專利名稱：一種β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(Xyn11C)基因的克隆及分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一種新型β-1， 4-內(nèi)切木聚糖酶基因(Aus xynllC)完整mRNA和DNA序列的克隆以及分析，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
木聚糖是僅次于纖維素含量的第二豐富的可再生多糖，廣泛存在于陸生植物細(xì)胞壁中，由于木聚糖在動(dòng)物體內(nèi)具有很強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，因而大大限制了大麥、小麥等禾谷類飼料在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用。木聚糖完全降解需要幾種酶協(xié)同作用，其中β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-i3-l，4-Xylanase，EC3. 2. 1.8)最為關(guān)鍵，它以內(nèi)切方式隨機(jī)作用于木聚糖的主鏈，產(chǎn)生長度不同的木寡糖。木聚糖酶廣泛存在于真核和原核微生物、以及某些動(dòng)植物中，微生物β -1，4-D-內(nèi)切木聚糖酶是由一條多肽組成，其分子量在8 145kDa之間，在pH 值為3 10. 5范圍內(nèi)較穩(wěn)定，最適酶促反應(yīng)pH值一般在4 7之間，最適酶促反應(yīng)溫度一般位于40 60°C之間。根據(jù)Henrissat (1993)的分類標(biāo)準(zhǔn)，木聚糖酶分別屬于第11家族糖苷酶和第10家族糖苷酶。第10家族的木聚糖酶的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)較相似，但第11家族的木聚糖酶在pI、pH值、熱穩(wěn)定性及酶分子的結(jié)構(gòu)等方面相差較大。到目前為止，國內(nèi)外已有300余種不同來源的木聚糖酶基因的報(bào)道，其中100多種基因被克隆和表達(dá)在合適的宿主中，但研究較多的是細(xì)菌來源的木聚糖酶基因，目前生產(chǎn)應(yīng)用中的木聚糖酶主要來源于真菌，因?yàn)檎婢a(chǎn)生的木聚糖酶多為胞外酶，易于純化分離。木聚糖酶在造紙、食品、飼料等工業(yè)以及能源和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但微生物產(chǎn)木聚糖酶熱穩(wěn)定性不高。近年來，主要采用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)來改變木聚糖的性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)來源的木聚糖酶具有良好的耐酸性。目前已經(jīng)從A.usamii中克隆了第11家族的β _1，4-內(nèi)切木聚糖酶A (XynllA)及β_1，4_內(nèi)切木聚糖酶B(XynllB)，并在多種不同表達(dá)體系中進(jìn)行了表達(dá)，一種新型內(nèi)切β_1，4_木聚糖酶是A.usamii EOOl發(fā)現(xiàn)的第三種11家族的木聚糖酶，命名為Aus XynllC，其相應(yīng)的基因命名為Aus xynllC。本發(fā)明的目的是提供一種A.usamii EOOl新型內(nèi)切β_1，4_木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列，并對(duì)該基因序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了詳細(xì)的分析，為下一步表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。A. usamii EOOl菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。本發(fā)明的技術(shù)方案一種源自A. usamii EOOl的新型β _1，4_內(nèi)切木聚糖酶(Aus XynllC)，其基因(Aus xynllC)完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO :2。獲取完整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。
所述的由完整mRNA推導(dǎo)的Aus XynllC氨基酸序列為SEQ ID NO :3。所述的Aus xynllC完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法(I)Aus xynllC 3'端 mRNA 序列的克隆首先對(duì) Aspergillus oryzae RIB40, Aspergillusflavus NRRL3357 和 Neosartorya fischeri NRRL181 β _1，4-木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出兩段約10個(gè)氨基酸的不同于XynllA和XynllB的保守序列；再對(duì)該兩段氨基酸序列的mRNA進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)兩條正向簡并引物XynllC-Fl和 XynllC-F2XynllC-Fl 5' -TTCCT(C/G)GC(T/C)GGAAAGGGCT-3‘XynllC-F2 5' -AC(T/C)GAGTGGTAC(G/A)TTGTCGA-3‘提取A.usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)說明書進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T 載體連接(pUCm-T-XynllC3')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllC3'端 mRNA 序列。(2)Aus xynllC 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3'端mRNA 序列，設(shè)計(jì)兩條反向引物XynllC-Rl和XynllC-R2。XynllC-Rl 5' -AAATGGCCAAAGTCCAGTCC-3‘XynllC-R2 5' -TGAAATAACCGTCCCAGGTC-3‘按照TaKaRa的5' -Full RACE Kit說明書進(jìn)行5' -RACE。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllC5')，轉(zhuǎn)化
JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllC 5'端mRNA序列。(3)Aus xynllC 5'端啟動(dòng)子序列的克隆利用一種連接介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增法(Wu Minchenet al. Cloning of an alkaline lipase gene from Penicillium cyclopium and its expression inEscherichia coli，Lipids, 2003，Vol. 38，No. 3，Pg. 191)，以處理后的 A.usamii EOOl 基因組 DNA 為模板，LP (5' GGATCCCTTCACTCTCAAG-3 ‘)禾Π XynllC-Rl 為引物進(jìn)行第一輪PCR，LP和XynllC-R2為引物進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllCP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllC 5'端啟動(dòng)子序列。(4)Aus xynllC 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3' 端mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物Xynl 1C-F3和Xynl 1C-F4。XynllC-F3 5' -TGGTTACCCTGGAAGGCTTT-3‘Xyn11C-F4 5‘ -ACTTCACCGTTAGTGCATAG-3‘利用我們前期申請的《一種T載體介導(dǎo)的測定3'端側(cè)翼未知序列的方法》(專利申請?zhí)?01010550861. 9)，以處理后的A. usamii E001基因組DNA為模板，XynllC_F3和 T-PrimerR為引物進(jìn)行第一輪PCR，Xynl 1C-F4和T-PrimerR為引物進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-XynllC3T)， 轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工測序，得到Aus xynllC 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列。(5)Aus xynllC編碼區(qū)DNA序列的測定基于上述得到的Aus xynllC 5'和3' 端mRNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物XynllC-F和Xynl 1C-R。XynIlC-F 5' -GGCAAACAACCGTTGCTATC-3‘
