專利名稱：一種3-表酯蟾毒配基的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體的說是涉及一種3-表酯蟾毒配基的制備方法。
背景技術(shù)：
蟾酥為傳統(tǒng)中藥材，是由蟾蜍科兩棲爬行動(dòng)物的耳后腺及皮膚腺分泌物加工而成。蟾酥味甘、辛，性溫，有毒，含留體物、生物堿等生物活性物質(zhì)，具有解毒、鎮(zhèn)痛、開竅、抗腫瘤等多種功能。蟾酥為我國的傳統(tǒng)藥材，藥源比較豐富。酯蟾毒配基(resibufogenin)是中藥蟾酥中主要的活性成分，是在C-17位連有一個(gè)α -吡喃酮環(huán)的留體化合物，其分子式為 C24H3204，分子量為384. 51，結(jié)構(gòu)式如下式所示
O
°5
CH _
ο酯蟾毒配基具有強(qiáng)心、升壓及興奮呼吸中樞等作用，藥理實(shí)驗(yàn)表明，酯蟾毒配基對(duì)手術(shù)期間的低血壓、出血性休克和創(chuàng)傷性低血壓的升壓作用明顯，持續(xù)時(shí)間長，并無血壓過度升高的現(xiàn)象，升壓顯效率在40%左右，總有效率90%左右。酯蟾毒配基興奮呼吸作用顯著，對(duì)新生兒窒息、麻醉、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜藥物等引起的中樞性呼吸抑制有較好的治療效果，對(duì)肺心病、肺炎等引起的呼吸循環(huán)衰竭具有兼顧的治療效果，是一種較好的呼吸循環(huán)興奮劑。3-表酯蟾毒配基，英文名為3-印iresibufogenin，是酯蟾毒配基的C-3位羥基發(fā)
生差向異構(gòu)化作用后的產(chǎn)物，是酯蟾毒配基在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物之一，結(jié)構(gòu)式為
O
°5
chT
^pyy HO、、,k^k^
O
3
3-表酯蟾毒配基具有抗癌抗腫瘤活性，而且毒性較酯蟾毒配基小，在制藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。然而目前3-表酯蟾毒配基的制備通常使用化學(xué)方法(GE0RGER. PETTIT, Y. A. · J. Org. Chem 37 (25) =4040-4044.)，過程繁瑣，產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，并且制備過程大都使用苯等對(duì)人毒性較大的有機(jī)溶劑，限制了 3-表酯蟾毒配基的生產(chǎn)與應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有的3-表酯蟾毒配基制備方法副產(chǎn)物多的缺陷，提供一種副產(chǎn)物少的3-表酯蟾毒配基的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種3-表酯蟾毒配基的制備方法，包括
步驟1 將含大鼠腸道菌群的懸浮液在GAM培養(yǎng)液中37°C厭氧培養(yǎng)22 25h ；
步驟2 向步驟1所得培養(yǎng)液中加入酯蟾毒配基，37°C厭氧培養(yǎng)40 80h，所述酯蟾毒配基的加入量為每ImL培養(yǎng)液加入0. 1 0. 3mg酯蟾毒配基；
步驟3 取步驟2所得培養(yǎng)液以非極性溶劑萃取，收集萃取液，得3-表酯蟾毒配基。
正常大鼠腸道中主要為厭氧菌，其中大腸桿菌、擬桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌為正常大鼠腸道內(nèi)常見菌群。在正常大鼠腸道內(nèi)的5種細(xì)菌中，擬桿菌最多，腸桿菌最少，其余介于二者之間。本發(fā)明利用大鼠腸道菌群將酯蟾毒配基轉(zhuǎn)化為3-表酯蟾毒配基。
本發(fā)明所述制備方法步驟1將含大鼠腸道菌群的懸浮液在GAM培養(yǎng)液中厭氧培養(yǎng)，使大鼠腸道菌群厭氧菌增殖。其中，所述含大鼠腸道菌群的懸浮液可以為新鮮的大鼠糞便懸浮液。
本發(fā)明所述GAM培養(yǎng)液為用于厭氧菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于各類厭氧菌的增殖，具體配方為胰蛋白胨10g/L、朊胨10g/L、大豆胨3g/L、牛肉膏2. 2g/L、葡萄糖3g/L、磷酸二氫鉀2. 5g/L、氯化鈉5g/L、淀粉5g/L、L-半胱氨酸0. 5g/L、硫代乙醇酸鈉0. 3g/L、酵母浸膏5g/L、牛肝浸出粉1.2g/L。
