專利名稱：葡萄芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病原菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子調(diào)控序列的應(yīng)用，特別是涉及葡萄芪 合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
應(yīng)用生物技術(shù)手段進(jìn)行抗病基因工程研究，需要獲得具有對(duì)病原菌侵染特異響應(yīng) 的啟動(dòng)子。在眾多的研究中，抗菌蛋白的組成型表達(dá)以及與產(chǎn)生抗菌代謝物或組成型激活 抗性相關(guān)酶的表達(dá)，不僅影響植物的生長(zhǎng)勢(shì)與產(chǎn)量、干擾植物的生理活性，而且增加了植物 對(duì)其它病原菌的感病性。病原菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子在未受病原菌侵染時(shí)，具有較低的表達(dá)水平使 其低于產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)的閾值；當(dāng)植物受病原菌攻擊時(shí)啟動(dòng)子被激活，從而可以有效降低對(duì) 植物產(chǎn)生的負(fù)面影響。應(yīng)用病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以減少 組成型表達(dá)植物防御相關(guān)組分產(chǎn)生的非目標(biāo)性狀的副產(chǎn)物。作為具有應(yīng)用前景的廣譜抗病基因工程是通過引入病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的 相應(yīng)抗性基因來實(shí)現(xiàn)，在病原菌入侵后引發(fā)的超敏反應(yīng)。通過這一途徑，病原菌攻擊誘導(dǎo)植 物自身誘導(dǎo)因子表達(dá)產(chǎn)生相關(guān)的R蛋白，從而引發(fā)超敏反應(yīng)。目前，病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克 隆可通過從大量被鑒定的病原菌響應(yīng)候選基因中獲得。這些候選基因主要存在于能被不同 病原菌，包括病毒，細(xì)菌、真菌、卵菌和昆蟲激活的誘導(dǎo)抗病途徑中。病原菌響應(yīng)基因如谷胱 甘肽轉(zhuǎn)移酶、病程相關(guān)蛋白、苯丙氨酸合成途徑中的芪合成酶基因、產(chǎn)生抗菌次生代謝物的 相關(guān)酶與涉及信號(hào)分子生物合成途徑中具有抗病作用的一些酶，可能會(huì)存在適合進(jìn)行廣譜 抗病基因工程的候選啟動(dòng)子。在葡萄屬植物芪合成酶基因工程中，應(yīng)用較多的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Vstl是國外學(xué)者 從感病歐洲葡萄中克隆分離的芪合成酶基因啟動(dòng)子。然而，有關(guān)葡萄屬植物芪合成酶基因 啟動(dòng)子在抗性種質(zhì)中分離克隆尚未見報(bào)道。因此，從中國葡萄屬野生種這一特異資源中分 離克隆芪合成酶基因啟動(dòng)子，對(duì)于填補(bǔ)國內(nèi)空白及進(jìn)一步應(yīng)用于植物抗病改良，具有重要 的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，將分離克隆的葡萄屬植物抗性種質(zhì)中芪合成酶基因特異病原 菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列應(yīng)用于植物抗病性改良，從而提高植物對(duì)病原菌的抗性。本發(fā)明是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的在人工接種葡萄白粉菌后，應(yīng)用半定量RT-PCR法分析中國葡萄屬野生種華東葡 萄株系白河-35-1葉片組織中芪合成酶基因表達(dá)模式，克隆芪合成酶基因的cDNA序列 與gDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)一步分離獲得了芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列 1772bp (GenBank登錄號(hào)為FJ60M84)，在此基礎(chǔ)上采用染色體步移法分離克隆這種抗性 葡萄種質(zhì)中的芪合成酶基因上游啟動(dòng)子序列，對(duì)克隆的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù) 測(cè)分析并構(gòu)建啟動(dòng)子與報(bào)告基因及啟動(dòng)子與目標(biāo)基因的融合載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真
6空滲透法在感病葡萄中進(jìn)行活性驗(yàn)證，及應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法在煙草中驗(yàn)證啟 動(dòng)子活性，進(jìn)一步將中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子分別與所克隆的中 國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因cDNA與gDNA融合，構(gòu)建PvpSTS: VpSTS cDNA與 PvpSTS: VpSTS gDNA植物表達(dá)載體，應(yīng)農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)法分析的抗病芪合成酶基因在煙 草、蕃茄等植物中的病原菌誘導(dǎo)性表達(dá)。本發(fā)明克隆的病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是應(yīng)用染色體步移法，通過兩輪巢式PCR獲得 了目標(biāo)基因側(cè)翼序列，該方法步移距離較長(zhǎng)、速度較快，特別適用于遺傳背景不是很清楚的 情況下，通過分子標(biāo)記克隆其它植物的未知新基因以及具有高度重復(fù)序列或具有復(fù)雜結(jié)構(gòu) 的核苷酸片段的染色體步移等，本發(fā)明克隆的啟動(dòng)子序列的調(diào)控模式不同于感病歐洲葡萄 芪合成酶基因啟動(dòng)子的調(diào)控模式，是一種新型的病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，從而為植物抗病基 因工程提供了另一種候選資源。


