專利名稱：一種無縫基因克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種不含有人工堿基的無縫基因克 隆方法。
背景技術(shù)：
基因克隆是進行基因鑒定及其生物學(xué)功能分析的基本方法，是現(xiàn)代分子生物 學(xué)最重要的技術(shù)之一。目前，基因克隆的方法主要包括兩大類，一類依賴酶切連接反應(yīng) (ligase-dependent cloning, LDC), 一類不{衣賴于Sl切鏈接反應(yīng)(ligase-independent cloning, LIC)。LDC的應(yīng)用最為廣泛，其主要原理是利用能夠識別特異DNA序列的限制性 內(nèi)切酶，將目的基因和目的載體酶切后再用連接酶將各個片段連接起來，從而形成重組DNA 分子(LU,Q. 2005. Seamless cloning and genefusion. Trends Biotechnol, vol. 23,no. 4, p. 199-207.)。LDC的缺點也非常明顯(1)酶切與連接的步驟復(fù)雜煩瑣，費時費力；(2)限 制性內(nèi)切酶位點的可用性(availability)是本方法的限速步驟，特別是克隆長基因片段 的時候，往往由于基因內(nèi)部冗余的酶切位點而使本方法難以奏效；(3)克隆效率難以控制， 這很大程度上歸因于不同限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)的效率差異較大；(4)不可避 免引入人工堿基而影響基因表達與功能研究，這主要是由于限制性內(nèi)切酶位點的殘留。為 了規(guī)避上述限制因素，多種LIC方法應(yīng)運而生。將脫氧單磷酸尿苷dUMP摻入到合成的引物 中，用此類引物經(jīng)PCR擴增得到的產(chǎn)物可被UDG酶(uracil DNAglycosylase)選擇性的降 解從而產(chǎn)生粘性末端。然后將這些攜帶粘性末端的PCR產(chǎn)物與特定載體退火即可得到重 組克隆，無需進行體外連接(ASLANIDIS，C. andDE JONG, P.J. 1990. Ligation-ind 印 endent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res, vol.18, no.20, p.6069-6074 ； RASHT CHIAN, Α. ；BUCHMAN, G. W. ；SCHUSTER, D. Μ. and BERNINGER, Μ. S. 1992. Uracil DNAglycosylase-mediated cloning of polymerase chain reaction-amplified DNA application to genomic and cDNA cloning. Anal Biochem,vol. 206,ηο· l,p. 91-97.)。但 這種方法需要合成帶有修飾的特殊引物，因此難以得到有效的推廣和使用。利用重組酶可 將目的基因與目標載體經(jīng)體外同源重組的方式產(chǎn)生重組DNA，但是因為重組酶的價格昂貴， 使其從經(jīng)濟角度來考慮不是優(yōu)選方案(BUCHH0LZ，F(xiàn). and BISHOP, Μ. 2001. LoxP-directed cloning :use of Cre recombinase as a universalrestriction enzyme. Biotechniques, vol. 31，no. 4，p. 906-908，910，912，914，916，918.)。PCR 介導(dǎo)的基因克隆通常用到”超長 引物”(megaprimer)進行擴增，但是其低下的擴增效率往往造成克隆的失敗，反而導(dǎo)致在 條件優(yōu)化方面需要投入更多人力和物力(VAN DEN ENT，F(xiàn). and L0WE，J. 2006. RF cloning arestriction-free method for inserting target genes into plasmids. J Biochem BiophysMethods, vol. 67，no. 1，p.67-74. ；BRYKSIN, A. V. and MATSUMURA,I.2010. Overlap extension PCR cloning :a simple and reliable way to create recombinantplasmids. Biotechniques, vol. 48, no. 6,p.463-465.)。