專利名稱：一種測定引起類過敏反應的物質的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測技術領域，特別涉及一種測定引起類過敏反應的物質的方法。
背景技術：
過敏反應為常見的不良反應之一。過敏反應即變態(tài)反應，是外源性抗原物質與體內抗體間所發(fā)生的一種非正常的免疫反應?？梢哉T發(fā)過敏反應的物質很多，如蛋白質、多肽、多糖等大分子物質具有完全的抗原性；另一些分子較小的化合物可作為半抗原與體內蛋白質結合成全抗原，從而引起過敏反應。目前涉及到過敏反應的過敏物質很多，發(fā)生頻率較高的有藥品(中藥及西藥)、食品、花粉、螨蟲等。急性過敏反應包括I型超敏反應和類過敏反應，最新調查研究表明，77%的急性過敏反應為類過敏反應，類過敏反應發(fā)生率遠高于I型超敏反應。類過敏反應無需IgE介導，首次接觸藥物即可出現(xiàn)過敏癥狀，給人類的生活帶來及大的危害。鑒于類過敏反應的危害性，尤其在醫(yī)藥領域中的頻繁發(fā)生(如青霉素及中藥制劑的過敏反應)，使人們越來越意識到早期預防的重要性，其中，致敏原物質的早期快速檢測是降低類過敏反應的重要手段。肥大細胞是誘發(fā)類過敏反應的中心樞紐，它在受抗原刺激后脫顆粒直接導致一系列過敏癥狀的產生。在脫顆粒的過程中，鈣離子的升高是活性介質釋放的必要條件，這種現(xiàn)象在1973年就被發(fā)現(xiàn)，但真正將鈣離子的活體動態(tài)監(jiān)測作為評價指標，應用于類過敏原的早期快速評估尚沒有人嘗試。常用的體外檢測肥大細胞脫顆粒的方法主要有己糖苷酶法、類胰蛋白酶法、 組胺法、掃描及透射電鏡等。這些方法經(jīng)典穩(wěn)定，但都有各自的局限性。為了檢測相應指標，肥大細胞經(jīng)過各種化學固定及顯色處理，失去了活體狀態(tài)下脫顆粒的一系列生物信息， 由此也引起很多檢測誤差，也無法進行精確定量及動態(tài)觀察。在本發(fā)明中，我們應用光學成像技術觀察RBL-2H3細胞，在活體狀態(tài)下動態(tài)監(jiān)測在致敏原物質刺激下細胞內鈣離子的變化過程，以鈣震蕩幅度做為類過敏反應判定的標準。該方法在活細胞狀態(tài)下，靈敏、快速對致敏原進行篩選，克服了原有方法的不足，在類過敏反應發(fā)生的早期即可發(fā)現(xiàn)潛在威脅，將為過敏原過敏性篩查、過敏原檢測、環(huán)境安全性監(jiān)測等領域提供新的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種測定引起類過敏反應的物質的方法，該方法包括以下步驟步驟1，細胞和過敏物質放到一起培養(yǎng)，步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。
優(yōu)選的方法包括以下步驟步驟1，將RBL-2H3細胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，同時加入熒光染料，孵育；步驟3，孵育后用顯微鏡掃描采集圖像，過敏物質在第二張圖像采集完畢后加入；步驟4，根據(jù)圖像中RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。更優(yōu)選的方法包括以下步驟步驟1，將RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，同時加入終濃度為1 μ g/ml的Fluo4熒光染料，37°C 孵育30min步驟3，后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每隔IOs采集一張圖像，共采集30min，過敏物質在第二張圖像采集完畢后加入；步驟4，根據(jù)圖像中RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。本發(fā)明所述的過敏物質包括但不限于以下物質藥物，花粉，食物，螨蟲，細菌，微生物，植物等。本發(fā)明針對藥物中的過敏物質具有特別優(yōu)越的價值，如藥物的注射劑，特別是針對中藥的注射劑如雙黃連粉針、清開靈注射液、穿琥寧注射液、參麥注射液、魚腥草注射液寸。本發(fā)明的方法經(jīng)過以下實驗證明本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術優(yōu)越1 材料試劑MEM培養(yǎng)基(GIBC0，美國)；Fluo4_AM熒光染料(Sigma，美國)；β -己糖苷(Sigma，美國)；COmpOimd48/80(Sigma，美國)；清開靈注射液(市場購買，批號 08092211)；新清開靈注射液(市場購買)；大鼠嗜堿性細胞細胞株RBL-2H3細胞購自協(xié)和細胞庫，使用MEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)。儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo 371，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化，中國)；激光掃描共焦顯微鏡(Olympus FV1000，日本)；掃描電子顯微鏡(HITACHI SMOON，日本)；酶標儀(BIOTEK SYNERGY2，美國)。細胞RBL-2H3購自協(xié)和細胞庫，用MEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)。