附圖1是本發(fā)明中國葡萄屬野生種華東葡萄葉片接種白粉病后芪合成酶基因特 異表達(dá)模式的圖片。附圖2是本發(fā)明中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子與GUS融合載體 在感病歐洲葡萄佳利釀中的GUS組織化學(xué)染色與熒光定量分析圖片。附圖3是本發(fā)明高效液相色譜檢測(cè)未接種轉(zhuǎn)化煙草中白藜蘆醇含量的圖片。附圖4是本發(fā)明高效液相色譜檢測(cè)煙草赤星病接種后轉(zhuǎn)化煙草中白藜蘆醇含量 的圖片。附圖5是本發(fā)明轉(zhuǎn)化煙草中白藜蘆醇含量比較的圖片。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述實(shí)施例一a.采用張今今等2003《果樹學(xué)報(bào)》改進(jìn)SDS/酚法，在接種白粉菌0h、Mh、48h、 72h、96h、120h和144h后，采集的葉片，提取總RNA，根據(jù)GenBank中已登錄的葡萄芪合成 酶基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)包括芪合成酶基因起始密碼和終止密碼的基因5’端及3’引物，分 另Ij 為 STS-F :5，-ATGGCTTCAGTTGAGGAAAT-3，和 STS-R :5，-TTAATTTGTAACCATAGG-3，，分 別以葡萄白粉菌誘導(dǎo)不同時(shí)間段的葡萄葉片提取的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物作為模板進(jìn) 行半定量RT-PCR擴(kuò)增，葡萄延伸因子EFl γ作為組成型內(nèi)參，設(shè)計(jì)一對(duì)引物EF1 Y-F 5，-GCGGGCAAGAGATACCTCAA-3，和 EFl γ-R :5，-GCGGGCAAGAGATACCTCAA-3，，PCR 擴(kuò)增體系 為10 X LA Buffer 2. 5 μ L, dNTPs4 μ L, LA Taq 0. 25 μ L, STS-F/STS-R 各 0· 5 μ L，模板 DNAdOOng. ΟΟ. 5μ L，ddH20補(bǔ)齊至 25μ L，STS 基因 PCR擴(kuò)增條件為-MV lmin，94°C 30s, 57°C lmin，72°C 2min，四個(gè)循環(huán)，72°C 5min,內(nèi)參EFl y 的擴(kuò)增條件為:94°C lmin，94°C 30s, 50°C lmin,72°C 2min，25個(gè)循環(huán)，72°C 5min，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，回收 并測(cè)序，目標(biāo)基因表達(dá)強(qiáng)度用Bioimaging Systems software分析，中國葡萄屬野生種華東 葡萄在接種白粉菌后的不同時(shí)期芪合成酶基因的表達(dá)呈現(xiàn)出不同于已報(bào)道的感病歐洲葡 萄品種Optima的典型“雙峰”表達(dá)模式，在與白粉菌互作的早期，即0-72h，芪合成酶基因表達(dá)量急劇下降，接種72h的表達(dá)量最低，然后又逐漸增大(圖1)，這種表達(dá)模式表明其具有 不同于感病歐洲葡萄品種的特異調(diào)節(jié)模式；b.根據(jù)獲得的VpSTS gDNA-Ι序列設(shè)計(jì)兩條引物，VpSTS-Sl 5， -GTGCCTTCAATGCTGCTTCCTTACC-3，與 VpSTS_S2 :5’ -CTGGTAGACACAGTGGTCGGGAGTAG-3， ，應(yīng)用染色體步移法擴(kuò)增中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子序列，首先，取 10 μ g中國野生華東葡萄白河-35-1基因組DNA分別用限制性內(nèi)切酶BamH I，EcoR I，Hind III，PstI, Sal I，^CbaI進(jìn)行酶切，構(gòu)建中國野葡萄華東葡萄白河_35_1基因組限制性酶 切庫。酶切后的DNA用氯仿異戊醇抽提，加入2V的無水乙醇和1/10V的3M NaAc,混勻， 13000rpm離心lOmin，沉淀用75%酒精洗滌1次，自然干燥后溶于20 μ L去離子水中，取 5 μ L用于連接反應(yīng)，體系為酶切純化后的gDNA 5 μ L，Casstte接頭2. 5 μ L，Ligation I 15 μ L, Ligation 117. 5 μ L，于16°C連接3_10h，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行乙醇沉淀回收DNA，溶解 于5μ L的滅菌水中，以連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行兩輪巢式PCR擴(kuò)增VpSTS上游調(diào)控序列，在 第一輪巢式PCR中，將純化后的連接產(chǎn)物IyL加入到33. 5μ L滅菌水中，94°C加熱IOmin ； 再加入 10XLA PCR BufferII (Mg2+Plus) 5 μ L, TaKaRaLA Taq 0. 