專利名稱：一種β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因(xyn11D)的克隆及分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一種新型 β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(XynllD)基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，屬于生物工程技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
木聚糖(xylans)是由吡喃木糖殘基通過β ，4_木糖苷鍵連接成主鏈，并在其 側(cè)鏈上連有多種不同取代基的不均一聚糖，是植物半纖維素的主要組分，后者在自然界中 是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生資源。木聚糖酶(xylanases)是降解木聚糖的一 組酶的總稱，屬于半纖維素酶類。作用于主鏈的木聚糖酶有兩種β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶 (endo-β -1,4-xylanase, EC3. 2. 1. 8)和 β _1，4_ 外切木聚糖酶(exo-β-1，4-xylanase， EC3. 2. 1. 37)。前者從主鏈內(nèi)部隨機(jī)切割β -1，4-木糖苷鏈，將木聚糖降解成短鏈的低聚木 糖；而后者作用于短鏈的低聚木糖，從非還原性木端釋放出木糖。木聚糖酶廣泛存在于各種 微生物中，如絲狀真菌、細(xì)菌、放線菌等。但就微生物產(chǎn)木聚糖酶的報(bào)道來看，木聚糖酶的活 性低或熱穩(wěn)定不高。雖然從某些極端生態(tài)環(huán)境中篩選到一些耐熱或/和耐酸堿菌株，其所 產(chǎn)耐熱性或/和耐酸堿性木聚糖酶已引起人們廣泛的關(guān)注，但目前主要采用基因工程技術(shù) 和蛋白質(zhì)工程技術(shù)來提高木聚糖活性和改善包括熱穩(wěn)定在內(nèi)的木聚糖特性。近年來，隨著對自然界半纖維素資源的開發(fā)利用，尤其是低聚木糖優(yōu)越的生理功 能和飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除，人們對不同來源和不同特性的木聚糖酶進(jìn)行了深入地研 究，木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域得到了不斷地拓展，其在造紙、食品、飼料、紡織、釀酒、醫(yī)藥、環(huán)境 和能源等工業(yè)領(lǐng)域均有較廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于Aspergillus usamii EOOl的新型內(nèi)切β _1， 4_木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，為該基因的異源高效表達(dá)和產(chǎn)業(yè)化生 產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。根據(jù)Bernard Henrissat等提出的糖苷水解酶分類法，絕大多數(shù)木聚糖 酶屬于糖苷水解酶第10和11家族。生物信息學(xué)分析表明該基因所編碼的內(nèi)切木聚糖酶屬 于A. usamii EOOl中發(fā)現(xiàn)的第四種11家族的木聚糖酶(已發(fā)現(xiàn)的有Aus XynllA、XynllB 和Xynl 1C)，所以命名為Aus Xynl 1D，其相應(yīng)的基因命名為Aus XynllD0A. usamii EOOl菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜 志的Vol. 31，No4, Pg. 50公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。本發(fā)明的技術(shù)方案一種源自A. usamii EOOl的新型內(nèi)切β_1，4_木聚糖酶(Aus XynllD)，其基因(Aus xynllD)完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO :2。獲取完整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。所述的由完整mRNA推導(dǎo)的Aus XynllD氨基酸序列為SEQ ID NO :3。所述的Ausxynl ID完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法
(I)Aus xynllD 3'端 mRNA 序列的克隆首先對 Aspergillus oryzae RIB40, Aspergillusterreus NIH2624 禾口 Aspergillus fumigatus Af293 β-1，4-木聚糖醇的氛基 酸序列進(jìn)行同源比對，找出兩段約10個氨基酸的保守序列；再對該兩段氨基酸序列的mRNA 進(jìn)行同源比對，設(shè)計(jì)兩條正向簡并引物XynllD-Fl和XynllD-F2。XynllD-Fl 5' -TACTACTA(C/T)TCCTTCTGGAC-3‘ Xynl1D-F2 5' -GT(C/T)GC(C/A)GGAAAGGG(A/C)TGGAA-3‘提取A.usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)說明書進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T 載體連接(pUCm-T-XynllD3')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllD3'端 mRNA 序列。(2)Aus xynllD 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus xynllD 3'端mRNA 序列，設(shè)計(jì)兩條反向引物XynllD-Rl和XynllD-R2。XynllD-Rl 5' -ATATAGAGTTCGACCAAGGG-3‘XynllD-R2 5' -CCATGATCCGCTGTAGGTAA-3‘按照TaKaRa的5' -Full RACE Kit說明書進(jìn)行5' -RACE。將兩輪PCR產(chǎn)物用 瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllD5')，轉(zhuǎn)化
JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllD 5'端mRNA序列。(3)Aus xynllD 5'端啟動子序列的克隆利用一種連接介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增法(Wu Minchenet al. Cloning of an alkaline lipase gene from Penicillium cyclopium and its expression inEscherichia coli，Lipids, 2003，Vol. 38，No. 3，Pg. 191)，以處理后的 A.usamii EOOl 基因組 DNA 為模板，LP (5' GGATCCCTTCACTCTCAAG-3 ‘)和 XynllD-Rl 為弓 | 物進(jìn)行第一輪PCR，LP和XynllD-R2為引物進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖 凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllDP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切 鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllD 5'端啟動子序列。(4)Aus xynllD 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus xynllD 3' 端mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物Xynl 1D-F3和Xynl 1D-F4。