實驗動物=Beagle犬，體重14士0. ^g，雄雌兼用，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。許可證號SCXK (軍)2007-0004。實驗環(huán)境室溫度20 ，相對濕度為48 58 %。2 方法RBL-2H3細胞是離體實驗中常用的大鼠肥大細胞株，具有與在體肥大細胞相似的反應特性，因此，常被作為過敏反應的離體研究對象。Compound 48/80 (化合物48/80)是 N-甲基-對甲氧基苯乙胺和甲醛縮合產生的聚合物，具有促進肥大細胞脫顆粒的作用，所以在離體實驗中常將它作為測定抗過敏活性實驗的誘導劑。由于類過敏反應是一種個體性很強的免疫反應，不同的人對同一抗原的反應不同，但只要發(fā)生類過敏反應即會發(fā)生肥大細胞的脫顆粒現(xiàn)象，因此，在離體檢測中，能夠促進肥大細胞脫顆粒的物質即是可以引起機體過敏反應的抗原。2. 1肥大細胞脫顆粒的經(jīng)典檢測方法β-己糖苷酶檢測將RBL-2H3細胞以1\105/孔接種至96孔板中培養(yǎng)2處后，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min后，加入陽性藥物、陰性對照或待測藥刺激，繼續(xù)37°C 孵育。待刺激不同時間點后冰浴終止反應。離心取50ul上清液與底物β-己糖苷37°C行水解反應lh，之后加入檸檬酸鈉緩沖液終止反應。離心收集反應上清液，酶標儀405nm下檢測OD值。掃描電鏡檢測將RBL-2H3細胞接種至蓋玻片上培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min后，加入藥物刺激，繼續(xù)37°C孵育。待刺激不同時間點后冰浴終止反應。 去掉上清液后加入4%戊二醛預固定。之后經(jīng)鋨酸固定、脫水、真空噴鍍等步驟后于掃描電子顯微鏡下觀察。2. 2本發(fā)明的肥大細胞脫顆粒的活體檢測方法細胞內鈣離子成像方法將RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液，同時加入終濃度為ι μ g/ml的Fluo4熒光染料，37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每隔IOs采集一張圖像，共采集30min。COmpOimd48/80及陰性對照藥(細胞培養(yǎng)液)、測試藥分別均在第二張圖像采集完畢后加入。2. 3本發(fā)明的肥大細胞脫顆粒的活體檢測方法與傳統(tǒng)檢測方法靈敏度比較利用β -己糖苷酶、掃描電鏡及細胞內鈣離子三種方法分別對倍比稀釋后不同濃度的陽性藥物cOmpOund48/80 (10到3. 9x10^ μ g/ml)對肥大細胞的脫顆粒作用進行靈敏度的比較性研究。具體檢測方法同前。2. 4應用實例一中藥注射劑過敏性檢測用臨床上引起過敏反應的清開靈注射液及改進后的清開靈注射液為例，觀察該方法的實用效果。2.4. 1離體實驗用傳統(tǒng)方法(β-己糖苷酶、掃描電鏡)及本發(fā)明方法同時對兩種中藥注射劑進行過敏性檢測。2. 4. 2整體實驗將12只犬按體重隨機分為4組，磷酸組胺組、清開靈組、新清開靈組和生理鹽水對照組，每組3條犬。各組Beagle犬前肢靜脈以5ml ^irT1恒速注射相應藥液，給藥體積均為6. 67ml · kg-1 (相當于臨床成人用藥的等效劑量的10倍)。連續(xù)觀察給藥前、后各組犬的行為學變化，并根據(jù)癥狀的輕重按表1評分，根據(jù)異常行為評分判定結果。判斷標準見表1.表1犬類過敏反應癥候判斷標準典型癥候備注“一” 類過敏反應陰性正常。1.首次給藥即出現(xiàn)嚴“+” 類過敏反應陽性，具體表現(xiàn)為重不良反應1.體表血管擴張等類過敏反應，如口、耳、鼻尖皮膚潮紅等；2.癥狀典型，多發(fā)，持2.狂躁不安，頭部撞墻，不能站穩(wěn)，多次跌倒，大量流涎，多次嘔久(3min以上)，并逐吐，大小便失禁；漸加重，其至死亡。3.血壓下降及休克樣癥狀，如呼吸、心率加快，皮膚紫暗或蒼白，肢冷，脈弱；4.癥狀持續(xù)，逐漸加重，甚至出現(xiàn)昏迷，抽動，呼吸衰弱，死亡。3數(shù)據(jù)處理結果用表示，組間顯著性差異用t檢驗方法進行比較。4 結果4. 1肥大細胞脫顆粒的活體檢測方法與傳統(tǒng)檢測方法靈敏度比較用能引起肥大細胞脫顆粒的陽性藥物COmpOimd48/80做為刺激物，觀察在不同濃度刺激下，傳統(tǒng)方法(β_己糖苷酶和掃描電鏡)與本活體檢測方法的檢測限上的差別。結果如

圖1-3所示。圖1不同濃度Compound 48/80刺激RBL-2H3細胞釋放β -己糖苷酶結果，注與對照組相比"P <0.01由圖1可看出，在不同濃度Compound 48/80刺激下，與對照組相比，3. 9X10—2至Ij 2. 5 μ g/ml劑量組均未檢測到β -己糖苷酶的升高；5 μ g/ml及10 μ g/ml劑量組β -己糖苷酶的釋放有顯著性差異(P < 0. 01)，。圖2用掃描電鏡觀察不同濃度Compound 48/80刺激下RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化掃描電鏡的結果可以看出，compound48/80的7. 8χ10_2μ g/ml劑量組即可顯現(xiàn)與對照組不同的形態(tài)特征，并隨濃度的增高而越來越明顯(圖2)。圖3不同濃度COmpOund48/80刺激后細胞內鈣離子變化，注黃線處為給藥時間點由圖3可以看出，在不同濃度COmpOund48/80作用下，大多數(shù)劑量組均顯示出明顯的鈣離子升高現(xiàn)象，且隨著刺激物濃度的升高鈣波增強。當濃度降至1. BxlO-1U g/ml時仍可檢測出細胞內鈣離子濃度的變化(中間劑量結果略)。7.8x10_2yg/ml&3.^cl0_2yg/ ml不能引起細胞內鈣離子的變化。4. 2應用實例一中藥注射劑過敏性檢測4. 2. 1離體實驗由圖4可看出，利用β-己糖苷酶檢測法，給予陽性藥物刺激后，可檢測出細胞分泌己糖苷酶明顯增多，但使用清開靈注射液及新清開靈對肥大細胞作用后，均未檢測出明顯變化。圖4β -己糖苷酶檢測結果，注與對照組相比< 0. 001由圖5可看出，清開靈注射液作用肥大細胞后可引起其發(fā)生脫顆粒形態(tài)學改變反