5 μ L，接頭引物 Cll μ L， VpSTS-Sl 1 μ L, PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C lmin，94°C 30sec，55°C 2min，72°C 4min，29 個(gè)循環(huán)， 72°C 5min,然后，取2 μ L IstPCR反應(yīng)液稀釋10倍，再取1 μ L作為模板，所用引物為C2與 VpSTS S-2進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件同1st PCR，反應(yīng)結(jié)束后，在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上 檢測(cè)，回收目標(biāo)片段，克隆至pMD-19VeCtor，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在Amp LB平板進(jìn)行 藍(lán)白斑篩選，并經(jīng)菌液PCR及酶切鑒定，第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果，在瓊脂糖凝膠上為彌散帶，經(jīng) 過第二輪巢式PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)單一的目標(biāo)條帶，其中經(jīng)EcoR I酶切過的基因組DNA樣品擴(kuò) 增出一條1. 8kb左右的特異帶，同樣，經(jīng)Bam HI酶切的基因組DNA樣品擴(kuò)增出一條1. 8kb 的特異帶，將這兩條特異帶回收、測(cè)序分析，獲得中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因 啟動(dòng)子序列1772bp ；c.將獲得的中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子序列與感病歐洲葡 萄Optima芪合成酶基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，兩者同源性為56.對(duì)％，證明所克隆到的啟 動(dòng)子為一種新的芪合成酶基因啟動(dòng)子，在啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站PlantCARE進(jìn)行元件預(yù)測(cè)分析， 發(fā)現(xiàn)該中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)序列包含許多重要的、與逆境脅迫 相關(guān)的順式作用元件，在距該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游的-116 -113bp有典型的 TATA-box及-25 -22bp處有1個(gè)CAAT_box元件，其它一些脅迫誘導(dǎo)調(diào)控元件，如Box-Wl， TC-rich repeat element, ABRE, MBS, LTR等也出現(xiàn)在啟動(dòng)子的不同區(qū)段，其中Box-Wl與 真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件的核心保守序列相似，TC-richrepeats與防御與脅迫響應(yīng)元件有關(guān)，MBS 元件是MYB同系物的DNA結(jié)合靶序列，ABRE為的脫落酸響應(yīng)元件，LTR是低溫誘導(dǎo)元件，存 在于中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子中的這些調(diào)控元件，多數(shù)元件參與環(huán) 境脅迫響應(yīng)，這證明中國野生華東葡萄芪合成基因啟動(dòng)子在防御反應(yīng)中可能具有重要的調(diào) 控作用。實(shí)施列二 構(gòu)建該啟動(dòng)子與報(bào)告基因GUS的融合載體，并在轉(zhuǎn)化煙草、感病歐洲 葡萄佳利釀中進(jìn)行驗(yàn)證，首先選用pCAMBIA0380、pCAMBIA0390與pCAMBIA1391為目標(biāo)質(zhì) 粒，用 Nco I/BstE II 酶切 pCAMBIA1391 釋放 1854bp 的 GUS 基因并克隆至 pCAMBIA0380、 PCAMBIA0390,從而構(gòu)建pC0380:⑶S與pC0390:⑶S，在獲得2個(gè)⑶S融合瞬時(shí)表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，通過Hindlll/BamHI酶切pBI121釋放的835bp的CaMV35S啟動(dòng)子片段克隆至 PC0390:⑶S構(gòu)建了 pC35:⑶S，在植物轉(zhuǎn)化中作為陽性對(duì)照，同時(shí)將1772bp的中國葡萄屬 野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子克隆至pC0380::GUS中構(gòu)建了啟動(dòng)子與GUS融合的表 達(dá)載體PvpSTS ⑶S，采用電擊法將構(gòu)建的表達(dá)載體PvpSTS ⑶S與pC35S ⑶S入根癌農(nóng)桿 菌菌株GV3101，用于瞬時(shí)表達(dá)分析啟動(dòng)子，將克隆的啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合，在感病歐 洲葡萄佳利釀及模式植物煙草中進(jìn)行白粉菌或赤星病誘導(dǎo)表達(dá)，在病原菌接種后的葡萄或 煙草葉片組織中檢測(cè)到高表達(dá)的白藜蘆醇，同時(shí)轉(zhuǎn)化的葡萄與煙草對(duì)病原菌的抗性顯著高 于未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株。實(shí)施例三通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法，將離體葡萄葉片浸入農(nóng)桿菌工程菌菌 液，并用0. 22 μ m的微孔濾膜覆蓋，然后置于水循環(huán)式真空泵SHZ-III中進(jìn)行抽真空處理， 當(dāng)真空泵壓強(qiáng)指針為0. 