XynllD-F3 5' -TCTGCCACCATCACCGTTGA-3‘Xyn11D-F4 5‘ -GCACCGAGGAGAGCTGCTAA-3‘利用我們前期申請的《一種T載體介導(dǎo)的測定3'端側(cè)翼未知序列的方法》(專利 申請?zhí)?01010550861. 9)，以處理后的A. usamii E001基因組DNA為模板，XynllD_F3禾口 T-PrimerR為引物進(jìn)行第一輪PCR，Xynl 1D-F4和T-PrimerR為引物進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-XynllD3T)， 轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工測序，得到Aus xynllD 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列。(5)Aus xynllD編碼區(qū)DNA序列的測定基于上述得到的Aus xynllD 5'和3' 端mRNA序列，設(shè)計(jì)一對引物XynlID-F和Xynl 1D-R。XynllD-F 5' -TGTCACTCCCTTAAACTACT-3‘XynllD-R 5' -GAGATTATGAGTTCGGTCAA-3‘以 A.usamii E001 基因組 DNA 為模板，XynllD-F 禾Π XynllD-R 為引物進(jìn) 行PCR。將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-xynllD-DNA)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllD 編碼區(qū)DNA序列。(6) Aus xynllD基因的生物信息學(xué)分析將Aus xynllD的5‘和3‘端mRNA序列 進(jìn)行拼接，得到自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架 (OpenReading Frame)進(jìn)行分析，進(jìn)而推導(dǎo)出Aus XynllD的氨基酸序列；進(jìn)行信號肽預(yù)測。 將AusxynllD的編碼區(qū)DNA序列與其兩側(cè)序列進(jìn)行拼接，獲得完整的DNA序列，并對其5' 端啟動子區(qū)域和3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的功能進(jìn)行預(yù)測。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種來源于A.usamii EOOl的新型內(nèi)切β_1， 4-木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，為該基因的異源高效表達(dá)和產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析表明該基因所編碼的內(nèi)切木聚糖酶屬于A.USamii EOOl中發(fā)現(xiàn)的第四種11家族的木聚糖酶，所以命名為Aus XynllD，其相應(yīng)的基因命名為 AusxynllD。


圖1 獲取A. usamii EOOl xynllD完整mRNA和DNA序列的流程圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳 細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例IAus xynllD 3'端mRNA序列的克隆以 A.usamii EOOl 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉(zhuǎn)錄合 成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynllD-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條 件為94°C 2min，30 個循環(huán)(94 °C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 45s), 72 °C IOmin ；以 M13 Primer M4和XynllD-F2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 2min，30個循環(huán)(94°C 30s， 53 °C 30s, 72 °C 40s), 72 °C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條 帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-XynlOD3')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實(shí)施例2Aus xynllD 5'端mRNA序列的克隆以5' RACE Outer Primer和XynllD-Rl為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件 為94°C 3min，30 個循環(huán)(94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 30s), 72 °C IOmin ；以 Inner Primer 和XynllD-R2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30個循環(huán)(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 30s),72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目 的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllD5')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工 測序。實(shí)施例3Aus xynllD 5'端啟動子序列的克隆以經(jīng)處理的A. usami i EOO1基因組DNA為模板，LP和Xyn 1 ID-Rl為引物進(jìn)行 第一輪 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C 4min,30 個循環(huán)(94 °C 30s, 52 °C 30s, 72 °C lmin)， 72°C IOmin ；第二輪PCR以LP和XynllD_R2為引物，其反應(yīng)條件為94°C，3min，30個循環(huán) (94 0C 30s, 53 0C 30s, 72 °C lmin), 72 °C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析， 割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllDP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實(shí)施例4Aus xynllD 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆以經(jīng)處理的A. usami i EOOl基因組DNA為模板，XynllD_F3和Τ-PrimerR為引物 進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為94°C 4min，30個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s), 72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 XynllD_F4 和 T-PrimerR 為引物，其反應(yīng)條件為94°C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s)，72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電 泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllD3T)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定 正確后送上海生工測序。實(shí)施例5Aus xynllD編碼區(qū)DNA序列的測定以XynllD-F和XynllD-R為引物進(jìn)行PCR，其反應(yīng)條件為94°C 4min，30個循環(huán) (94 °C 30s，51°C 30s, 72 °C lmin),72°C IOmin0將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠 回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllD-DNA)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上