本發(fā)明所述制備方法步驟2為向步驟1所得培養(yǎng)液中加入酯蟾毒配基，37°C厭氧培養(yǎng)40 80h，利用大鼠腸道菌群將酯蟾毒配基轉(zhuǎn)化為3-表酯蟾毒配基。其中，所述酯蟾毒配基的加入量為每ImL培養(yǎng)液中加入0. 1 0. 3mg酯蟾毒配基。
由于3-表酯蟾毒配基極性很小，因此本發(fā)明所述制備方法以非極性溶劑萃取步驟2所得培養(yǎng)液，以提取大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化的3-表酯蟾毒配基。所述非極性溶劑包括氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、苯、液狀石蠟、植物油和乙醚等。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述非極性溶劑為乙酸乙酯。
更優(yōu)選的是，所述步驟2所得培養(yǎng)液與乙酸乙酯的體積比為1 100。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明利用乙酸乙酯萃取步驟2所得培養(yǎng)液中的3-表酯蟾毒配基，然后以高效液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)萃取液組分，結(jié)果顯示，萃取液的組分主要為酯蟾毒配基和3-表酯蟾毒配基，其他副產(chǎn)物含量極低，表明本發(fā)明所述利用大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化酯蟾毒配基制備3-表酯蟾毒配基的方法副產(chǎn)物少。
本發(fā)明所述制備方法在萃取制備3-表酯蟾毒配基后還包括對(duì)萃取液進(jìn)行純化步驟
優(yōu)選的，所述純化為硅膠柱層析純化或制備型高效液相色譜純化。
硅膠柱層析法是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過程即是吸附、解吸、 再吸附、再解吸過程。本發(fā)明所述3-表酯蟾毒配基極性很小，容易被洗脫下來。
制備型高效液相色譜是一種基于組分在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)的微小差異，當(dāng)固定相和流動(dòng)相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，樣品中的各組分將形成不同的遷移速度的譜帶而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)。
更優(yōu)選的是，本發(fā)明所述硅膠柱層析純化以環(huán)己烷與丙酮體積比為5. 5 1的溶液為流動(dòng)相。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明以環(huán)己烷與丙酮體積比為5. 5 1的溶液為流動(dòng)相，采用硅膠柱層析純化制備純品。高效液相色譜檢測(cè)純化后制備的3-表酯蟾毒配基純品純度大于95%。
本發(fā)明還利用核磁共振譜技術(shù)對(duì)本發(fā)明所述制備方法制備的3-表酯蟾毒配基進(jìn)行了鑒定，核磁共振碳譜、氫譜和DEPT譜結(jié)果與3-表酯蟾毒配基對(duì)照品相符。其中，DEPT 為無崎變極化轉(zhuǎn)移±曾強(qiáng)技術(shù)(Distortionless Enhancement bypolarization Transfer), 可以克服其它種極化轉(zhuǎn)移技術(shù)由于參數(shù)設(shè)置不當(dāng)?shù)榷鴮?dǎo)致圖譜的強(qiáng)度及相位等畸變失真的缺點(diǎn)，而方便地得到CH，CH2, CH3彼此分離的偶合譜，使CHn的各種類型的子譜更加一目了然，解析起來也就更加方便，是目前最理想的鑒別碳上連氫數(shù)目的常規(guī)技術(shù)。
本發(fā)明所述制備方法利用大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化酯蟾毒配基制備3-表酯蟾毒配基， 制備方法簡單，制備過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物少，酯蟾毒配基轉(zhuǎn)化率高，制備的3-表酯蟾毒配基純度高，可用于3-表酯蟾毒配基的大量制備。