085MPa時(shí)開始計(jì)時(shí)，30min后緩慢釋放氣體，將滲透后的葉片組織 取出，用滅菌吸水紙去除材料表面多余的農(nóng)桿菌，然后葉片遠(yuǎn)軸面朝上置于托盤中，并將葉 柄置于兩層滅菌水潤(rùn)濕的脫脂棉中，并用保鮮膜覆蓋，啟動(dòng)子GUS基因融合載體轉(zhuǎn)入感病 歐洲葡萄佳利釀葉片組織后，檢測(cè)葡萄白粉菌接種后GUS基因的表達(dá)變化規(guī)律，滲透處理 后的葡萄葉片在人工智能氣候箱中培養(yǎng)4 后，采用壓片接種法接種葡萄白粉菌，接種后 的葡萄葉片繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，用滅菌水將接種后的葡萄葉片潤(rùn)洗干凈，然后進(jìn)行 ⑶S組織化學(xué)及熒光定量分析，在⑶S組織化學(xué)分析中，組成型CaMV35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的葡萄 葉片，在白粉菌接種前后均能染色，WT在接種前后均未能染色，芪合成酶基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的 葡萄葉片，在未接種的對(duì)照葉片上染色區(qū)域較小，而在白粉菌接種后的葉片上染色區(qū)域較 大，從而證明該啟動(dòng)子為病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，GUS熒光定量分析結(jié)果與組織化學(xué)染色結(jié)果 一致，該啟動(dòng)子對(duì)病原菌的誘導(dǎo)活性為對(duì)照葉片組織的3. 37倍(圖2)。實(shí)施例四應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法對(duì)獲得的中國葡萄屬野生種華東葡萄芪 合成酶基因啟動(dòng)子在異源組織煙草中進(jìn)行病原菌誘導(dǎo)功能的鑒定，在溫室中生長(zhǎng)6周后的 煙草NC89用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，用稀釋后的農(nóng)桿菌菌液注射煙草葉片表皮細(xì)胞前，將煙草從氣候 箱中取出，并置于白熾燈光下lh，使氣孔完全開放，沿?zé)煵葜髅}兩側(cè)各選2到3個(gè)注射點(diǎn)，用 無針頭的注射器在煙草背面的注射點(diǎn)的0. 5cm2范圍內(nèi)進(jìn)行輕微摩擦或用針刺以去除蠟質(zhì) 角質(zhì)層，用ImL的無針頭的注射器吸取準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液，在選擇好的注射點(diǎn)，將針頭抵 住，緩慢將菌液注入煙草葉片的細(xì)胞間隙，使菌液盡可能滲透到整個(gè)葉片，滲透后的煙草植 株覆蓋保鮮膜，放回氣候培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2d后，進(jìn)行病原菌接種，收集葉片，一部分用于GUS染 色組織化學(xué)分析，一部分液氮速凍后于-80°C冰箱保存?zhèn)溆?，采用GUS組織化學(xué)染色法與熒 光定量法對(duì)中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子的病原菌誘導(dǎo)特性進(jìn)行功能 分析，組織化學(xué)染色結(jié)果表明，該啟動(dòng)子對(duì)赤星病侵染具有誘導(dǎo)表達(dá)特性，GUS熒光定量分 析結(jié)果也進(jìn)一步證明該啟動(dòng)子對(duì)赤星病侵染具有較強(qiáng)的響應(yīng)效應(yīng)，其誘導(dǎo)的GUS基因表達(dá) 活性是未接種病原對(duì)照(Mock)的2. 35倍，這一結(jié)果進(jìn)一步說明，中國葡萄屬野生種華東葡 萄芪合成酶基因啟動(dòng)子在異源表達(dá)系統(tǒng)煙草中同樣具有病原菌誘導(dǎo)活性，為一病原菌誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子。實(shí)施例五將中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子分別與所克隆的中 國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因cDNA與gDNA融合，構(gòu)建PvpSTS:: VpSTS cDNA與 PvpSTS: VpSTS gDNA植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化在煙草中進(jìn)行表達(dá)分析，
9農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化后的煙草培養(yǎng)4 后，進(jìn)行煙草赤星病接種，并繼續(xù)培養(yǎng)Mh，應(yīng)用高效液 相色譜法(HPLC)檢測(cè)轉(zhuǎn)化煙草中白藜蘆醇的表達(dá)量，稱取Ig新鮮煙草葉片，置于預(yù)冷的 研缽中避光充分研磨，將固體粉沫轉(zhuǎn)入離心管中，用3ml 80%甲醇潤(rùn)洗研缽3次，并用6ml 80%甲醇將管壁中的殘余粉沫洗滌干凈，用超聲波清洗器在15°C，100W條件下提取30min， 4°C靜置提取10h，樣品在室溫5500rpm離心15min，將分離出的上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空 狀態(tài)下25°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至:3ml，分別加入10ml、5ml、5ml乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相， 用25ml、3%碳酸氫鈉洗滌3次，使乙酸乙酯相與水相分離并棄去水相，然后分別用25ml的 去離子水洗滌3次乙酸乙酯相，棄去水相，將乙酸乙酯相真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，加入3ml色 譜甲醇溶解樣品避光保存到-80°C冰箱中待測(cè)，然后配制白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用萬分之一 天平精密稱取0. 