專利名稱：一種用于高效表達(dá)抗opn單克隆抗體的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于高效表達(dá)抗OPN單克隆抗體
的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重危害我國人民生命健康的重大疾病，腫瘤手術(shù)切除后5年，生存率可達(dá)40 %左右，但仍有一半左右的病人手術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)理研究提示多種因素與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用 (Rangaswami HiBulbule AiKundu GC. Osteopontin :role in cell signaling and cancer progression. Trends Cell Biol.2006 Feb ； 16 (2) :79-87)。因此，通過抗OPN抗體阻斷OPN的促轉(zhuǎn)移信號傳導(dǎo)通路，就有可能有效阻斷腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移過程，防止腫瘤細(xì)胞向細(xì)胞基質(zhì)的侵潤，從而防止腫瘤的轉(zhuǎn)移。單克隆抗體在其中起了重要作用，因此有不少科研工作者提供了抗OPN單克隆抗體，例如申請人為上海國健生物技術(shù)研究院、申請?zhí)枮?00710039873. 3、發(fā)明名稱為骨橋蛋白的功能表位、 與其特異性結(jié)合的單克隆抗體及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途的中國專利申請；申請人為上海中信國健藥業(yè)有限公司、申請?zhí)枮?00710085147. 5、發(fā)明名稱為一種重組抗 OPN單克隆抗體及其制備方法和用途的中國專利申請；申請人為中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、申請?zhí)枮?00910051737. 5、發(fā)明名稱為抗骨橋蛋白OPN單克隆抗體及其應(yīng)用的中國專利申請等。但在上述專利申請中，均只采用了常規(guī)的培養(yǎng)方法，而未能提供合適/專門的培養(yǎng)抗OPN單克隆抗體的方法。因此，有必要提供一種能高效表達(dá)抗OPN單克隆抗體的方法，從而高表達(dá)的提供抗OPN單克隆抗體，以降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種用于高效表達(dá)抗OPN單克隆抗體的培養(yǎng)基，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種使用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)抗OPN單克隆抗體的菌株的方法。本發(fā)明提供的用于高效表達(dá)抗OPN單克隆抗體的培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基DMEM/F12中加入維生素C10 25mg/L ；乙醇胺1 10mg/L;亞硒酸鹽0. 01 0. 045mg/L ；羥基丁酸鈉0.5-1.5mg/L;〔0014〕 ‘ 6?。?00’ 5 2’ 5呢/1
〔0015〕00012 ‘ 6??！2005 化 31^/1 ；
〔0016〕011804 ‘ 5只20002 004^/1 ；
〔0017〕1(81”0005 00081118/1 ；
〔0018〕 ‘ 6！！2002 251^/1 ；
0019〕211804 ‘ 711205 之.51^/1 ；
〔0020〕維生素 860丨 01 0丨 21X1^/1 ；
〔0021〕維生素 8120丨 01 0丨 51^/1 ；
〔0022〕生物素0丨05 0丨181^/1 ；
〔0023〕還原型谷胱甘肽0丨5 2丨5呢/1
〔0024〕核糖之.0 已.51118/1 ；
100251冊？23500 30001^/1。
〔0026〕根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，在培養(yǎng)基01^1汗12中加入
〔0027〕維生素(10. 51118/1 ；
^00283乙醇胺10呢/1 ；
〔0〇29〕亞硒酸鹽0丨028^/1 ；
^0030^羥基丁酸鈉0丨 51118/1 ；
〔0031〕 ‘ 6！！202.51^/1；
〔0032〕00012 ‘ 6只20151^/1 ；
〔0033〕011804 ‘ 5只20002^/1 ；
〔0034〕1(81”00061118/1 ；
〔0035〕 ‘ 6只2002^/1 ；
〔0036〕211804 ‘ 7只201. 51^/1 ；
〔0037〕維生素 8601^/1 ；
〔0038〕維生素 8125呢/1 ；
〔0〇39〕生物素0丨01^/1 ；
〔0040〕還原型谷胱甘肽0丨51118/1 ；
〔0041〕核糖5.71^/1；
〔0042〕??！2？2315001^/1。
〔0043〕根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，在培養(yǎng)基01^1汗12中加入
〔0〇44〕維生素(181118/1 ；
〔0〇45〕乙醇胺1呢/1 ；