由此可見，發(fā)展一種快速、簡便、經(jīng)濟的高效基因克隆方法，既是現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展的需要，也必將積極推動后基因組時代的基因功能研究進程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種不依賴于酶切鏈接反應(yīng)，快速、簡便、經(jīng) 濟、高效的無縫基因克隆方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而提供的技術(shù)方案是一種無縫基因克隆方法，包括如下步驟i)根據(jù)目的基因和目的載體的序列，設(shè)計、合成三條引物pF，pR，plR ；其中pF為嵌合體引物，包括Pl引物和P2引物兩部分，Pl引物序列與目的載體插 入位置5’端的20-30個堿基的序列相同，P2引物序列與目的基因5’端的20-30個堿基的 序列相同；pR也為嵌合體引物，由P3引物和P4引物兩部分構(gòu)成，P3引物序列與目的載體插 入位置3’端的20-30個堿基的序列相同，P4引物序列與目的基因3’端的20-30個堿基的 序列相同；PlR引物序列實際為Pl引物的反向互補序列；引物P2，P4和PlR的Tm值保持一致；ii)實施一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR，獲得融合線性片段；反應(yīng)體系由如下成分組成l)pF，pR，PlR引物；2)含有目的基因的DNA模板；3)目 的載體模板；4)dNTP ；5)高保真DNA聚合酶KOD plus ；6)與KOD plus配套使用的PCR緩沖 液；7)硫酸鎂MgSO4 ；8)超純水；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘；95°C變性15秒，退火溫度為(Tm_5) °C，時間持續(xù) 30秒，延伸溫度為68°C，持續(xù)時間按照1000堿基/分鐘設(shè)定；循環(huán)數(shù)為30 ；iii)Dpn I消化PCR產(chǎn)物，去除帶甲基化的模板質(zhì)粒DNA ；iv)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 α ；ν)挑取單克隆菌落測序鑒定；vi)酶切確認重組質(zhì)粒的整合情況。本發(fā)明方法的一個要點，是提供了一套嵌合體引物設(shè)計方案。本發(fā)明需要三條引 物，分別命名為pF，pR，plR。pF為嵌合體引物，包括Pl引物和Ρ2引物兩部分(pF = P1+P2)。 Pl引物的長度為20-30個堿基，其序列與目的載體插入位置5’端的20-30個堿基的序列相 同；P2引物的長度為20-30個堿基，其序列與目的基因5’端的20-30個堿基的序列相同；pF 引物的總長度為40-60個堿基。pR也為嵌合體引物，由P3引物和P4引物兩部分構(gòu)成(pR = P3+P4)。P3引物的長度為20-30個堿基，其序列與目的載體插入位置3，端的20-30個 堿基的序列相同；P4引物的長度為20-30個堿基，其序列與目的基因3’端的20-30個堿基 的序列相同；PR引物的總長度為40-60個堿基。plR引物的長度為20-30個堿基，其序列實 際為Pl引物的反向互補序列。引物P2，P4和PlR的Tm值保持一致，便于后續(xù)的PCR擴增。本發(fā)明方法的另一個要點，是提供了一種一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR方法。 實施一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR的目標是通過一步單管式PCR反應(yīng)將目的基因與目的 載體融合為一條線性片段。在本反應(yīng)中，一級產(chǎn)物是由PF與pR引物擴增得到的目的基因 序列。因為PR引物的P3部分與目的載體插入位點的序列互補，因此一級產(chǎn)物啟動了二級反應(yīng)，即一級產(chǎn)物與目的載體在插入位點處退火延伸產(chǎn)生二級產(chǎn)物(此即搭橋反應(yīng))，也就 是所需的融合線性片段。在此基礎(chǔ)上，PlR引物與pF引物共同退火到二級產(chǎn)物的5’和3’ 端引發(fā)三級反應(yīng)(此即長距離PCR)，保證PCR擴增以指數(shù)形式增長，從而大量獲得融合線性 片段。本反應(yīng)可在一個PCR管中完成，且巧妙利用搭橋耦聯(lián)長距離PCR，簡化了實驗步驟。本發(fā)明方法提供了一種特殊的線性融合片段。該片段的5’和3’末端具有20-30 堿基的同源序列。該段同源序列保證了在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細胞內(nèi)后發(fā)生同源重組，使線性 片段轉(zhuǎn)變?yōu)楹心康幕虻沫h(huán)狀質(zhì)粒。