圖1示實(shí)施例1乙酸乙酯萃取液及酯蟾毒配基和3-表酯蟾毒配基標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，其中，(a)乙酸乙酯萃取液高效液相色譜圖；(b)酯蟾毒配基純品高效液相色譜圖；(c) 3-表酯蟾毒配基純品高效液相色譜圖；(d)新鮮的大鼠糞便在GAM培養(yǎng)液中，厭氧培養(yǎng)后所得溶液的高效液相色譜圖2示實(shí)施例1乙酸乙酯萃取液高效液相色譜圖中峰1的質(zhì)譜圖3示實(shí)施例1乙酸乙酯萃取液高效液相色譜圖中峰2的質(zhì)譜圖4示實(shí)施例1制備的3-表酯蟾毒配基純品的600兆核磁共振碳譜圖5示實(shí)施例1制備的3-表酯蟾毒配基純品的600兆核磁共振氫譜圖6示實(shí)施例1制備的3-表酯蟾毒配基純品的600兆DEPT譜圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例公開了一種3-表酯蟾毒配基的制備方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。5
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例1 :GAM培養(yǎng)液配制
胰蛋白胨10g、朊胨10g、大豆胨3g、牛肉膏2. 2gL、葡萄糖3g、磷酸二氫鉀2. 5g、氯化鈉5g、淀粉5g、L-半胱氨酸0. 5g、硫代乙醇酸鈉0. 3g、酵母浸膏5g、牛肝浸出粉1. 2g，溶于800mL蒸餾水中，調(diào)pH值至7. 1-7. 2，定容至1L，120°C高溫滅菌20min。
實(shí)施例2:正常大鼠喂養(yǎng)
選取10只體重為220 250g的Wistar大鼠，雌雄各半，在溫度為18 ^°C、濕度為40 70%、光照為12 14h/天的條件下，以粒狀或或丸狀商品化嚙齒類飼料和自來水喂食。
實(shí)施例3 3-表酯蟾毒配基的制備與純化
取0. 2克新鮮的大鼠糞便加入到IOmLGAM培養(yǎng)液中，37°C厭氧培養(yǎng)Mh。然后加入 1.6mg酯蟾毒配基，37°C厭氧培養(yǎng)43h，得到培養(yǎng)液。培養(yǎng)液以100倍體積的乙酸乙酯萃取， 微孔濾膜過濾萃取液，以3-表酯蟾毒配基標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析。
高效液相色譜檢測(cè)條件為Waters沈95色譜儀；Zortax Eclipse )(DB-C18色譜柱 (4. 6mmX 150mm, Agilent)；流動(dòng)相A為乙腈，B為含0. 3%醋酸的水溶液；流速0. 3mL/min ； 柱溫;35°C ；梯度0 25min A為20% 80%，25 35min A保持80%不變。結(jié)果如圖1 所示。
質(zhì)譜檢測(cè)條件為Finnigan LCQ TM 離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan, USA) ；APCI 離子源，正離子模式；蒸發(fā)管溫度，450°C;殼氣(N2), 15. 5L/min;輔助氣(N2)，1. 65L/min ；去聚集電流，5 μ A ；金屬毛細(xì)管溫度，IOOmin ；毛細(xì)管電壓，17V ；管透鏡電壓，5V。結(jié)果如圖2和圖3所示。
由圖1可見，萃取液的主要組分為峰1和峰2，與酯蟾毒配基和3-表酯蟾毒配基的標(biāo)準(zhǔn)品比較發(fā)現(xiàn)，峰1與酯蟾毒配基的色譜峰相似，峰2與3-表酯蟾毒配基的色譜峰相似， 表明本發(fā)明所述萃取液組分主要為酯蟾毒配基和3-表酯蟾毒配基，其他副產(chǎn)物含量極低。 經(jīng)計(jì)算，3-表酯蟾毒配基的轉(zhuǎn)化率為37. 9%。
將得到的乙酸乙酯萃取液上硅膠柱，以環(huán)己烷丙酮體積比為5. 5 1的溶液為流動(dòng)相洗脫，收集洗脫液得到3-表酯蟾毒配基純品。高效液相色譜檢測(cè)3-表酯蟾毒配基純品純度為96%。核磁共振譜技術(shù)鑒定制備的3-表酯蟾毒配基純品，與3-表酯蟾毒配基對(duì)照品相符。核磁共振譜如圖4 6所示。
實(shí)施例4 3-表酯蟾毒配基的制備與純化
取0. 3克新鮮的大鼠糞便加入到IOmLGAM培養(yǎng)液中，37°C厭氧培養(yǎng)22h。然后加入 1. Omg酯蟾毒配基，37°C厭氧培養(yǎng)67h，得到培養(yǎng)液。培養(yǎng)液以氯仿萃取，微孔濾膜過濾萃取液，以3-表酯蟾毒配基標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析，檢測(cè)圖同實(shí)施例3， 萃取液組分主要為酯蟾毒配基和3-表酯蟾毒配基，其他副產(chǎn)物含量極低。經(jīng)計(jì)算，3-表酯蟾毒配基的轉(zhuǎn)化率為55.2%。
