專(zhuān)利名稱(chēng)：β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶基因(Aus cel5A)的克隆及分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一種糖苷水解酶 第5家族的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因(Aus cel5A)完整mRNA和DNA序列的克隆及分析， 屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
纖維素酶是指水解纖維素β _1，4葡萄糖苷鍵生成纖維二糖和葡萄糖的一組 酶的總稱(chēng)。一個(gè)完整的纖維素酶系主要由內(nèi)切葡聚糖酶(end0-l，4-i3-gluCanase， EC 3.2. 1.4)、外切葡聚糖酶(exo-l，4-0-glucanase，EC 3.2.1.91)和 β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase, EC 3. 2. 1. 21)組成。內(nèi)切葡聚糖酶首先隨機(jī)水解纖維素內(nèi)部的β _1， 4葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生大量的自由木端，再在外切葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶的協(xié)同作用下把 纖維素水解成葡萄糖。由于纖維素酶能將天然存在的纖維素降解成葡萄糖，嫩化植物材料， 破壞微生物和植物的細(xì)胞壁釋放蛋白質(zhì)等有用物質(zhì)，因此纖維素酶的研究和應(yīng)用受到各國(guó) 的極大關(guān)注，目前纖維素酶已被廣泛的應(yīng)用于食品、飼料、造紙和發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域。纖維素酶的種類(lèi)繁多，在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases, GH)第3、5、7、8、 9和12等家族中都有分布，多數(shù)屬于第5家族(GH5)和12家族(GH12)；纖維素酶的來(lái)源 也很廣，但大多數(shù)來(lái)自微生物，自20世紀(jì)60年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外記錄了產(chǎn)纖維素酶的菌株大 約已有53個(gè)屬的幾千個(gè)菌株，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌。真菌是工業(yè)用纖維素酶的 重要來(lái)源，主要有里氏木霉(Trichoderma reesei)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康 寧木霉(Trichodermakoningii)、黑曲霉(Aspergillus ntger)、斜臣卜青霉(Penicillium decumbens)、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophile)禾口嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)等，但有關(guān)來(lái)源于宇佐美曲霉(Aspergil lususami i) GH5的β-內(nèi)切葡聚糖酶 基因(Aus cel5A)的克隆和表達(dá)等的研究未見(jiàn)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于Aspergillus usamii EOOl菌株的新型β-1， 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析。生物信息學(xué)分析表明來(lái)源于宇 佐美曲霉EOOl的這種新型β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶的第5家族，命名為Aus Cel5A，其相應(yīng)的基因命名為Aus cel5A。這為該基因的異源表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論 基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。A. usamii EOOl菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜 志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開(kāi)，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。本發(fā)明的技術(shù)方案一種源自A. usamii EOOl菌株的β _1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因 (Aus cel5A)完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。獲取完 整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。所述的由完整mRNA推導(dǎo)的Aus Cel5A氨基酸序列為SEQ ID NO :3。
所述的Aus cel5A完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法(I)Aus cel5A 3'端 mRNA 序列的克隆首先對(duì) Aspergillus kawachii (GenBank AB055433)、Aspergillus niger (GenBank AF331518)禾口 Aspergillus aculeatus(GenBank AF054512)GH5的β -內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出兩段約10個(gè)氨基 酸的保守序列；再對(duì)該兩段氨基酸序列的mRNA進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)兩條正向簡(jiǎn)并引物 Cel5A-3Fl和 Cel5A_3F2。Cel5A-3Fl 5' -TCATAACTATGG(C/A)(A/C)GATACAAC-3‘Cel5A-3F2 5' -CAA(A/G)GA(T/C)AACGACCTGGTCAT-3‘提取A.usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。將兩輪擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 pUCm-Τ載體連接(pUCm-T-ce15A3 ‘)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得 到 Aus cel5A3'端 mRNA 序列。(2)Aus cel5A 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus cel5A 3'端mRNA序 列，設(shè)計(jì)兩條反向引物Cel5A-5Rl和Cel5A_5R2。Cel5A-5Rl 5' -CCGTTAATGGCTGCTTGGTTG-3‘Cel5A-5R2 5' -ATTCAGCACGAGATCCTGGTC-3‘按照TaKaRa的5' -Full RACE Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5' -RACE。將兩輪PCR產(chǎn)物用 瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cel5A5')，轉(zhuǎn)化
JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus cel5A 5'端mRNA序列。(3)Aus cel5A 5'端啟動(dòng)子序列的克隆采用先前我們發(fā)明的一種T載體介導(dǎo) 的PCR方法，以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以T-PrimerF和 Cel5A-5Rl為引物，第二輪PCR以T-PrimerF和Cel5A-5R2為引物。將兩輪PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cel5AP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶 切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus cel5A 5'端啟動(dòng)子序列。(4)Aus cel5A 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus cel5A 3'端 mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物Cel5A-3F3和Cel5A_3F4。Cel5A-3F3 5' -CGGACAATAAGAAGGTCGGC-3‘Ce15A-3F4 5‘ -CAATGATGTGTGTCGGAGTG-3‘采用先前我們發(fā)明的一種T載體介導(dǎo)的PCR方法，以經(jīng)處理的A.usamii EOOl基 因組DNA為模板，第一輪PCR以Cel5A-3F3和T-PrimerR為引物，第二輪PCR以Cel5A_3F4 和T-PrimerR為引物。將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 pUCm-Τ連接(pUCm-T-ce15A3T)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus cel5A 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列。(5) Aus cel5A的生物信息學(xué)分析將Aus cel5A的5 ‘和3 ‘端mRNA序列進(jìn)行拼 接，得到自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對(duì)開(kāi)放閱讀框架(Open ReadingFrame)進(jìn)行分析，進(jìn)而推導(dǎo)出Aus Cel5A的氨基酸序列，并進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。將Aus cel5A的編碼區(qū)DNA序列與其兩側(cè)序列進(jìn)行拼接，獲得完整DNA序列，并對(duì)其5'端啟動(dòng)子 區(qū)域和3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。(6) Aus cel5A內(nèi)含子序列的測(cè)定基于上述得到的Aus cel5A完整mRNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物 Cel5A-F 和 Cel5A-R。Cel5A-F 5' GAATTCATGAAGTTTCAGAGCACTTTG-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)Cel5A-R 5' GCGGCCGCTCAGAGATACGTCTCCAGGAT-3 ‘，含 Not I 酶切位點(diǎn)以A. usamu EOOl基因組DNA為模板，Cel5A_F和Cel5A_R為引物進(jìn)行PCR，將其產(chǎn) 物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cel5A-DNA)，轉(zhuǎn)化 JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus cel5A的編碼區(qū)DNA序列。將DNA與 mRNA序列用DNAMAN 6. 0進(jìn)行序列比對(duì)，便能得出Aus cel5A的5個(gè)內(nèi)含子序列。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種來(lái)源于A.USamii EOOl的糖苷水解酶第5 家族的β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列，并對(duì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分 析。這為該基因的異源表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛 力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其它β -內(nèi)切葡聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。


圖1 獲取A. usamii EOOl Cel5A基因完整mRNA和DNA序列的流程圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳 細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例IAus cel5A 3'端mRNA序列的克隆以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Cel5A-3Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 2min，30個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 52°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；以 M13 Primer M4 和 Cel5A_3F2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR， 其反應(yīng)條件為94°C 2min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 90s), 72 °C IOmin0 將兩輪 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-ce15A3 ‘)， 轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例2Aus cel5A 5'端mRNA序列的克隆以 5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 Cel5A_5Rl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR 擴(kuò) 增，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；以 Inner I^rimer和Cel5A_5R2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30個(gè)循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析， 回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cel5A5')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海 生工測(cè)序。實(shí)施例3Aus cel5A 5'端啟動(dòng)子序列的克隆以經(jīng)處理的A. usamii基因組DNA為模板，第一輪PCR以T-PrimerF和Cel5A_5Rl 為引物，反應(yīng)條件為:94°C 4min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；第 二輪 PCR 以 T-PrimerF 和 Ce 15A-5R2 為引物，反應(yīng)條件為94 °C，4min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s),72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條 帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-ce15AP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例4Aus cel5A 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆
以經(jīng)處理的A. usamii基因組DNA為模板，第一輪PCR以Cel5A_3F3和T-PrimerR 為引物，反應(yīng)條件為:94°C 4min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；第 二輪 PCR 以 Cel5A-3F4 和 T-PrimerR 為引物，反應(yīng)條件為94°C 4min, 30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 55 °C 30s, 72 °C 60s),72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條 帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-ce15A3T)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工測(cè)序。
