專利名稱：一種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法。
背景技術(shù)：
Bt基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌(feciBM thuringHansis).它 在芽孢形成過程中產(chǎn)生S-內(nèi)毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。 其作用原理為這種抗蟲蛋白能被堿性腸液溶解，水解為更小的活性毒素片段一核心片段 (Hofte和Whiteley，1989)。該活性片段能抗蛋白酶的進(jìn)一步水解，被激活的蛋白質(zhì)結(jié)合在 昆蟲腸道上的刷狀小泡上，引起穿孔從而影響滲透平衡，細(xì)胞膨脹并溶解，靶標(biāo)生物停止取 食并最后死亡。研究表明許多靶標(biāo)害蟲的腸道上皮細(xì)胞都具有Bt蛋白高親和性的結(jié)合位 點(diǎn)(Hofte和Whiteley，1989)。蘇云金芽孢桿菌因其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而成為 應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物。隨著植物細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技 術(shù)將外源抗蟲基因Bt導(dǎo)入玉米，使玉米自身產(chǎn)生抗蟲蛋白而達(dá)到抗蟲的目的。利用基因工程技術(shù)將外源抗蟲基因Bt導(dǎo)入玉米，得到的轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行抗蟲性鑒 定是最直接的抗蟲鑒定方法。但是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因整個(gè)周期比較長(zhǎng)，如果克隆、或改造的Bt基 因抗蟲性較差，不但浪費(fèi)人力、物力，更是影響了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。因此如何快速有效地檢測(cè)Bt基 因的抗蟲性鑒定，對(duì)于Bt蛋白的應(yīng)用具有重要的實(shí)用價(jià)值。Bt蛋白的體外抗蟲鑒定技術(shù)成 為首要解決的問題。Bt蛋白的體外抗蟲鑒定的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù) 依據(jù)蘇云金桿菌的殺蟲活性主要是由殺蟲蛋白基因型和產(chǎn)生的伴孢晶體的量所決定的，利 用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)出Bt蛋白的含量，測(cè)定Bt蛋白的含量，也能指示該蛋白相應(yīng)的 毒力活性。但是該方法只是能檢測(cè)出Bt蛋白含量，Bt蛋白實(shí)際效果最終還是要進(jìn)行生物 測(cè)定，才能準(zhǔn)確鑒定出Bt蛋白的抗蟲性。另外，如何獲得大量的實(shí)驗(yàn)蟲源是進(jìn)行Bt蛋白體外鑒定的基礎(chǔ)，1980年周大榮等 研發(fā)了亞洲玉米螟半人工飼料-新7號(hào)飼料，其后宋彥英等用代號(hào)為JSMD的物質(zhì)取代新7 號(hào)飼料中的瓊脂取得成功，同時(shí)研究亞洲玉米螟的一些學(xué)者，在飼養(yǎng)亞洲玉米螟時(shí)也對(duì)飼 料配方進(jìn)行了一些改進(jìn)。然而現(xiàn)有這些玉米螟人工飼料仍有改進(jìn)的必要，以獲得一致性較 好的標(biāo)準(zhǔn)試蟲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，該方法操作 簡(jiǎn)單，快速，不受時(shí)間和季節(jié)限制、經(jīng)濟(jì)成本低。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
將Bt基因連接到原核表達(dá)載體PET-28B上，將含有Bt基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸 桿菌BL21中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)Bt蛋白，提取誘導(dǎo)表達(dá)出的Bt蛋白，將此Bt蛋白拌入玉米螟 幼蟲人工飼料中喂養(yǎng)玉米螟幼蟲，數(shù)天后統(tǒng)計(jì)玉米螟幼蟲的死亡率和生長(zhǎng)狀況。該方法操作簡(jiǎn)單，快速，不受時(shí)間和季節(jié)限制、經(jīng)濟(jì)成本低，能快速地進(jìn)行Bt蛋白抗蟲鑒定。一種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，包括以下步驟
