專利名稱：一種β-1,4-內切木聚糖酶(Xyn11A)基因的克隆及表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一種新型β-1， 4-內切木聚糖酶(Aus XynllA)基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析，β-1，4-內切木 聚糖酶工程菌的構建以及重組β_1，4-內切木聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬于生物 工程技術領域。
背景技術：
木聚糖是植物細胞壁第二大物質半纖維素的重要組成部分，來源廣泛，可由林業(yè)、 農業(yè)、木材加工以及造紙等工業(yè)的副產品獲得。木聚糖是一類復雜的多糖聚合物，其主鏈 主要是由木聚糖殘基以β _1，4糖苷鍵構成，而根據菌株來源的的不同，木聚糖的側鏈可以 被阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、乙酰基等殘基取代，由于成分復雜，木聚糖需要包括木聚糖酶、 β -D-木糖苷酶、葡糖糖醛酸酶以及α -L-阿拉伯呋喃糖酶等的共同作用才能夠被徹底降解。β-1,4-內切木聚糖酶(endo-3-l，4-xylanase，EC 3. 2. 1.8)是一類能夠專一降 解木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱，主要從主鏈內部作用于木糖苷鍵，是木聚糖 降解過程中最重要的酶之一。能夠產生木聚糖酶的微生物有很多，包括絲狀真菌、細菌、放 線菌等。微生物中木聚糖酶由于來源菌株不同而導致其理化性質和分子量不盡相同，其分 子量從7. 7到150kDa都有分布，絕大多數在20 30kDa之間，最適pH值在2 10. 5都有 分布。根據木聚糖酶催化區(qū)域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解 酶第10家族和第11家族居多。在過去20年中，有大量的木聚糖酶被分離純化出來，它們 的基因已經被克隆，并在大腸桿菌、釀酒酵母、畢氏酵母等表達系統(tǒng)中進行了表達。木聚糖 酶已廣泛應用于食品、飼料、造紙和能源等工業(yè)領域?，F如今，木聚糖酶以及纖維素酶和果 膠酶已經占據全球工業(yè)酶市場的20%左右，因此木聚糖酶的開發(fā)與應用具有較大的市場潛 力和應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新型β -1，4-內切木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列 的克隆和分析，β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建以及重組β-1，4-內切木聚糖酶的高 效表達和純化的方法。根據Bernard Henrissat等人提出的糖苷水解酶分類法，多數木聚 糖酶屬于糖苷水解酶第10和11家族。生物信息學分析表明該基因所編碼的β-1，4-內切 木聚糖酶屬于A.usamii EOOl中發(fā)現的第一種11家族木聚糖酶，命名為Aus XynllA(隨后 發(fā)現的有:Aus XynllB、XynllC 和 XynllD)，具相應的基因命名為 Aus XynllA0 Aus XynllA 具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產和應用潛力以及經濟價值。本發(fā)明的技術方案一種源自A. usamii EOOl的β -1,4-內切木聚糖酶基因(Aus xynllA)，其完整mRNA和DNA序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2。獲取完整mRNA和 DNA序列的流程如圖1所示。A. usamii EOOl菌株由江南大學篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內向公眾發(fā)放。所述的由完整mRNA序列推導的Aus XynllA氨基酸序列為SEQ ID NO :3。所述的重組Aus XynllA的活性測定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸_Na2HP04緩沖液配制的質量 濃度為0.5%的樺木木聚糖(Sigma5USA)溶液2. 4mL，50°C預熱lOmin，在A管中加入0. ImL 適當稀釋的酶液，50°C反應15min ；立即各加入2. 5mL 3'，5' _ 二硝基水楊酸(DNS)試劑， 在B管中再補加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm 處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖 計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生1 μ mol 還原糖所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位(IU)。所述的Aus XynllA完整mRNA和DNA序列的克隆和表達方法(I)Aus xynllA 3'端mRNA序列的克隆首先分離純化A. usamii EOOl菌株所產 木聚糖酶Aus Xynl 1A，并測得其N木端序列；然后依據該酶蛋白N末端氨基酸序列設計兩 條正向簡并引物XynllA-Fl和XynllA_F2。XynllA-Fl 5' -TC(C/G)AC(C/T)CC(G/C)AG(C/T)TC(C/G)AC(C/T)GG-3‘Xyn11A-F2 5' -GG(C/T)GA(G/C)AA(C/G)AA(C/G)GG(C/T)TT(C/G)TA-3‘提取A. usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNAPCR Kit (Ver. 3. 0)說明書進行 RT-PCR擴增。將兩輪PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 pUCm-T載體連接(pUCm-T-XynllA3')，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得 到 Aus xynllA3'端 mRNA 序列。(2) Aus xynllA 5'端mRNA序列的克隆基于步驟(1)獲得的Aus xynllA 3'端 mRNA序列，設計兩條反向引物XynllA-Rl和XynllA_R2。XynllA-Rl 5' -GTCCAGAAGGAGTAGTAGA-3‘XynllA-R2 5' -AGCGTCACCGTTGGTGTA-3‘按照CloniTech 的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit 說明書進行 5' -RACE。 