本發(fā)明方法所述的嵌合體引物是脫氧核糖核酸(DNA)，不帶有任何其它的化學(xué)修 飾，價格低廉，易得易運易保存。本發(fā)明所述含有目的基因的DNA模板可以是質(zhì)粒DNA或基因組DNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到 的cDNA。但如果是質(zhì)粒DNA，則必須是從非甲基化缺陷的大腸桿菌菌株中純化而來。在本 發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，含有目的基因的DNA模板是豬肌肉組織基因組DNA ；目的載體模板 是從非甲基化缺陷的大腸桿菌菌株(dam+菌株，如DH5ci，JM109等)純化而來，載體本身帶 有甲基化修飾。本發(fā)明方法所述的Dpn I消化PCR產(chǎn)物，去除帶甲基化的模板質(zhì)粒DNA，反應(yīng)體系 組成是PCR產(chǎn)物洸μ 1，10XBuffer Tango 3 μ 1, Dpn I 1 μ 1 ；反應(yīng)條件是37°C水浴鍋中 溫育2h。為了具體闡明本發(fā)明的實施流程和效果，在


和具體實施方式
中，選擇的 目的基因是豬肌抑素基因的啟動子序列，長度分別為3. Skb和2. 3kb ；選擇的目的載體是熒 光素酶報告基因載體pGL3-basiC。此處需要特別指出的是，本發(fā)明方法的應(yīng)用遠不止于此，

和具體實施方式
不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。本發(fā)明方法不需要特殊的限制性內(nèi)切酶和連接酶以及堿性磷酸酶，不需要進行片 段分離、純化、回收、連接等繁雜操作，不引入人工堿基，而且可以將任意目的基因融入任意 目的載體的任意位置。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果1、原理簡單，操作簡便；2、不需要使用各類限制性內(nèi)切酶和連接酶，避免了繁瑣的酶切連接等步驟，大大 節(jié)省物質(zhì)成本和時間成本；3、不會引入任何人工堿基，沒有酶切位點的殘留；4、插入位點精確可控；5、適用范圍廣，可以將任意目的基因融入任意目的載體的任意位置。除非特別指出或是單獨定義，本文所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 技術(shù)人員共知的、無歧義的相同含義。本文所提及的所有已公開的專利申請和參考文獻均 已通過完整引用的方式并入本申請中。

圖1為本發(fā)明的工作原理示意圖。首先確定要克隆的目的基因、目的載體和插入位點，然后設(shè)計、合成嵌合體引物， 實施一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dpn I消化去除攜帶甲基化的模板 質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，經(jīng)過夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌落測序驗證和酶切鑒定。嵌合體引物設(shè)計和一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR是本技術(shù)的核心所在，其主要用 處包括兩個方面一是使目的基因與目的載體在預(yù)定位點融合成為線性片段，二是利用長 距離PCR大量擴增獲得此類融合線性片段，以保證得到高陽性率的重組質(zhì)粒。圖2豬肌抑素基因結(jié)構(gòu)示意圖豬肌抑素基因轉(zhuǎn)錄區(qū)(黑色長方形)上游3· 81Λ和2. 3kb的片段(白色長方形)作 為啟動子候選序列，克隆到報告載體pGL3-basiC (黑色線條)的螢火蟲熒光素酶基因(灰 色長方形)上游用于檢測其轉(zhuǎn)錄活性。這兩段候選序列均包含了真核生物轉(zhuǎn)錄起始的必需 元件CAAT盒(黑色橢圓)與TATA盒(黑色三角形)。豬肌抑素基因的轉(zhuǎn)錄方向用黑色箭 頭表示。圖3—步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR擴增豬肌抑素啟動子與報告載體pGL3-basiC 的線性融合片段豬肌抑素啟動子候選序列的長度分別為3. Skb和2. 31Λ，報告載體pGL3-basiC的 長度是4. 81Λ，設(shè)計的插入位點是螢火蟲熒光素酶基因的上游，因此融合線性片段的理論長 度分別是8. 6kb和7. 11Λ。1 %瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物可見清晰的8. 6kb和7. Ikb條 帶，另外的3. Skb和2. 3kb的條帶則分別是候選序列自身的擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)果與預(yù)先的 設(shè)計完全吻合。