(1)將待鑒定的Bt基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體PET48B中；
(2)將含有Bt基因的原核表達(dá)載體PET-28B轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中；
(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)含Bt基因的大腸桿菌BL21產(chǎn)生Bt蛋白；
(4)收集分離上步所得菌體，加溶菌酶后破碎菌體，分離提取BT蛋白；
(5)以玉米螟為受試?yán)ハx，將上步提取的Bt蛋白摻入玉米螟飼料中，飼喂試驗(yàn)組玉米 螟，同時(shí)分別以蒸餾水、含空原核表達(dá)載體的大腸桿菌BL21菌液摻入玉米螟飼料中飼喂對(duì) 照組玉米螟，同樣的條件下飼養(yǎng)8 10天后統(tǒng)計(jì)死亡率和蟲體重量，進(jìn)而確定Bt蛋白的殺 蟲效果。在所述步驟(3)中，誘導(dǎo)產(chǎn)生Bt蛋白的具體方法如下
(1)在無(wú)菌環(huán)境下，用接種環(huán)沾取少量含有Bt基因原核表達(dá)載體的大腸桿菌BL21菌液 在含有卡那霉素的LB平板上劃線分離單菌落；劃線后將LB平板放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒
置培養(yǎng)；
(2)無(wú)菌環(huán)境下，挑取上步所得大腸桿菌BL21單菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過夜；
(3)將菌液以1:100接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)至 OD600=O. 5 ；
(4)在OD6tltl已經(jīng)達(dá)到0.5時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5mM繼續(xù)搖動(dòng)誘導(dǎo)4小時(shí)；
(5)收集誘導(dǎo)后的菌液，4000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體。在所述步驟(3)中，按如下方法提取Bt蛋白；
(1)收集上步誘導(dǎo)后的菌液，4000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體；
(2)在收集的菌體中加入裂解緩沖液重新懸浮，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置 30分；
(3)超聲波破碎菌體，4000rpm離心10分，收集上清。在所述步驟(5)中，按如下方法喂養(yǎng)玉米螟
(1)在沈 ^°C，相對(duì)濕度70%的環(huán)境條件下孵化玉米螟蟲卵；
(2)孵化的玉米螟幼蟲在沈 ^°C、相對(duì)濕度70%條件下進(jìn)行人工飼養(yǎng)，飼喂人工飼料。本發(fā)明還對(duì)玉米螟人工飼料進(jìn)行了改進(jìn)，使整個(gè)人工飼料營(yíng)養(yǎng)成分，飼料的軟硬 程度，剛好適合玉米螟的生長(zhǎng)。因?yàn)橛衩酌蔡穑谂浞街刑砑由倭刻鸲雀哂谄咸烟堑恼?糖，增加了飼料的甜度，更適合玉米螟的生長(zhǎng)。以重量份計(jì)，所述人工飼料可由下述A、B、C、 D四組原料制成
A 大豆面12份，玉米面12份，酵母粉7. 2份；
B:葡萄糖6份，蔗糖1份，Vc 0.4份，水36份或含待鑒定Bt蛋白的上清液36份； C:玉米粉3. 2份，水8份； D 瓊脂1. 2份，山梨酸0. 4份，水48份；
先將A組中的三種原料混勻混合；將B組中的葡萄糖、蔗糖、Vc混合后加入36份水中； 取另一容器將C組原料混合均勻；再將D組中的瓊脂1放入48份水中，加熱至沸騰后加入將混勻的C組原料，隨后加入山梨酸，再等其降溫至50°C時(shí)加入混合后的A、B組混合物，攪 拌均勻，待凝固后切成長(zhǎng)條使用。本發(fā)明具有積極有益的效果