〔0〇46〕亞硒酸鹽0丨045呢/1 ；
〔0047〕羥基丁酸鈉1. 01118/1 ；
〔0048〕八 1〔13 ‘ 6壓0511^/1 ；
〔0049〕00012 ‘ 6只20301^/1 ；
〔0050〕011804 ‘ 5只200031^/1 ；
〔0051〕1(81”0.00051118/1；
〔0052〕 ‘ 6只20151^/1 ；
ZnSO4 · 7H200. 5mg/L ；
維生素B60. 2mg/L ；
維生素B120. 01mg/L ；
生物素0. 2mg/L ；
還原型谷胱甘肽2. 5mg/L ；
核糖2. Omg/L ；
HEPES3000mg/L。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，在培養(yǎng)基DMEM/F12中加入
維生素C25mg/L ；
乙醇胺6mg/L ；
亞硒酸鹽0.Olmg/L ；
羥基丁酸鈉1. 5mg/L ；
AlCl3 · 6H201. 6mg/L ；
CoCl2 · 6H200. 05mg/L ；
CuSO4 · 5H200. 004mg/L ；
KBr0. 0008mg/L ；
NiCl2 · 6H200. 25mg/L ；
ZnSO4 · 7H202. 5mg/L ；
維生素B60.lmg/L ；
維生素B120.3mg/L ；
生物素0.1lmg/L ；
還原型谷胱甘肽1. 5mg/L ；
核糖8. 5mg/L ；
HEPES500mg/Lo
本發(fā)明提供的使用前述培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)抗OPN單克隆抗體的菌株的方法的培養(yǎng)過程為
a)細(xì)胞培養(yǎng)溫度36.5°C 38°C，pH值6. 7 6.9，培養(yǎng)動物細(xì)胞至2. 5
3.0X106cells/ml后，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)72 96小時，每小時加入原培養(yǎng)基0. 3 1.5% (v%)的新鮮培養(yǎng)基；b)細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至32°C ;34°C，pH值7. 2 7. 3，培養(yǎng)120 144小時，每小時加入原培養(yǎng)基總體積的0. 3 1. 5%的新鮮培養(yǎng)基；c)細(xì)胞培養(yǎng)溫度升至36°C 38°C，pH值7. 0 7. 3，培養(yǎng)M 48小時。使用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)方法培養(yǎng)表達(dá)抗OPN單克隆抗體的菌株， 獲得的細(xì)胞密度及抗OPN單克隆抗體的表達(dá)量均有顯著增加。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，下述實施例不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例不包括對傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法以及經(jīng)典的細(xì)胞融合和單克隆抗體篩選及純化的方法等。這樣的方法對于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人員是眾所 周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，Ε. F. md Maniais， Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2n~ edition，Cold spring Harbor Laboratory Press.在本發(fā)明的下述實施例中，使用的表達(dá)抗OPN單克隆抗體的菌株參考申請?zhí)枮?200710085147. 5、發(fā)明名稱為一種重組抗OPN單克隆抗體及其制備方法和用途的中國專 利申請進(jìn)行制備，并挑選其中表達(dá)量最高的1株(命名為ZX09-003細(xì)胞株)進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng) 和檢測。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基DMEM/F12(購自Sigma公司) 中加入維生素C10 25mg/L ；乙醇胺1 10mg/L ；亞硒酸鹽0. 01 0. 045mg/L ；羥基丁酸鈉0. 5-1. 5mg/L ；AlCl3 · 6Η20 0. 5 2. 5mg/L ；CoCl2 · 6H20 0. 05 0. 3mg/L ；CuSO4 · 5H20 0. 002 0. 004mg/L ；KBr0. 0005 0. 0008mg/L ；NiCl2 · 6H20 0. 02 0. 25mg/L ；ZnSO4 · 7Η20 0. 5 2. 5mg/L ；維生素B60. 01 0. 2mg/L ；維生素B120. 01 0. 5mg/L ；生物素0. 05 0. 18mg/L ；還原型谷胱甘肽0. 5 2. 5mg/L ；核糖2. 0 8. 5mg/L ；HEPES500 3000mg/L。實施例1、培養(yǎng)基的制備在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按表1的配方分別制備培養(yǎng)基，獲得三種不同的改進(jìn)型 培養(yǎng)基，分別命名為 DMEM/F12-1、DMEM/F12-2 和 DMEM/F12-3。表1、培養(yǎng)基制備
