霉EOOl的一種新型β -內切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶的第12家族，命名 為Aus Cell2A，其相應的基因命名為Aus cell2A0 Aus Cell2A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產、應用潛力和經濟價值。


圖1 獲取A. usamii EOOl Cell2A基因完整mRNA和DNA序列的流程2 重組質粒pPIC9K_cell2A的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例IAus cell2A 3'端mRNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Cell2A-3Fl為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C 2min，30個循環(huán)(94°C 30s， 52°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；以 M13 Primer M4 和 Cell2A_3F2 為引物進行第二輪 PCR， 其反應條件為:94°C 2min, 30 個循環(huán)(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s)，72°C lOmin。將兩輪PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cell2A3')，轉 化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例2Aus ce 112A 5'端mRNA序列的克隆以 5 ‘ -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 Cell2A_5Rl 為引物進行第一輪 PCR，其反應條件為94°C 3min，30 個循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；以 Inner Primer和Cell2A_5R2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 3min,30個循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin0將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析， 回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cell2A5')，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上 海生工測序。實施例3Aus cell2A 5'端啟動子序列的克隆以經處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以T-PrimerF和 Cell2A-5Rl 為引物，反應條件為94°C 4min，30 個循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s)， 72°C IOmin ；第二輪PCR 以 T-PrimerF和 Cell2A_5R2 為引物，反應條件為94°C，4min，30 個 循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin。將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳 分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cell2AP)，轉化JM109，經酶切鑒定正確 后送上海生工測序。實施例4Aus cell2A 3'端轉錄終止區(qū)的克隆以經處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以Cell2A_3F3和 T-PrimerR 為引物，反應條件為94°C 4min，30 個循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 Cell2A_3F4 和 T-PrimerR 為引物，反應條件為94°C 4min，30 個 循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin0將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳 分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cell2A3T)，轉化JM109，經酶切鑒定正 確后送上海生工測序。實施例5含編碼Aus Cel 12A成熟肽基因的表達質粒的構建以Oligo dT-Adaptor I^rimer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以Cell2A-F和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR，反應條件為94°C 2min，30個循環(huán) (94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；以 Cell2A_F 禾口 Cell2A_R 為引物進行第二輪 PCR，反應條件為94°C 2min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 45s)，72°C IOmin0 將第二 輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-ce112A)， 轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-Cell2A與 PPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4 DNA連接酶的作用下 進行連接，得到重組質粒pPIC9K-cell2A，并對重組質粒進行序列測定。實施例6GS115/cell2A的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K-cell2A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩 選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/cell2A。該基因工程菌用1.0%甲醇誘導表達 96h，采用DNS法測得發(fā)酵液中重組β-內切葡聚糖酶活性達MOU/mL。發(fā)酵液經離心后 的上清液為重組AusCell2A粗酶液，該粗酶液經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經 DEAE-Sepharose !^astFlow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層析純化，純化后經 SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組Aus Cell2A的分子量為27kDa。該重組Aus Cell2A 的最適作用溫度60°C，最適作用pH 5.0，該酶在？!1 4.0-7.0、60°C以下穩(wěn)定。
權利要求