1.本發(fā)明方法中使用PET-28B表達(dá)載體，該載體屬于Novagen的pET系列；該系統(tǒng)成 功的一個(gè)主要原因是目標(biāo)基因被克隆到不為大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別的T7啟動(dòng)子之下， 因此在加入T7 RNA聚合酶之前幾乎沒有表達(dá)發(fā)生；克隆到pET載體的基因?qū)嶋H上是被 關(guān)閉的，不會(huì)由于產(chǎn)生的蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性而引起質(zhì)粒不穩(wěn)定；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到染色體上 含有一拷貝由lacUV5控制的T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)宿主中，并通過加入IPTG (異丙 基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)；Τ7 RNA聚合酶的選擇性和活性使得幾乎所有細(xì)胞 資源都用于為目標(biāo)基因表達(dá)，誘導(dǎo)后幾小時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物就可超過細(xì)胞總蛋白的50%。2.本發(fā)明中方法中采用BL21 (DE3)表達(dá)菌株，該菌株是蛋白原核表達(dá)的常用菌 株，優(yōu)點(diǎn)在于缺失Ion和蛋白酶；Τ7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū) 整合于BL21的染色體上，可以高效表達(dá)外源基因，在適當(dāng)誘導(dǎo)條件和可大量表達(dá)可溶行蛋 白，并可保持外源基因產(chǎn)物完整性和生物活性。3.本發(fā)明還進(jìn)一步改進(jìn)了供試?yán)ハx的人工飼料，不受季節(jié)性和不必更換飼料的 限制和不易發(fā)霉、變質(zhì)、變干，及在飼養(yǎng)過程中可以少換或不換飼料等特點(diǎn)，管理十分方 便，使大規(guī)模工廠化生產(chǎn)成為可能；而且在配方中出去甲醛后，沒有特殊的氣味，幼蟲可 以正常取食，對(duì)人身體沒有任何危害，整個(gè)配方中所加水分量適中，使整個(gè)人工飼料軟硬程 度，剛好適合玉米螟的生長(zhǎng)。玉米螟喜甜，在配方中添加少量甜度高于葡萄糖的蔗糖，增加 了飼料的甜度，更適合玉米螟的生長(zhǎng)。


圖1為改造合成的Bt基因，大小為1848bp ；Marker為SM331 (購(gòu)自上海生物工程 有限公司)；
圖2為原核載體pET28b-i i酶切鑒定圖譜；表明Bt基因已經(jīng)構(gòu)建到原核表達(dá)載體上； Marker為SM331 (購(gòu)自上海生物工程有限公司)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特別說 明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料及試劑，如無(wú)特別說明，均購(gòu)自常規(guī)生化 試齊Ll商店。實(shí)施例一 一種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，包括以下步驟
(1)將改造合成抗蟲基因Bt (圖1)克隆到原核表達(dá)載體PET48B中(購(gòu)自上海生物工 程有限公司)；具體方法如下
第一步用限制性內(nèi)切酶酶切pUtti，凝膠回收試劑盒回收純化Bt片段； 第二步用相同限制性內(nèi)切酶酶切pED8b，凝膠回收試劑盒回收純化酶切過的pET28b 片段；
第三步將兩個(gè)純化后的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建所得原核表達(dá)質(zhì)粒命名為 pED8b力 ，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，表明載體構(gòu)建正確(圖2)；(2 )將含有Bt基因的原核表達(dá)載體PET-28B轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中(購(gòu)買自上海生物工 程有限公司)；
(3)誘導(dǎo)產(chǎn)生Bt蛋白
①將大腸桿菌BL21(含有Bt基因原核表達(dá)載體)原液從-80°C環(huán)境中取出，放在冰上 凍融。待菌液融化后，在超凈臺(tái)里用接種環(huán)沾取少量菌液在含有卡那霉素的LB平板上劃線 分離單菌落(注意無(wú)菌操作)；劃線后將LB平板放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；
②在超凈臺(tái)內(nèi)，用IOyl白槍頭挑取大腸桿菌BL21單菌落于5mlLB (含卡那霉素)液 體培養(yǎng)基中，37°C搖動(dòng)培養(yǎng)過夜；