權(quán)利要求
1. 一種用于高效表達(dá)抗OPN單克隆抗體的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基DMEM/F12中加入 維生素C10 25mg/L乙醇胺1 10mg/L ；亞硒酸鹽0. 01 0. 045mg/L ；羥基丁酸鈉0. 5-1. 5mg/L ；AlCl3 · 6Η200. 5 2. 5mg/L ；CoCl2 · 6Η200. 05 0. 3mg/L ；CuSO4 · 5Η200. 002 0. 004mg/L ；KBr0. 0005 0. 0008mg/L ；NiCl2 · 6Η200. 02 0. 25mg/L ；ZnSO4 · 7Η200. 5 2. 5mg/L ； 維生素恥 0.01 0.ang/L; 維生素附2 0.01 0.5mg/L;生物素0. 05 0. 18mg/L ； 還原型谷胱甘肽0. 5 2. 5mg/L ；核糖2. 0 8. 5mg/L ；HEPES500 3000mg/L。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基DMEM/F12中加維生素C10. 5mg/L ；乙醇胺lOmg/L ；亞硒酸.Trrt.0.028mg/L ；羥基丁 I酸鈉0.5mg/L ；AlCl3 ·6H202. 5mg/L ；CoCl2 ·6H200. 15mg/L ；CuSO4 ·5H200. 002mg/L ；KBr0.0006mg/LNiCl2 ·6H200.02mg/L ；ZnSO4·7H201. 5mg/L ；維生素B60. Olmg/L ；維生素B120. 5mg/L ；生物素0. Olmg/L ；還原型谷胱甘肽0. 5mg/L ；核糖5. 7mg/L ；HEPES1500mg/L。入
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基DMEM/F12中加維生素C18mg/L ；乙醇胺lmg/L ；亞硒酸TTt.0.045mg/L ；羥基丁酸鈉1. Omg/L ；AlCl3 ·6H200. 5mg/L ；CoCl2 ·6H200. 30mg/L ；CuSO4 ·5H200. 003mg/L ；KBr0. 0005mg/L ；NiCl2 ·6H200.15mg/L ；ZnSO4 ·7H200.5mg/L ；維生素B60.2mg/L ；維生素B120. 0lmg/L生物素0. 2mg/L ；還原型谷胱甘肽2. 5mg/L ；核糖2. Omg/L ；HEPES3000mg/Lo
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基DMEM/F12中加入維生素C25mg/L ；乙醇胺6mg/L ；亞硒酸鹽0. 0lmg/L ；羥基丁酸鈉1. 5mg/L ；AlCl3 · 6H201. 6mg/L ；CoCl2 · 6H200. 05mg/L ；CuSO4 · 5H200. 004mg/L ；KBr0. 0008mg/LNiCl2 · 6H200. 25mg/L ；ZnSO4 · 7H202. 5mg/L ；維生素B60. lmg/L ；維生素B120. 3mg/L ；生物素0. 1lmg/L ；還原型谷胱甘肽1. 5mg/L ；核糖8. 5mg/L ；HEPES500mg/Lo
5.使用如權(quán)利要求1-4中任一項所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)抗OPN單克隆抗體的菌株的方法，其特征在于，所述方法包括a)細(xì)胞培養(yǎng)溫度36.5 °C 38 °C，pH值6. 7 6. 9，培養(yǎng)動物細(xì)胞至2. 5 3.0X106cells/ml后，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)72 96小時，每小時加入原培養(yǎng)基0. 3 1.5% (v% )的新鮮培養(yǎng)基；b)細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至32°C ;34°C，pH值7.2 7. 3，培養(yǎng)120 144小時，每小時加入原培養(yǎng)基總體積的0. 3 1. 5%的新鮮培養(yǎng)基；c)細(xì)胞培養(yǎng)溫度升至36°C 38°C，pH值7. 0 7. 3，培養(yǎng)M 48小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于高效表達(dá)抗OPN單克隆抗體的培養(yǎng)基。使用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)方法培養(yǎng)表達(dá)抗OPN單克隆抗體的菌株，獲得的細(xì)胞密度及抗OPN單克隆抗體表達(dá)量均有顯著增加。
文檔編號C12N5/12GK102559495SQ20101058151
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者倪華, 王進(jìn)秋, 胡輝, 郭亞軍 申請人:上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司