1.一種來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株糖苷水解酶第12家族 (GHl2)的新型β-1，4-內切葡聚糖酶基因(Aus cell2A)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序 列分別為 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.由權利要求1所述的葡聚糖酶基因(Auscell2A)編碼的新型β_1，4_內切葡聚糖 酶(AusCel 12Α)，其完整的氨基酸序列對應于序列表中的為SEQ ID NO :3。
3.Aus cell2A完整mRNA和DNA序列的獲取方法(1)Auscell2A 3'端mRNA序列的克隆首先對Aspergillus kawachii,AspergiIlus niger和Aspergillus terreus GHl2的β -內切葡聚糖酶的氨基酸序列進行同源比對，找 出兩段約10個氨基酸的保守序列，再對該兩段氨基酸序列的mRNA進行同源比對，設計兩條 正向簡并引物Cell2A-3Fl和Cell2A_3F2 ；Ce112A-3F1 5 ‘ -TA(T/C)GACAG(T/C)GC(G/C)TCGAGCCC-3‘Ce112A-3F2 5 ‘ -GTGAA (A/G)AGCTACTC(T/G)AACTC-3‘以A. usamii EOOl總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成 cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Cell2A_3Fl為引物進行第一輪PCR，其反應條件 為94°C 2min，30 個循環(huán)(94 °C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 90s) ,72 °C IOmin ；以 M13 Primer M4 和Cell2A-3F2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 2min，30個循環(huán)(94°C 30s, 52°C 30s，72°C 90s)，72°C IOmin ；目的條帶經克隆、測序，得到 Aus cell2A 3'端 mRNA 序 列；(2)Auscell2A 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端mRNA序 列，設計兩條反向引物Cell2A-5Rl和Cell2A_5R2 ；Cell2A-5Rl 5' -TTGTCCTGCTTCCATTCCAC-3‘Ce112A-5R2 5‘ -ACATCACTCACGAGCTTCTT-3‘以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板、Outer Primer和Cell2A_5Rl為引物進行第一 輪 PCR，其反應條件為94°C 3min，30 個循環(huán)(94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)，72°C IOmin ；以 Inner Primer和Cell2A_5R2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 3min,30個循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的條帶經克隆、測序，得到 Aus cell2A 5' 端mRNA序列；(3)Auscell2A 5'端啟動子序列的克隆以經處理的A. usamii EOOl基因組DNA為 模板，第一輪PCR以T-PrimerF和Cell2A_5Rl為引物，反應條件為94°C 4min,30個循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 T-PrimerF 和 Cell2A_5R2 為引 物，反應條件為94°C，4min, 30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的條 帶經克隆、測序，得到Aus cell2A 5'端啟動子序列；(4)Auscell2A 3'端轉錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端 mRNA序列，設計兩條正向引物Cell2A-3F3和Cell2A_3F4 ；Ce112A-3F3 5 ‘ -GTGTCAGAAAGCCCTATCAA-3‘Ce112A-3F4 5‘ -CAGCTATCTCACTCAGAACC-3‘以經處理的A. usami i EOO1基因組DNA為模板，第一輪PCR以Ce 112A-3F3和T-Pr imerR 為引物，第二輪PCR以Cell2A-3F4和T-PrimerR為引物；目的條帶經克隆、測序，得到 Auscell2A 3'端轉錄終止區(qū)序列；
4. Aus Cel 12A工程菌的構建和表達方法(1)含編碼AusCell2A成熟肽基因的表達質粒的構建以M13 Primer M4和 Cell2A-F 為引物進行第一輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 60s ； 72°C IOmin)；以 Cell2A_F 和 Cell2A_R 為引物第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53 °C 30s，72 °C 45s ；72 °C lOmin)；將第二輪PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的 pUCm-T-cell2A與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4 DNA 連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-cell2A，并對重組質粒進行測序鑒定；(2)GS115/cell2A的構建、表達、產物純化及活性測定用SalI對pPIC9K-cell2A進 行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ cell2A ；該工程菌用1. 0%甲醇誘導96h，DNS法測得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達MOIU/ mL。發(fā)酵液經離心后的上清液為重組β -內切葡聚糖酶粗酶液，經截留分子量為IOkDa的 超濾膜濃縮，再經DEAE-kpharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層 析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組葡聚糖酶分子量為27kDa ；該重組 葡聚糖酶最適作用溫度60°C，最適作用pH
5.0，該酶在？!1 3.0 7.0、601以下穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的β-1，4-內切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息學分析表明該β-內切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第12家族，命名為Aus Cel12A，其氨基酸序列為SEQ ID NO3，相應的基因命名為Aus cel12A。本發(fā)明還公開了Aus Cel12A工程菌的構建以及重組Aus Cel12A的高效表達和純化的方法。制備的重組Aus Cel12A的最適作用溫度和pH分別為60℃和5.0，在pH 4.0-7.0、60℃以下穩(wěn)定，具有較大的工業(yè)化生產潛力和經濟價值，也為其它β-內切葡聚糖酶的研究奠定了理論基礎。
文檔編號C12N9/42GK102127555SQ201010581299
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權日2010年12月10日
發(fā)明者劉高磊, 史紅玲, 鄔敏辰, 郭靜, 韋敬土 申請人:江南大學