③將菌液以1:100接種到500ml LB (含卡那霉素)液體培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)至 OD600=O. 5 (搖動(dòng)培養(yǎng)需要一定空間，可把500ml LB分到兩個(gè)500ml錐形瓶中，每個(gè)500ml 錐形瓶分裝250ml LB)；
④在0D_已經(jīng)達(dá)到0.5時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5mM繼續(xù)搖動(dòng)誘導(dǎo)4小時(shí)。(4)提取含有Bt蛋白
①收集誘導(dǎo)后的菌液，4000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體；
②在收集的菌體中加入36ml裂解緩沖液(2mMTris-HCl、0. 2mM CaCl2 PH=8) 重新懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置30分；
③超聲波破碎菌體(破碎參數(shù)工作10S，間隔5S，次數(shù)40，注意破碎時(shí)冰浴，若不冰浴， 超聲波時(shí)使蛋白溶液溫度過高，破壞蛋白結(jié)構(gòu))，4000rpm離心10分，收集上清，此上清中含 有Bt基因表達(dá)出的蛋白。(5) Bt蛋白抗蟲鑒定
1)以玉米螟為供試蟲，以下述改進(jìn)的人工飼料飼喂玉米螟 包括4組原料成分
A 大豆面12g，玉米面12g，酵母粉7. 2g ； B 葡萄糖 6g，蔗糖 lg，VcO. 4g，水 36ml ； C 玉米粉3. 2g，水8ml ； D 瓊脂1. 2g，山梨酸0. 4g，水48ml ；
將A組中大豆面、玉米面、酵母粉三成分放一容器混勻；將B組中的葡萄糖、蔗糖、Vc混 合后加入36ml水中；取另一容器將C組各成分混勻；將D組中的瓊脂加入48ml水，微波爐 加熱至沸騰后，加入混勻C組原料，再加入山梨酸，等上述混合物料涼至50°C時(shí)加入A+B的 混合物，攪拌均勻后倒入飯盒蓋中，待凝固后切成長(zhǎng)條使用。上述改進(jìn)后的玉米螟人工飼料經(jīng)濟(jì)成本低，并且整營(yíng)養(yǎng)成分更為均衡，飼料的軟 硬程度更加適合玉米螟的生長(zhǎng)；因玉米螟喜甜，在配方中添加少量甜度高于葡萄糖的蔗糖， 增加了飼料的甜度，更有利于玉米螟的生長(zhǎng)。2)方法步驟
①分別依次以上步所得含Bt蛋白的上清、滅菌水、空白載體PET48B的大腸桿菌BL21 菌液替代玉米螟人工飼料中B組的水，配制出相應(yīng)的人工飼料；
②取30支試管，分成三組，每組10支(高溫高壓滅菌后使用)，其中一組放入含有Bt蛋 白的玉米螟人工飼料，另兩組分別放入上述含空原核表達(dá)載體PET48B的玉米螟人工飼料 和以滅菌水配制正常的玉米螟人工飼料。
③取剛孵化出的玉米螟幼蟲接入試管，每個(gè)試管隨機(jī)接種10頭，每個(gè)處理共100 頭(接蟲時(shí)，挑取那些離孵化地點(diǎn)遠(yuǎn)的幼蟲，這樣的幼蟲強(qiáng)壯、生活力旺盛)，然后將各試管 放入組培室中飼養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境條件如下
玉米螟蟲卵放在沈 ^°C，相對(duì)濕度70%左右的環(huán)境中就可以孵化，孵化大概需要3 天左右時(shí)間，如果見蟲卵中有黑點(diǎn)(此時(shí)蟲卵俗稱“黑頭卵”)冒出，要注意了，幼蟲馬上就會(huì) 鉆出卵殼。玉米螟幼蟲人工飼養(yǎng)需放在沈 ，相對(duì)濕度70%左右的環(huán)境中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn) 采用在試管中飼養(yǎng)，用棉塞堵口，棉塞可透氣又能防止幼蟲咬嗑而逃逸，影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。試 管放在觀。c組培室中培養(yǎng)，可在試管附近增設(shè)個(gè)加濕器以保證相對(duì)濕度。3)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析