將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接 (pUCm-T-xynllA5')，轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工測序，得到Aus xynllA 5'端 mRNA序列。(3)Aus xynllA 5'端啟動子序列的克隆利用一種連接介導的PCR擴增法(Wu Minchenet al. Cloning of an alkaline lipase gene from Penicillium cyclopium and its expression inEscherichia coli，Lipids, 2003，Vol. 38，No. 3，Pg. 191)，以處理后的 A. usamii EOOl 基因組 DNA 為模板，LP(5' -GGATCCCTTCACTCTCAAG-3‘)和 XynllA-Rl 為 引物進行第一輪PCR，LP和XynllA-R2為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR產物用瓊脂 糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllAP)，轉化JM109，經酶 切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllA 5'端啟動子序列。(4)Aus xynllA 3'端轉錄終止區(qū)序列的克隆基于步驟(1)獲得的Aus xynllA 3 ‘端mRNA序列，設計兩條正向引物Xynl 1A-F3和Xynl 1A-F4。XynllA-F3 5' -CTAAGCTGGGAATGAACCTG-3‘Xyn11A-F4 5‘ -TACTCACAACTACCAGATCG-3‘
利用一種連接介導的PCR擴增法，以處理后的A. usamii EOOl基因組DNA為模板， LP和XynllA-F3為引物進行第一輪PCR，LP和XynllA-F4為引物進行第二輪PCR。將兩輪 PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-XynllA3T)， 轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工測序，得到Aus xynllA 3'端轉錄終止區(qū)序列。(5) Aus xynllA的生物信息學分析將Aus xynllA的5‘和3‘端mRNA序列進行 拼接，得到自轉錄起始位點至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架(Open ReadingFrame)進行分析，進而推導出Aus XynllA的氨基酸序列；進行信號肽預測。將Aus xynllA的編碼區(qū)DNA序列與其兩側序列進行拼接，獲得完整DNA序列，并對其5'端啟動子 區(qū)域和3'端轉錄終止區(qū)的功能進行預測。(6)含編碼Aus XynllA成熟肽基因的表達質粒的構建基于步驟(5)獲得的Aus xynllA完整mRNA序列以及預測的信號肽序列，設計一對引物XynllA-F和Xynl 1A-R，擴增 去除信號肽基因序列的成熟肽基因XynllA-F 5' ~GAATTCGTTCCCCACGACTCTGTC~3 ‘，含 EcoR I 酶切位點XynllA-R 5' -GCGGCCGCTTACTGAACAGTGATGGACG-3 ‘，含 Not I 酶切位點按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說明書進行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor I^rimer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以Ml3 Primer M4和XynllA-F為引物進 行第一輪PCR;以XynllA-F和XynllA-R為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR產物用瓊 脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllA)，轉化JM109，經 酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-xynl IA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進 行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pPIC9K-xynllA(圖2)，并對重組表達質粒進行序列測定。(7)GS115/xynllA的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K_xynllA 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子 GS115/xynllA ；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定重組木聚糖酶活性；發(fā) 酵液經冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種新型β-1，4-內切木聚糖酶基因完整mRNA 和DNA序列的克隆，β-1，4-內切木聚糖酶工程菌GS115/xynllA的構建以及重組β-1， 4-內切木聚糖酶的高效表達和純化的方法。生物信息學分析表明來源于宇佐美曲霉EOOl 的該木聚糖酶屬于糖苷水解酶第11家族，命名為Aus XynllA，其相應的基因命名為Aus xynllA。Aus XynllA具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產和應用潛力以 及經濟價值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎。


圖1 獲取A. usamii EOOl XynllA基因完整mRNA和DNA序列的流程2 重組質粒pPIC9K_xynllA的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳
6細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例IAus xynllA 3'端mRNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4 和 XynllA-Fl 為引物進行第一輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 45s ；72°C IOmin)；以第一輪PCR產物為模板、M13 Primer M4 和 XynllA_F2 為引物進行 第二輪PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)。將兩輪PCR產 物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllA3')， 轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例2Aus xynllA 5'端mRNA序列的克隆以 PCR Primer (ClonTech 公司)禾口 XynllA-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94°C 3min ； 30 個循環(huán)，94°C 30s，50°C 30s，72°C Imin ；72°C IOmin)；以 PCR Primer 和 Xyn 11A-R2 為引物 進行第二輪PCR(94°C 3min ；30個循環(huán)，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)。將兩輪 PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-xynl 1A5 ‘)， 轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例3Aus xynllA 5'端啟動子序列的克隆以 LP 和 XynllA-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94 °C 4min ;30 個循環(huán)，94 °C 30s, 60°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；以 LP 禾口 XynllA_R2 為引物進行第二輪 PCR(94°C 4min ； 30 個循環(huán)，94°C 30s, 60°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)。將兩輪 PCR 產物用 瓊脂糖凝膠 電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllAP)，轉化JM109，經酶切鑒定 正確后送上海生工測序。實施例4Aus xynllA 3'端轉錄終止區(qū)序列的克隆以 LP 和 Xynl 1A-F3 為引物進行第一輪 PCR(94 °C 4min ;30 個循環(huán)，94 °C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；以 LP 禾口 XynllA_F4 為引物進行第二輪 PCR(94°C 4min ； 30 個循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)。將兩輪 PCR 產物用 瓊脂糖凝膠 電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllA3T)，轉化JM109，經酶切鑒
定正確后送上海生工測序。實施例5含編碼Aus XynllA成熟肽基因的表達質粒的構建以Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4 和 XynllA-F 為引物進行第一輪PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s ； 72°C IOmin)；以 Xyn 11A-F 和 XynllA-R 為引物第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s ；72°C lOmin)。將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收 目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllA)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測 序。將測序正確的pUCm-T-xynllA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠 回收的酶切產物在jM DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-XynllA，并對 重組表達質粒進行序列測定。實施例6GS115/XynllA的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K-xynllA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩 選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/xynllA。該工程菌用1. 0%甲醇誘導72h，DNS法 測得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達^K)5IU/mL。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-kpharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G-75凝膠過濾層析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量 為25kDa。該重組木聚糖酶最適作用溫度50°C，最適作用pH 5.0，該酶在？!1 3. 0 7. 0、 50°C以下穩(wěn)定。
權利要求
1.一種來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的新型β_1，4_內切木聚糖酶 基因(Ausxynl 1Α)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別對應于序列表中的SEQ ID NO=I 和 SEQ IDNO :2ο
2.由權利要求1所述的木聚糖酶基因(AusxynllA)編碼的新型β_1，4_內切木聚糖 酶(AusXynl 1Α)，其完整的氨基酸序列對應于序列表中的為SEQ ID NO :3。