將得到的萃取液上硅膠柱，以環(huán)己烷丙酮體積比為5. 5 1的溶液為流動(dòng)相洗脫，收集洗脫液得到3-表酯蟾毒配基純品。高效液相色譜檢測(cè)3-表酯蟾毒配基純品純度為95. 7%。核磁共振譜技術(shù)鑒定制備的3-表酯蟾毒配基純品，與3-表酯蟾毒配基對(duì)照品相符。6
實(shí)施例5 3-表酯蟾毒配基的制備與純化
取0. 1克新鮮的大鼠糞便加入到IOmLGAM培養(yǎng)液中，37°C厭氧培養(yǎng)25h。然后加入3. Omg酯蟾毒配基，37°C厭氧培養(yǎng)71h，得到培養(yǎng)液。培養(yǎng)液以二氯甲烷萃取，微孔濾膜過濾萃取液，以3-表酯蟾毒配基標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析，檢測(cè)圖同實(shí)施例3，萃取液組分主要為酯蟾毒配基和3-表酯蟾毒配基，其他副產(chǎn)物含量極低。經(jīng)計(jì)算， 3-表酯蟾毒配基的轉(zhuǎn)化率為38. 6%。
將得到的萃取液以制備型高效液相色譜純化收集3-表酯蟾毒配基峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，得到3-表酯蟾毒配基純品。高效液相色譜檢測(cè)3-表酯蟾毒配基純品純度為95. 7%0 核磁共振譜技術(shù)鑒定制備的3-表酯蟾毒配基純品，與3-表酯蟾毒配基對(duì)照品相符。
以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種3-表酯蟾毒配基的制備方法，包括步驟1 將含大鼠腸道菌群的懸浮液在GAM培養(yǎng)液中37°C厭氧培養(yǎng)22 25h ； 步驟2 向步驟1所得培養(yǎng)液中加入酯蟾毒配基，37°C厭氧培養(yǎng)40 80h，所述酯蟾毒配基的加入量為每ImL培養(yǎng)液加入0. 1 0. 3mg酯蟾毒配基；步驟3 取步驟2所得培養(yǎng)液以非極性溶劑萃取，收集萃取液，得3-表酯蟾毒配基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟3所述非極性溶劑為乙酸乙酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，步驟2所得培養(yǎng)液與乙酸乙酯的體積比為 1 100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，還包括對(duì)萃取液進(jìn)行純化步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，所述純化為硅膠柱層析純化或制備型高效液相色譜純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述硅膠柱層析純化以環(huán)己烷與丙酮體積比為5. 5 1的溶液為流動(dòng)相。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，公開了一種3-表酯蟾毒配基的制備方法，包括將含大鼠腸道菌群的懸浮液在GAM培養(yǎng)液中37℃厭氧培養(yǎng)22～25h，向所得培養(yǎng)液中加入酯蟾毒配基，37℃厭氧培養(yǎng)40～80h，酯蟾毒配基的加入量為每1mL培養(yǎng)液加入0.1～0.3mg酯蟾毒配基，取培養(yǎng)液以非極性溶劑萃取，收集萃取液，得3-表酯蟾毒配基。本發(fā)明利用大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化酯蟾毒配基制備3-表酯蟾毒配基，方法簡單，制備過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物少，酯蟾毒配基轉(zhuǎn)化率高，制備的3-表酯蟾毒配基純度高，可用于3-表酯蟾毒配基的大量制備。
文檔編號(hào)C12P17/16GK102533895SQ20101058407
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 劉淑瑩, 宋鳳瑞, 邢俊鵬, 鄭重, 韓天嬌 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所