圖4重組質(zhì)粒的純化和酶切鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)測序分析后，經(jīng)提取純化結(jié)合單酶切進一步確認其真實性。因為在豬 肌抑素啟動子候選序列中間有一個天然的Bgl II酶切位點，而pGL3-basiC的單克隆位點 處也有一個Bgl II酶切位點，因此用Bgl II單酶切重組質(zhì)粒，則應(yīng)該切出兩條帶。由圖示 的電泳結(jié)果可知，含有3. Skb候選序列的重組質(zhì)粒經(jīng)Bgl II酶切后，產(chǎn)生的兩條片段的長 度分別為2. 7kb和5. 9kb ；含有2. 3kb的重組質(zhì)粒經(jīng)Bgl II酶切后，產(chǎn)生的兩條片段的長 度分別為1. 21Λ和5. 9kb0這與理論分析完全相符，表明通過運用本發(fā)明所提供的基因克隆 技術(shù)，已將豬肌抑素啟動子候選序列以無縫形式融合到報告載體pGL3-basiC質(zhì)粒上。
圖 5 重組質(zhì)粒 pGL3-mstn_3. 8kb 序列SEQ ID No :5，下劃線部分表示插入的豬肌抑素啟動子候選序列，限制性內(nèi)切酶 Bgl II位點用方框表示，斜體部分表示嵌合體引物的載體同源序列，下劃線加黑部分表示 目的基因引物序列。圖 6 重組質(zhì)粒 pGL3-mstn_2. 3kb 序列SEQ ID No :6，下劃線部分表示插入的豬肌抑素啟動子候選序列，限制性內(nèi)切酶 Bgl II位點用方框表示，斜體部分表示嵌合體引物的載體同源序列，下劃線加黑部分表示 目的基因引物序列。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體實驗條件和 方法者，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社， 2002，分子克隆實驗指南第三版所建議的條件。實施例1設(shè)計、合成用于克隆豬肌抑素啟動子的嵌合體引物。豬肌抑素基因5’端3. 81Λ和2. 3b的片段作為其啟動子候選序列，克隆到報告載體pGL3-basic的螢火蟲熒光素酶基因的5’端，以利于候選通過檢測熒光素酶的表達測試候 選序列的轉(zhuǎn)錄活性。根據(jù)本發(fā)明的工作原理，針對兩段候選序列分別設(shè)計嵌合體引物(為 了方便區(qū)分，以其長度對引物命名)，序列如下3. 8kb-pF :5’ gctcgagatctgcgatctaagtaag cttggCATCATTAAACTTCTGACAAGCC3，(SEQ ID No :1，大寫字母所代表的是與豬肌抑素 3. 81Λ 啟動子候選序列5’末端同源的引物，小寫字母代表的是與pGL3-basiC插入位點5’末端同 源的引物)2. 3kb-pF :5，gctcgagatctgcgatctaagtaagcttggGTGCCATGAGTATTGATTCTGGAG3， (SEQ ID No :2，大寫字母所代表的是與豬肌抑素2. 31Λ啟動子候選序列5’末端同源的引 物，小寫字母代表的是與pGL3-basiC插入位點5’末端同源的引物)pR 5'catggtggctttac caacagtaccggaatg CGCCAAGCAAAATTTTAATGCC 3，(SEQ ID No :3，大寫字母所代表的是與豬 肌抑素3. Skb啟動子候選序列3’末端同源的引物，小寫字母代表的是與pGL3-basiC插入 位點 3，末端同源的引物)PlR :5，ccaagcttacttagatcgcagatctcgagc 3，(SEQ ID No :4, PF引物小寫字母部分的反向互補序列)所有引物由上海英駿生物科技有限公司合成，以干粉形式分裝、運輸、保存。引物 用TE緩沖液(ph = 8. 0)稀釋為1(^!1101/1的溶液，-201保存?zhèn)溆?。實施?—步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR擴增豬肌抑素啟動子與報告載體 pGL3-basic的線性融合片段。i)試劑與材料來源高保真DNA聚合酶KOD plus及其配套的緩沖液(IOXbuffer)，dNTP，硫酸鎂MgSO4 均購自東洋紡生物科技有限公司，貨號為K0D-201，-20°C凍存。豬基因組DNA按照常規(guī)的 酚仿抽提法進行，_20°C凍存。目的載體pGL3-basiC按照北京天根生物科技有限公司提供 的小提中量超純質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進行，-20°C凍存。ii)體系組成擴增3. Skb和2. 3kb的片段只有pF引物不同，其余成分相同。
權(quán)利要求