XynIlC-R 5' -AGAGCAGGCTCTAAGAGAAG-3‘以 A. usamii EOOl 基因組 DNA 為模板，XynllC-F 禾Π XynllC-R 為引物進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接 (pUCm-T-xynllC-DNA)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllC 編碼區(qū)DNA序列。(6) Aus xynllC基因的生物信息學(xué)分析將Aus xynllC的5‘和3‘端mRNA序列進(jìn)行拼接，得到自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對(duì)開放閱讀框架 (OpenReading Frame)進(jìn)行分析，進(jìn)而推導(dǎo)出Aus XynllC的氨基酸序列；進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測。 將AusxynllC的編碼區(qū)DNA序列與其兩側(cè)序列進(jìn)行拼接，獲得完整的DNA序列，并對(duì)其5' 端啟動(dòng)子區(qū)域和3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的功能進(jìn)行預(yù)測。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種來源于A. usamii EOOl的新型內(nèi)切β_1， 4-木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，為該基因的異源高效表達(dá)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析表明該基因所編碼的內(nèi)切木聚糖酶屬于A. usamii EOOl中發(fā)現(xiàn)的第三種11家族的木聚糖酶，所以命名為Aus XynllC，其相應(yīng)的基因命名為 Aus xynllC。


圖1 獲取A. usamii EOOl xynllC完整mRNA和DNA序列的流程圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 Aus xynllC 3'端mRNA序列的克隆以O(shè)ligo dT-Adaptor I^rimer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以 M13 Primer M4和XynllC-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C anin，30個(gè)循環(huán)(94 °C 30s，54 °C 30s，72 °C 45s)，72 °C IOmin ；以 M13 Primer M4 禾口 XynllC_F2 為弓| 物進(jìn)行第二輪 PCR，其反應(yīng)條件為94°C 2min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 45s)， 72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接 (pUCm-T-xynllC3')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實(shí)施例2 Aus xynllC 5'端mRNA序列的克隆以 5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 XynllC-Rl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR， 其反應(yīng)條件為94 °C 3min, 30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s)，72 °C IOmin ；以 Inner I^rimer和Xyn 11C-R2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30個(gè)循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s)，72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析， 回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllC5')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實(shí)施例3 Aus xynllC 5'端啟動(dòng)子序列的克隆第一輪PCR以LP和XynllC-Rl為引物，反應(yīng)條件為94 °C 4min, 30個(gè)循環(huán) (94°C 30s, 54°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 LP 和 XynllC-R2 為引物，反應(yīng)條件為94°C，3min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s，54°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 將兩輪 PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllCP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllC 5'端啟動(dòng)子序列。實(shí)施例4 Aus xynllC 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆以經(jīng)處理的A.usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以Xynl 1C-F3和 T-PrimerR 為引物，反應(yīng)條件為94°C 4min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s), 72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 XynllC_F4 和 T-PrimerR 為引物，反應(yīng)條件為94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 54 °C 30s, 72 °C 30s), 72 °C IOmin。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllC3T)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實(shí)施例5 Aus xynllC編碼區(qū)DNA序列的測定以A. usami i EOO1基因組DNA為模板，Xyn 11C-F和Xyn 11C-R為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為:94°C 4min, 30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 將其產(chǎn)物用 1 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllC-DNA)，轉(zhuǎn)化JM109， 經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus xynllC編碼區(qū)DNA序列。