3.Aus xynllA完整mRNA和DNA序列的獲取方法(1)AusxynllA 3'端mRNA序列的克隆首先分離純化宇佐美曲霉EOOl菌株所產木聚 糖酶Aus Xynl 1A，并測得其N末端序列；再根據該酶蛋白質N末端序列設計兩條正向簡并 弓丨物 XynllA-Fl 禾口 XynllA_F2 ；XynllA-Fl 5' -TC(C/G)AC(C/T)CC(G/C)AG(C/T)TC(C/G)AC (C/T)GG-3‘Xyn11A-F2 5' -GG(C/T)GA(G/C)AA(C/G)AA(C/G)GG(C/T)TT(C/G)TA-3‘以 A. usamii EOOl 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成 cDNA 的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynllA-Fl為引物進行第一輪PCR(94°C 2min ；30個循 環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 45s ；72°C IOmin)；以第一輪 PCR 產物為模板、M13 Primer M4 和 XynllA-F2 為引物進行第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s ； 72°C IOmin)；目的條帶經克隆、測序，得到Aus xynllA 3'端mRNA序列；(2)AusxynllA 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus xynllA 3'端mRNA序 列，設計兩條反向引物XynlIA-Rl和XynllA-R2 ；XynllA-Rl 5' -GTCCAGAAGGAGTAGTAGA-3‘Xyn11A-R2 5‘ -AGCGTCACCGTTGGTGTA-3‘以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板、PCR和XynllA-Rl為引物進行第一輪PCR(940C 3min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；以 PCR Primer 和 XynllA-R2 為引物進行第二輪 PCR(94°C 3min ;30 個循環(huán)，94°C 30s, 50 °C 30s, 72 °C Imin ； 72°C IOmin)；目的條帶經克隆、測序，得到Aus xynllA 5'端mRNA序列；(3)AusxynllA 5'端啟動子序列的克隆以經處理的A. usamii EOOl基因組DNA為 模板，LP 和 XynllA-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94°C 4min ；30 個循環(huán)，94°C 30s,60°C 30s， 72 °C Imin ；72 °C IOmin) ；LP 和 XynllA_R2 為引物進行第二輪 PCR(94°C 4min ;30 個循環(huán)， 940C 30s, 600C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；目的條帶經克隆、測序，得到 Aus xynllA 5' 端啟動子序列；(4)AusxynllA 3'端轉錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus xynllA 3'端 mRNA序列，設計兩條正向引物Xynl 1A-F3和Xynl 1A-F4 ；Xyn11A-F3 5 ‘ -CTAAGCTGGGAATGAACCTG-3‘Xyn11A-F4 5 ‘ -TACTCACAACTACCAGATCG-3‘以處理后的A. usami i E001基因組DNA為模板，LP和Xyn 11A-F3為弓|物進行第一輪PCR 擴增(940C 4min ；30 個循環(huán)，94°C 30s，55°C 30s，72°C Imin ；72°C IOmin)；以 LP禾口 XynllA_F4 為引物進行第二輪 PCR(94°C 4min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)； 目的條帶經克隆、測序，得到Aus xynllA 3'端轉錄終止區(qū)序列。
4.Aus XynllA工程菌的構建和表達方法(1)含編碼Aus XynllA成熟肽基因的表達質粒的構建以M13 Primer M4和XynllA-F 為引物進行第一輪 PCR(94 °C 2min ；30 個循環(huán)，94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 90s ； 72°C IOmin)；以 Xyn 11A-F 和 XynllA-R 為引物第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53 °C 30s, 72。C 90s ；72。C IOmin)；將第二輪PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的 pUCm-T-xynllA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在iMDNA 連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-XynllA，并對重組質粒進行測序鑒定；(2)GS115/xynllA的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K-xynllA 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子 GS115/xynllA。該工程菌用1. 0%甲醇誘導7池，DNS法測得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達 ^05IU/mL。離心上清液為重組木聚糖酶相酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再 經DEAE-kpharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層析純化，純化后 經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為25kDa ；該重組木聚糖酶最適 作用溫度50°C，最適作用pH 5.0，該酶在？!1 3.0 7.0、501以下穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型β-1，4-內切木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。生物信息學分析表明該木聚糖酶屬于糖苷水解酶第11家族，命名為Aus Xyn11A，其氨基酸序列為SEQ ID NO3，相應的基因命名為Aus xyn11A。本發(fā)明還公開了Aus Xyn11A工程菌的構建以及重組Aus Xyn11A的高效表達和純化的方法，制備的重組Aus Xyn11A的最適作用溫度和pH分別為50℃和5.0，在pH 3.0-7.0、50℃以下穩(wěn)定，具有較大的工業(yè)化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N15/10GK102127557SQ20101058135
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權日2010年12月10日
發(fā)明者張慧敏, 李劍芳, 汪俊卿, 鄔敏辰 申請人:江南大學