1.一種無縫基因克隆方法，其特征在于，包括如下步驟(1)根據(jù)目的基因和目的載體的序列，設(shè)計、合成三條引物pF，pR，PlR ；其中PF為嵌 合體引物，包括Pl引物和P2引物兩部分，Pl引物序列與目的載體插入位置5’端的20-30 個堿基的序列相同，P2引物序列與目的基因5’端的20-30個堿基的序列相同；PR也為嵌合體引物，由P3引物和P4引物兩部分構(gòu)成，P3引物序列與目的載體插入位 置3’端的20-30個堿基的序列相同，P4引物序列與目的基因3’端的20-30個堿基的序列 相同；PlR引物序列為Pl引物的反向互補序列； 引物P2，P4和PlR的 ιι值保持一致；(2)實施一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR，獲得融合線性片段；反應(yīng)體系由如下成分組成1化？，？1 沖11 引物；^)含有目的基因的DNA模板；iii)目 的載體模板；iv)dNTP ；ν)高保真DNA聚合酶KOD plus ；vi)與KOD plus配套使用的PCR緩 沖液；vii)硫酸鎂MgSO4 ；viii)超純水；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘；95°C變性15秒，退火溫度為(Tm_5) °C，時間持續(xù)30 秒，延伸溫度為68°C，持續(xù)時間按照1000堿基/分鐘設(shè)定；循環(huán)數(shù)為30 ；(3)DpnI消化PCR產(chǎn)物，去除帶甲基化的模板質(zhì)粒DNA ；(4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α ；(5)挑取單克隆菌落測序鑒定；(6)酶切確認重組質(zhì)粒的整合情況。
2.如權(quán)利要求1所述的無縫基因克隆方法，其特征在于，所述的/消化PCR產(chǎn)物， 去除帶甲基化的模板質(zhì)粒DNA，反應(yīng)體系組成是PCR產(chǎn)物26μ1，IOXBuffer Tango 3μ1， Dpn I μ ；反應(yīng)條件是37°C水浴鍋中溫育池。
3.如權(quán)利要求1或2所述的無縫基因克隆方法，其特征在于，所述含有目的基因的DNA 模板是質(zhì)粒DNA或基因組DNA，或經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。
4.如權(quán)利要求3所述的無縫基因克隆方法，其特征在于，所述目的載體模板是從非甲 基化缺陷的大腸桿菌菌株純化而來。
5.如權(quán)利要求1或2所述的無縫基因克隆方法，其特征在于，所述目的基因是豬肌抑素 基因的啟動子序列，長度分別為3. Skb和2. 3kb ；選擇的目的載體是熒光素酶報告基因載體 pGL3_basic0
6.如權(quán)利要求5所述的無縫基因克隆方法，其特征在于，所用引物序列為·3. 8kb-pF:5’ gctcgagatctgcgatctaagtaagcttggCATCATTAAACTTCTGACAAGCC3’ 2. 3kb-pF:5’ gctcgagatctgcgatctaagtaagcttggGTGCCATGAGTATTGATTCTGGAG3’ pR:5' catggtggctttaccaacagtaccggaatg CGCCAAGCAAAATTTTAATGCC 3' PlR:5' ccaagcttacttagatcgcagatctcgagc 3'。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不含有人工堿基的無縫基因克隆方法，步驟有:i)根據(jù)目的基因和目標載體的序列，設(shè)計、合成嵌合體引物；ii)實施一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR,獲得融合線性片段；iii)DpnI消化PCR產(chǎn)物,去除帶甲基化的模板質(zhì)粒DNA;iv)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α；v)挑取單克隆菌落測序鑒定；vi)酶切確認重組質(zhì)粒的整合情況。該方法不需要特殊的限制性內(nèi)切酶和連接酶以及堿性磷酸酶，而且可以將任意目的基因融入任意目標載體的任意位置。該方法原理簡單，操作簡便，位點精確可控，陽性率高，適用范圍廣。
文檔編號C12N15/70GK102080075SQ201010582369
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者喬憲鳳, 劉西梅, 華再東, 華文君, 周荊榮, 張立蘋, 李莉, 畢延震, 肖紅衛(wèi), 鄭新民, 魏慶信 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所