009g白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜甲醇定容至IOOml并保存于棕色容量瓶中 作為貯存液，置于_80°C冰箱中，分別吸取ImL,0. 7mL、0. 3mL與166. 7 μ L、66. 7 μ L、10 μ L 的貯存液，用色譜甲醇定容至IOOmL,配置成0. 9,0. 63,0. 27,0. 15,0. 06與0. 009mg.廠1的 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取對(duì)照品溶液在220-450nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，確定白藜蘆 醇的檢測(cè)波長(zhǎng)，色譜分離條件為色譜柱為5μπι 4. 6 X 250mm的Agilent ZORBAX SB-C18, 流動(dòng)相A為0. 5 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相洗脫程序?yàn)?-8min，10 % -18 % B，8-10min，18 % B, 10_15min，18 % -25 % B ；15_18min，25 % -35 % B ；18_25min，35 % B, 25-30min,35% -70% B，流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)306nm，柱溫30°C，進(jìn)樣量為20 μ L，含量 計(jì)算方法采用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，應(yīng)用HPLC法對(duì)提取的不同樣品的白藜蘆醇進(jìn)行檢測(cè)，野生 型對(duì)照在未接種病原菌與接種病原菌的葉片組織中在保留時(shí)間為20min時(shí)幾乎檢測(cè)不到 白藜蘆醇，以PvpSTS: VpSTS cDNA與PvpSTS VpSTS gDNA轉(zhuǎn)化的煙草葉片中，在病原菌誘 導(dǎo)后檢測(cè)到的白藜蘆醇含量(圖幻均高于未接種葉片中的白藜蘆醇含量(圖4)，其中，以 PvpSTS: VpSTS gDNA轉(zhuǎn)化的葉片組織在病原菌誘導(dǎo)后含量最高，為2. 81g. 誘導(dǎo)后的含 量是未接種病原菌葉片中白藜蘆醇含量的3. 4倍(圖幻，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植物對(duì)病原菌的抗 性明顯增強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.葡萄芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，是在人工接種葡萄白粉菌后， 應(yīng)用半定量RT-PCR法分析中國葡萄屬野生種華東葡萄株系白河-35-1葉片組織中芪合成 酶基因表達(dá)模式，克隆芪合成酶基因的cDNA序列與gDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)一步分離 獲得了芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列1772bp，其特征在于采用染色體步移法分 離克隆這種抗性葡萄種質(zhì)中的芪合成酶基因上游啟動(dòng)子序列，對(duì)克隆的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順 式作用元件預(yù)測(cè)分析并構(gòu)建啟動(dòng)子與報(bào)告基因及啟動(dòng)子與目標(biāo)基因的融合載體，通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的真空滲透法在感病葡萄中進(jìn)行活性驗(yàn)證，及應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法在煙草 中驗(yàn)證啟動(dòng)子活性，進(jìn)一步將中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子分別與所 克隆的中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因cDNA與gDNA融合，構(gòu)建PvpSTS: VpSTS cDNA與PvpSTS VpSTS gDNA植物表達(dá)載體，應(yīng)農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)法分析的抗病芪合成酶基 因在煙草、蕃茄等植物中的病原菌誘導(dǎo)性表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，其特征在于2. a采用改進(jìn)SDS/酚法，在接種白粉菌0h、24h、48h、72h、96h、120h和144h后， 采集的葉片，提取總RNA，根據(jù)GenBank中已登錄的葡萄芪合成酶基因序列設(shè)計(jì)一 對(duì)包括芪合成酶基因起始密碼和終止密碼的基因5’端及3’引物，分別為STS-F 5，-ATGGCTTCAGTTGAGGAAAT-3，和 STS-R :5，-TTAATTTGTAACCATAGG-3，，分別以葡萄 白粉菌誘導(dǎo)不同時(shí)間段的葡萄葉片提取的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行半 定量RT-PCR擴(kuò)增，葡萄延伸因子EFlY作為組成型內(nèi)參，設(shè)計(jì)一對(duì)引物EF1Y-F 5，-GCGGGCAAGAGATACCTCAA-3，和 EFl γ-R :5，-GCGGGCAAGAGATACCTCAA-3，，PCR 擴(kuò)增體系 為10 X LA Buffer 2. 5 μ L, dNTPs 4 μ L, LA Taq 0. 