實(shí)施例5Aus cel5A內(nèi)含子序列的測(cè)定以A. usami i EOO1基因組DNA為模板，Ce 15A-F和Ce 15A-R為弓丨物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條 件為:94°C 4min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s)，72°C IOmin0 將 PCR 產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Cel5A-DNA)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng) 酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus cel5A的編碼區(qū)DNA序列；將DNA序列與mRNA 序列用DNAMAN 6. 0進(jìn)行序列比對(duì)，便能得出Aus cel5A的5個(gè)內(nèi)含子序列。
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株的糖苷水解酶第5家族 (GH5)的新型β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因(Aus cel5A)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列 分別為 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.由權(quán)利要求1所述的葡聚糖酶基因(Auscel5A)編碼的新型β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶 (AusCel5A)，其完整的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的為SEQ ID NO :3。
3.Aus cel5A完整mRNA和DNA序列的獲取方法(1)Auscel5A 3'端 mRNA 序列的克隆首先對(duì) Aspergillus kawachii、Aspergillus niger和AspergiIlus aculeatus GH5的β -內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，找 出兩段約10個(gè)氨基酸的保守序列，再對(duì)該兩段氨基酸序列的mRNA進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)兩條 正向簡(jiǎn)并引物Cel5A-3Fl和Cel5A_3F2 ；Ce15A-3F1 5 ‘ -TCATAACTATGG(C/A)(A/C)GATACAAC-3‘Ce15A-3F2 5‘ -CAA (A/G)GA(T/C)AACGACCTGGTCAT-3‘以A. usamii EOOl總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Cel5A_3Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件 為94°C 2min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 90s), 72 °C IOmin ；以 M13Primer M4 和Cel5A-3F2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 2min，30個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 52°C30s，72°C90s)，72°C IOmin;目的條帶經(jīng)克隆、測(cè)序，得到 Aus cel5A 3'端mRNA序列;(2)Aus cel5A 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus cel5A 3'端mRNA序列， 設(shè)計(jì)兩條反向引物Cel5A-5Rl和Cel5A_5R2 ；Cel5A-5Rl 5' -CCGTTAATGGCTGCTTGGTTG-3‘Ce15A-5R2 5‘ -ATTCAGCACGAGATCCTGGTC-3 ‘以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板、Outer Primer和Cel5A_5Rl為引物進(jìn)行第一 輪 PCR,其反應(yīng)條件為:94°C 3min, 30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；以 Inner I^rimer和Cel5A_5R2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30個(gè)循環(huán) (94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)，72°C IOmin ；目的條帶經(jīng)克隆、測(cè)序，得到 Aus cel5A 5'端 mRNA序列；(3)Auscel5A 5'端啟動(dòng)子序列的克隆以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為 模板，第一輪PCR以T-PrimerF和Cel5A_5Rl為引物，反應(yīng)條件為94°C %iin，30個(gè)循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 T-PrimerF 和 Cel5A_5R2 為引 物，反應(yīng)條件為94°C，4min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的條 帶經(jīng)克隆、測(cè)序，得到Aus cel5A 5'端啟動(dòng)子序列；(4)Auscel5A 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus cel5A 3'端mRNA 序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物Cel5A-3F3和Cel5A_3F4 ；Ce15A-3F3 5‘ -CGGACAATAAGAAGGTCGGC-3‘Ce15A-3F4 5‘ -CAATGATGTGTGTCGGAGTG-3‘以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以Cel5A_3F3和T-PrimerR 為引物，第二輪PCR以Cel5A-3F4和T-PrimerR為引物；目的條帶經(jīng)克隆、測(cè)序，得到Aus cel5A3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列；(5)Aus cel5A內(nèi)含子序列的測(cè)定基于上述得到的Aus eel5A完整mRNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物 Cel5A-F 和 Cel5A-R ；Cel5A-F 5' -GAATTCATGAAGTTTCAGAGCACTTTG-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點(diǎn) Ce 15A-R 5 ‘ -GCGGCCGCTCAGAGATACGTCTCCAGGAT-3 ‘，含 NotI 酶切位點(diǎn) 以A. usamii EOOl基因組DNA為模板，Cel5A_F和Cel5A_R為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件 為:94°C 4min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s)，72°C IOmin ；目的條帶經(jīng)克隆、測(cè) 序，得到Aus cel5A的編碼區(qū)DNA序列；將DNA序列與mRNA序列用DNAMAN 6. 0進(jìn)行序列比 對(duì)，便能得出Aus cel5A的5個(gè)內(nèi)含子序列。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息學(xué)分析表明該β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，所以命名為Aus Cel5A，其氨基酸序列為SEQ ID NO3，相應(yīng)的基因命名為Aus cel5A。這為該基因的異源表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其它β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102127559SQ201010581379
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者唐存多, 趙順閣, 鄔敏辰, 郭靜, 韋敬土 申請(qǐng)人:江南大學(xué)