權(quán)利要求
1.一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、歸屬于糖苷水解酶第11家族的新型β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(Aus Xynl 1C)，其基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
2.由權(quán)利要求1所述的β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因(AusxynllC)編碼的新型β_1， 4-內(nèi)切木聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :3。
3.Aus xynllC完整mRNA和DNA序列的獲取方法(1)AusxynllC 3'端 mRNA 序列的克隆對(duì) 11 家族的 Aspergillus oryzae RIB40, Aspergillusflavus NRRL3357 和 Neosartorya fischeri NRRL181 木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)兩條簡并引物XynllC-Fl和XynllC-F2 ；XynllC-Fl 5' -TTCCT(C/G)GC(T/C)GGAAAGGGCT-3‘XynllC-F2 5' -AC(T/C)GAGTGGTAC(G/A)TTGTCGA-3‘以 A. usamii EOOl 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynllC-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增(94°C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s，54°C 30s，72°C 45s ;72°C IOmin)；以 M13 Primer M4 禾口 XynllC_F2 為弓|物進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 45s ；72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Aus xynllC 3'端mRNA序列;(2)AusxynllC 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3'端mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條反向引物XynllC-Rl和XynllC-R2 ；XynllC-Rl 5' AAATGGCCAAAGTCCAGTCC-3‘Xyn11C-R2 5‘ TGAAATAACCGTCCCAGGTC-3‘以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板、5' RACE Outer Primer和XynllC-Rl為引物進(jìn)行第一輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 3min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；以 5' RACE Inner Primer 和 XynllC_R2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR擴(kuò)增(94°C 3min ；30 個(gè)循環(huán)， 94°C 30s,55°C 30s,72°C 30s ；72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到 Aus xynllC 5'端 mRNA序列；(3)AusxynllC 5'端啟動(dòng)子序列的克隆以經(jīng)處理的A. usamii E001基因組DNA為模板，以 LP(5 ‘ GGATCCCTTCACTCTCAAG-3 ‘)和 XynllC-Rl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR 擴(kuò)增 (940C 4min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s，54°C 30s，72°C Imin ；72°C IOmin)；以 LP和 XynllC_R2 為弓丨物進(jìn)行第二輪 PCR擴(kuò)增(940C 3min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s，54°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)； 目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Aus xynllC 5'端啟動(dòng)子序列；(4)AusxynllC 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3'端 mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物Xynl 1C-F3和Xynl 1C-F4 ；XynllC-F3 5' -TGGTTACCCTGGAAGGCTTT-3‘Xyn11C-F4 5 ‘ -ACTTCACCGTTAGTGCATAG-3‘以經(jīng)處理的A. usamii E001基因組DNA為模板，Xynl 1C-F3和T-PrimerR為引物進(jìn)行第一輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 4min ;30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；以 XynllC-F4 和 T-PrimerR 為引物進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增(94 °C 3min ;30 個(gè)循環(huán)，94 °C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Aus xynllC 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列；(5)Aus xynllC編碼區(qū)DNA序列的測定基于上述得到的Aus xynllC 5'和3'端mRNA 序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物XynllC-F和XynllC-R ； XynllC-F 5' -GGCAAACAACCGTTGCTATC-3‘ XynllC-R 5' -AGAGCAGGCTCTAAGAGAAG-3‘ 以A. usamii EOOl基因組DNA為模板，XynllC-F和XynllC-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增(940C 4min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Aus xynllC編碼區(qū)DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息學(xué)分析表明該β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶是在A.usamii E001中發(fā)現(xiàn)的第三種11家族的木聚糖酶，所以命名為Aus Xyn11C，其氨基酸序列為SEQ ID NO3，相應(yīng)的基因命名為Aus xyn11C。這為該基因的異源表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其它β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102154242SQ20101058142
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者劉高磊, 張慧敏, 李劍芳, 鄔敏辰 申請人:江南大學(xué)