海生工測序。
權(quán)利要求
1.一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、歸屬于糖苷水解酶第11家族的 新型β -1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別對應(yīng)于序列表中的 SEQ IDNO 1和 SEQ ID NO :2。
2.如權(quán)利要求1所述的新型β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶(AusXynllD)，其氨基酸序列為 SEQ IDNO :3。
3.A. usamii EOOIAus xynllD 完整 mRNA 和 DNA 序列的獲取方法(1)A.usamii EOOl Aus xynllD 3'端 mRNA 序列的克隆對 11 家族的 Aspergillus oryzaeRIB40, Aspergi 1 Ius terreus NIH2624 禾口 Aspergillus fumigatus Af293 木聚糖醇 的氨基酸序列進(jìn)行同源比對，設(shè)計(jì)兩條簡并引物XynllD-Fl和XynllD_F2 ；XynllD-Fl 5' -TACTACTA(C/T)TCCTTCTGGAC-3‘Xynl1D-F2 5' -GT(C/T)GC(C/A)GGAAAGGG(A/C)TGGAA-3‘以 A. usamii EOOl 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynllD-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 45s ；72°C IOmin)；以 M13Primer M4 和 XynllD_F2 為引物 進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 40s ；72°C IOmin)；目 的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Aus xynllD 3'端mRNA序列;(2)A.usamii EOOl Aus xynllD 5'端 mRNA 序列的克隆基于上述得到的 Aus xynllD 3 ‘端mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條反向引物XynlID-Rl和Xynl 1D-R2 ；XynllD-Rl 5' -ATATAGAGTTCGACCAAGGG-3‘XynllD-R2 5' -CCATGATCCGCTGTAGGTAA-3‘以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板、5' RACE Outer I^rimer和XynllD-Rl為引物 進(jìn)行第一輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 3min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；以 5' RACE Inner Primer 和 XynllD_R2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR擴(kuò)增(94°C 3min ；30 個循環(huán)， 94°C 30s,53°C 30s,72°C 30s ；72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到 Aus xynllD 5'端 mRNA序列；(3)A.usamii E001 Aus xynllD 5 ‘端啟動子序列的克隆以經(jīng)處理的A. usamii E001 基因組 DNA 為模板，LP(5' -GGATCCCTTCACTCTCAAG-3 ‘)和 XynllD-Rl 為引物進(jìn)行 第一輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 4min ;30 個循環(huán)，94°C 30s, 52 °C 30s, 72 °C Imin ；72 °C IOmin)；以 LP 和 Xynl 1D-R2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 3min ;30 個循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Aus xynllD 5'端啟動子序列；(4)A.usamii E001 Aus xynllD 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus xynllD3'端mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物Xynl 1D-F3和XynllD_F4 ；XynllD-F3 5' -TCTGCCACCATCACCGTTGA-3‘Xyn11D-F4 5 ‘ -GCACCGAGGAGAGCTGCTAA-3‘以經(jīng)處理的A. usamii E001基因組DNA為模板，XynllD_F3和T-PrimerR為引物進(jìn)行 第一輪PCR(94°C 4min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；以 XynllD_F4 和 T-PrimerR 為引物進(jìn)行第二輪 PCR(94°C 3min ；30 個循壞，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s 72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Aus xynllD 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列；(5)A.usamii E001 Aus xynllD編碼區(qū)DNA序列的測定基于上述得到的Aus xynllD5'和3‘端mRNA序列，設(shè)計(jì)一對引物Xynl 1D-F和XynlID-R ； XynllD-F 5' -TGTCACTCCCTTAAACTACT-3‘ XynllD-R 5' -GAGATTATGAGTTCGGTCAA-3‘以A. usamii EOOl基因組DNA為模板，XynllD-F和XynllD-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò) 增(940C 4min ；30 個循環(huán)，94°C 30s，51°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測 序，得到Aus xyn 1ID編碼區(qū)DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息學(xué)分析表明該β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶是在A.usamii E001中發(fā)現(xiàn)的第四種11家族的木聚糖酶，所以命名為Aus Xyn11D，其氨基酸序列為SEQ ID NO3，相應(yīng)的基因命名為Aus xyn11D。這為該基因的異源表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價值，也為其它β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/56GK102127560SQ20101058140
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者唐存多, 張慧敏, 李劍芳, 鄔敏辰 申請人:江南大學(xué)