25 μ L, STS-F/STS-R 各 0· 5 μ L，模板 DNAdOOng. ΟΟ. 5μ L，ddH20補(bǔ)齊至 25μ L，STS 基因 PCR擴(kuò)增條件為-MV lmin，94°C 30s, 57°C lmin，72°C 2min，四個(gè)循環(huán)，72°C 5min,內(nèi)參EFl γ 的擴(kuò)增條件為:94°C lmin，94°C 30s, 50°C lmin,72°C 2min，25個(gè)循環(huán)，72°C 5min，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，回收 并測(cè)序，目標(biāo)基因表達(dá)強(qiáng)度用Bio imaging Systems software分析；2.b根據(jù)獲得的VpSTS gDNA-Ι序列設(shè)計(jì)兩條引物，VpSTS-Sl 5’ -GTGCCTTCAATGCTGCTTCCTTA CC-3’ 與 VpSTS-S 2 :5’ -CTGGTAGACACAGTGGTCGGGAGTAG-3 ’，應(yīng)用染色體步移法擴(kuò)增中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子序列，取IOyg 中國野生華東葡萄白河-35-1基因組DNA分別用限制性內(nèi)切酶BamH I,EcoR I,Hind III， Pst I,Sal I,Xba I進(jìn)行酶切，構(gòu)建中國野葡萄華東葡萄白河_35_1基因組限制性酶切庫。 酶切后的DNA用氯仿異戊醇抽提，加入2V的無水乙醇和1/10V的3MNaAc，混勻，13000rpm 離心lOmin，沉淀用75%酒精洗滌1次，自然干燥后溶于20 μ L去離子水中，取5 μ L用 于連接反應(yīng)，體系為酶切純化后的gDNA 5yL, Casstte接頭2.5 μ L，LigationI15 μ L, Ligati0nII7. 5yL，于16°C連接3_10h，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行乙醇沉淀回收DNA，溶解于5 μ L 的滅菌水中，以連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行兩輪巢式PCR擴(kuò)增VpSTS上游調(diào)控序列，在第一輪 巢式PCR中，將純化后的連接產(chǎn)物1 μ L加入到33. 5 μ L滅菌水中，94°C加熱IOmin ；再加 入 10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5 μ L, TaKaRa LA Taq 0.5yL，接頭引物 Cl 1 μ L, VpSTS-Sl 1 μ L, PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C lmin, 94°C 30sec, 55°C 2min, 72°C 4min, 29 個(gè)循環(huán)， 72°C 5min,然后，取2 μ L IstPCR反應(yīng)液稀釋10倍，再取1 μ L作為模板，所用引物為C2與VpSTSS-2進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件同IstPCR,反應(yīng)結(jié)束后，在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上檢 測(cè)，回收目標(biāo)片段，克隆至pMD-19VeCtor，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在Amp LB平板進(jìn)行藍(lán) 白斑篩選，并經(jīng)菌液PCR及酶切鑒定，第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果，在瓊脂糖凝膠上為彌散帶，經(jīng)過 第二輪巢式PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)單一的目標(biāo)條帶，其中經(jīng)EcoR I酶切過的基因組DNA樣品擴(kuò)增 出一條1. Skb左右的特異帶，同樣，經(jīng)Bam HI酶切的基因組DNA樣品擴(kuò)增出一條1. Skb的 特異帶，將這兩條特異帶回收、測(cè)序分析，獲得中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟 動(dòng)子序列1772bp ；2.c將獲得的中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子序列與感病歐洲葡萄 Optima芪合成酶基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，兩者同源性為56.對(duì)％，證明所克隆到的啟動(dòng) 子為一種新的芪合成酶基因啟動(dòng)子，在啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站PlantCARE進(jìn)行元件預(yù)測(cè)分析， 發(fā)現(xiàn)該中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)序列包含許多重要的、與逆境脅迫 相關(guān)的順式作用元件，在距該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游的-116 -113bp有典型的 TATA-box及-25 -22bp處有1個(gè)CAAT_box元件，其它一些脅迫誘導(dǎo)調(diào)控元件，如Box-Wl， TC-rich repeat element，ABRE，MBS，LTR等也出現(xiàn)在啟動(dòng)子的不同區(qū)段，其中Box-Wl與真 菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件的核心保守序列相似，TC-rich repeats與防御與脅迫響應(yīng)元件有關(guān)，MBS 元件是MYB同系物的DNA結(jié)合靶序列，ABRE為的脫落酸響應(yīng)元件，LTR是低溫誘導(dǎo)元件，存 在于中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子中的這些調(diào)控元件，多數(shù)元件參與環(huán) 境脅迫響應(yīng)，這證明中國野生華東葡萄芪合成基因啟動(dòng)子在防御反應(yīng)中可能具有重要的調(diào) 控作用。