權利要求
1.一種測定引起類過敏反應的物質的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，細胞和過敏物質放到一起培養(yǎng)，步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，將RBL-2H3細胞放到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，同時加入熒光染料，孵育； 步驟3，孵育后用顯微鏡掃描采集圖像，過敏物質在第二張圖像采集完畢后加入； 步驟4，根據(jù)圖像中RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，將RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，同時加入終濃度為1 μ g/ml的Fluo4熒光染料，37°C孵育 30min步驟3，后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每隔IOs采集一張圖像，共采集30min，過敏物質在第二張圖像采集完畢后加入；步驟4，根據(jù)圖像中RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質包括但不限于以下物質藥物，花粉，食物，螨蟲，細菌，微生物，植物。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質為藥物。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質為藥物注射劑。
7.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質為中藥注射劑。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質為雙黃連注射劑、清開靈注射劑、穿琥寧注射劑、參麥注射劑、魚腥草注射劑。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，步驟如下步驟1，將RBL-2H3用完全 RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，同時加入終濃度為1 μ g/ml的Fluo4熒光染料，37°C孵育 30min ；步驟3，移至激光掃描共聚焦顯微鏡在488nm的激發(fā)光，100X油鏡下觀察，選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每隔IOs采集一張圖像，共采集30min測試藥在第二張圖像采集完畢后按一定濃度加入待測物質，這些物質可以是血清、待測抗原等，本實例中應用的是化合物48/80，濃度為30yg/ml，步驟4，根據(jù)圖像中RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。
10.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，步驟如下步驟1，將RBL-2H3用完全 RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，同時加入終濃度為1 μ g/ml的Fluo4熒光染料，37°C孵育 30min ；步驟3，移至激光掃描共聚焦顯微鏡在488nm的激發(fā)光，100X油鏡下觀察，選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每隔IOs采集一張圖像，共采集30min測試藥在第二張圖像采集完畢后按照中藥注射劑離體的安全劑量，參照臨床用藥劑量，加入至細胞培養(yǎng)皿中；步驟4，根據(jù)圖像中RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物檢測領域，涉及一種測定引起類過敏反應的物質的方法，本發(fā)明的方法，包括以下步驟步驟1，細胞和藥物放到一起培養(yǎng)；步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像；步驟3，根據(jù)圖像中細胞的形態(tài)學變化，和細胞內鈣離子的變化確定過敏物質的存在。
文檔編號C12Q1/02GK102154434SQ201010585030
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權日2010年12月13日
發(fā)明者于友華, 侯燕鳴, 張倩, 李連達, 王丹巧, 王毅, 胡劍江, 雷洪濤 申請人:中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心