3.如權(quán)利要求1所述的葡萄芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，其特征 在于構(gòu)建該啟動(dòng)子與報(bào)告基因GUS的融合載體，并在轉(zhuǎn)化煙草、感病歐洲葡萄佳利釀中 進(jìn)行驗(yàn)證，選用 pCAMBIA0380、pCAMBIA0390 與 pCAMBIA1391 為目標(biāo)質(zhì)粒，用 Nco I/BstE II 酶切 pCAMBIA1391 釋放 1854bp 的 GUS 基因并克隆至 pCAMBIA0380、pCAMBIA0390,從 而構(gòu)建pC0380:⑶S與pC0390:⑶S，在獲得2個(gè)⑶S融合瞬時(shí)表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，通過 Hindi I I/Bam HI 酶切 pBI121 釋放的 835bp 的 CaMV!35S 啟動(dòng)子片段克隆至 pC0390: :GUS 構(gòu)建了 pC35::GUS，在植物轉(zhuǎn)化中作為陽性對(duì)照，同時(shí)將1772bp的中國葡萄屬野生種華 東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子克隆至PC0380: :GUS中構(gòu)建了啟動(dòng)子與GUS融合的表達(dá)載體 PvpSTS:⑶S，采用電擊法將構(gòu)建的表達(dá)載體PvpSTS:⑶S與pC35S:⑶S導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌 株GV3101，用于瞬時(shí)表達(dá)分析啟動(dòng)子，將克隆的啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合，在感病歐洲葡 萄佳利釀及模式植物煙草中進(jìn)行白粉菌或赤星病誘導(dǎo)表達(dá)，在病原菌接種后的葡萄或煙草 葉片組織中檢測(cè)到高表達(dá)的白藜蘆醇，同時(shí)轉(zhuǎn)化的葡萄與煙草對(duì)病原菌的抗性顯著高于未 轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株。
4.如權(quán)利要求1所述的葡萄芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，其特征在 于通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法，將離體葡萄葉片浸入農(nóng)桿菌工程菌菌液，并用0. 22μπι 的微孔濾膜覆蓋，然后置于水循環(huán)式真空泵SHZ-III中進(jìn)行抽真空處理，當(dāng)真空泵壓強(qiáng)指 針為0. 085MPa時(shí)開始計(jì)時(shí)，30min后緩慢釋放氣體，將滲透后的葉片組織取出，用滅菌吸水 紙去除材料表面多余的農(nóng)桿菌，然后葉片遠(yuǎn)軸面朝上置于托盤中，并將葉柄置于兩層滅菌 水潤(rùn)濕的脫脂棉中，并用保鮮膜覆蓋，啟動(dòng)子GUS基因融合載體轉(zhuǎn)入感病歐洲葡萄佳利釀 葉片組織后，檢測(cè)葡萄白粉菌接種后⑶S基因的表達(dá)變化規(guī)律，滲透處理后的葡萄葉片在人工智能氣候箱中培養(yǎng)4 后，采用壓片接種法接種葡萄白粉菌，接種后的葡萄葉片繼續(xù) 在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，用滅菌水將接種后的葡萄葉片潤(rùn)洗干凈，然后進(jìn)行GUS組織化學(xué)及熒 光定量分析，在GUS組織化學(xué)分析中，組成型CaMV35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的葡萄葉片，在白粉菌接 種前后均能染色，WT在接種前后均未能染色，芪合成酶基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的葡萄葉片，在未接 種的對(duì)照葉片上染色區(qū)域較小，而在白粉菌接種后的葉片上染色區(qū)域較大。
5.如權(quán)利要求1所述的葡萄芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，其特征在 于應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法對(duì)獲得的中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng) 子在異源組織煙草中進(jìn)行病原菌誘導(dǎo)功能的鑒定，在溫室中生長(zhǎng)6周后的煙草NC89用于瞬 時(shí)轉(zhuǎn)化，用稀釋后的農(nóng)桿菌菌液注射煙草葉片表皮細(xì)胞前，將煙草從氣候箱中取出，并置于 白熾燈光下lh，使氣孔完全開放，沿?zé)煵葜髅}兩側(cè)各選2到3個(gè)注射點(diǎn)，用無針頭的注射器 在煙草背面的注射點(diǎn)的0. 5cm2范圍內(nèi)進(jìn)行輕微摩擦或用針刺以去除蠟質(zhì)角質(zhì)層，用ImL的 無針頭的注射器吸取準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液，在選擇好的注射點(diǎn)，將針頭抵住，緩慢將菌液注 入煙草葉片的細(xì)胞間隙，使菌液盡可能滲透到整個(gè)葉片，滲透后的煙草植株覆蓋保鮮膜，放 回氣候培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2d后，進(jìn)行病原菌接種，收集葉片，一部分用于GUS染色組織化學(xué)分析， 一部分液氮速凍后于-80°C冰箱保存?zhèn)溆茫捎肎US組織化學(xué)染色法與熒光定量法對(duì)中國 葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子的病原菌誘導(dǎo)特性進(jìn)行功能分析，組織化學(xué)染 色結(jié)果表明，該啟動(dòng)子對(duì)赤星病侵染具有誘導(dǎo)表達(dá)特性，GUS熒光定量分析結(jié)果也進(jìn)一步證 明該啟動(dòng)子對(duì)赤星病侵染具有較強(qiáng)的響應(yīng)效應(yīng)，其誘導(dǎo)的GUS基因表達(dá)活性是未接種病原 對(duì)照(Mock)的2. 35倍。
6.如權(quán)利要求1所述的葡萄芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，其特征 在于將中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因啟動(dòng)子分別與所克隆的中國葡萄屬野生 種華東葡萄芪合成酶基因cDNA與gDNA融合，構(gòu)建PvpSTS: VpSTS cDNA與PvpSTS: VpSTS gDNA植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化在煙草中進(jìn)行表達(dá)分析，農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化 后的煙草培養(yǎng)4 后，進(jìn)行煙草赤星病接種，并繼續(xù)培養(yǎng)Mh，應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC) 檢測(cè)轉(zhuǎn)化煙草中白藜蘆醇的表達(dá)量，稱取Ig新鮮煙草葉片，置于預(yù)冷的研缽中避光充分研 磨，將固體粉沫轉(zhuǎn)入離心管中，用3ml 80%甲醇潤(rùn)洗研缽3次，并用6ml 80%甲醇將管壁中 的殘余粉沫洗滌干凈，用超聲波清洗器在15°C，100W條件下提取30min，4°C靜置提取10h， 樣品在室溫5500rpm離心15min，將分離出的上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空狀態(tài)下25V旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)至:3ml，分別加入10ml、5ml、5ml乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，用25ml、3 %碳 酸氫鈉洗滌3次，使乙酸乙酯相與水相分離并棄去水相，然后分別用25ml的去離子水洗滌 3次乙酸乙酯相，棄去水相，將乙酸乙酯相真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，加入3ml色譜甲醇溶解樣 品避光保存到_80°C冰箱中待測(cè)，然后配制白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用萬分之一天平精密稱取 0. 009g白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜甲醇定容至IOOml并保存于棕色容量瓶中作為貯存液，置 于_80°C冰箱中，分別吸取ImL,0. 7mL、0. 3mL與166. 7 μ L、66. 7 μ L、10 μ L的貯存液，用色 譜甲醇定容至IOOmL,配置成0. 9,0. 63,0. 27,0. 15,0. 06與0. 009mg. Γ1的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品 溶液，取對(duì)照品溶液在220-450nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，確定白藜蘆醇的檢測(cè)波長(zhǎng)，色 譜分離條件為色譜柱為5 μ m 4. 6X 250mm的Agilent ZORBAX SB-C18，流動(dòng)相A為0. 5% 甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相洗脫程序?yàn)?-8min，10% -18% B,8-10min, 18% B， 10-15min, 18 % -25 % B ； 15_18min，25 % -35 % B ； 18_25min，35 % B, 25_30min，35 % -70 %B，流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)306nm，柱溫30°C，進(jìn)樣量為20 μ L，含量計(jì)算方法采用外標(biāo)法 進(jìn)行計(jì)算。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列的應(yīng)用，在人工接種葡萄白粉菌后，應(yīng)用半定量RT-PCR法分析中國葡萄屬野生種華東葡萄株系白河-35-1芪合成酶基因表達(dá)模式，克隆芪合成酶基因的cDNA序列與gDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)一步分離獲得了芪合成酶基因病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列1772bp，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化分析確定該啟動(dòng)子具有病原菌誘導(dǎo)表達(dá)特性，該啟動(dòng)子與所克隆的芪合成酶基因cDNA與gDNA序列融合，在轉(zhuǎn)化植物中受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控，增強(qiáng)了目標(biāo)植物對(duì)病原菌的抗性，從中國葡萄屬野生種這一特異資源中分離克隆芪合成酶基因啟動(dòng)子，對(duì)于填補(bǔ)國內(nèi)空白及進(jìn)一步應(yīng)用于植物抗病改良，具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102121007SQ20101058259
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者丁家華, 余義和, 周起, 徐偉榮, 王躍進(jìn) 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)