通過統(tǒng)計(jì)用上述方法飼養(yǎng)8天后玉米螟死亡率和蟲體重量，通過生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析可以 判斷待鑒定Bt蛋白的抗蟲性；同時(shí)以清水和空載體pET28b大腸桿菌BL21菌液為對(duì)照，也 可以看上述人工飼料對(duì)玉米螟飼養(yǎng)的效果，見表1。結(jié)果分析表明Bt原核表達(dá)載體表達(dá)的蛋白具有很好好的殺蟲效果，玉米螟死亡 率達(dá)到90. 67%，而且對(duì)玉米螟的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，活蟲單只蟲重僅有0. 1610，說明 種這種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法確實(shí)能快速檢測(cè)Bt蛋白抗蟲性，而且方法操作簡(jiǎn)單，快 速，不受時(shí)間和季節(jié)限制、經(jīng)濟(jì)成本低，因此本發(fā)明方法可以快速有效地檢測(cè)Bt基因的抗 蟲性鑒定，對(duì)于Bt蛋白的研究應(yīng)用具有重要的實(shí)用價(jià)值。另外以本發(fā)明的人工飼料進(jìn)行玉米螟飼養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人工飼料適合玉 米螟的生長(zhǎng)。
表1 Bt蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物體外抗蟲鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，包括以下步驟(1)將待鑒定的Bt基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體PET48B中；(2)將含有Bt基因的原核表達(dá)載體PET-28B轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)含Bt基因的大腸桿菌BL21產(chǎn)生Bt蛋白；(4)收集分離上步所得菌體，加溶菌酶后破碎菌體，分離提取BT蛋白；(5)以玉米螟為受試?yán)ハx，將上步提取的Bt蛋白摻入玉米螟飼料中，飼喂試驗(yàn)組玉米 螟，同時(shí)分別以蒸餾水、含空原核表達(dá)載體的大腸桿菌BL21菌液摻入玉米螟飼料中飼喂對(duì) 照組玉米螟，同樣的條件下飼養(yǎng)8 10天后統(tǒng)計(jì)死亡率和蟲體重量，進(jìn)而確定Bt蛋白的殺 蟲效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，其特征在于，在所述步驟(3)中， 誘導(dǎo)產(chǎn)生Bt蛋白的具體方法如下(1)在無(wú)菌環(huán)境下，用接種環(huán)沾取少量含有Bt基因原核表達(dá)載體的大腸桿菌BL21菌液 在含有卡那霉素的LB平板上劃線分離單菌落；劃線后將LB平板放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；(2)無(wú)菌環(huán)境下，挑取上步所得大腸桿菌BL21單菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過夜；(3)將菌液以1:100接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)至 OD600=O. 5 ；(4)在OD6tltl已經(jīng)達(dá)到0.5時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5mM繼續(xù)搖動(dòng)誘導(dǎo)4小時(shí)；(5)收集誘導(dǎo)后的菌液，4000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，其特征在于，在所述步驟(3)中， 按如下方法提取Bt蛋白；(1)收集上步誘導(dǎo)后的菌液，4000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體；(2)在收集的菌體中加入裂解緩沖液重新懸浮，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置 30分；(3)超聲波破碎菌體，4000rpm離心10分，收集上清。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，其特征在于，在所述步驟(5)中， 按如下方法喂養(yǎng)玉米螟(1)在沈 ^°C，相對(duì)濕度70%的環(huán)境條件下孵化玉米螟蟲卵；(2)孵化的玉米螟幼蟲在沈 ^°C、相對(duì)濕度70%條件下進(jìn)行人工飼養(yǎng)，飼喂人工飼料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法，其特征在于，以重量份計(jì)，所述人 工飼料由下述A、B、C、D四組原料制成A 大豆面12份，玉米面12份，酵母粉7. 2份；B:葡萄糖6份，蔗糖1份，Vc 0.4份，水36份或含待鑒定Bt蛋白的上清液36份； C:玉米粉3. 2份，水8份； D 瓊脂1. 2份，山梨酸0. 4份，水48份；先將A組中的三種原料混勻混合；將B組中的葡萄糖、蔗糖、Vc混合后加入36份水中； 取另一容器將C組原料混合均勻；再將D組中的瓊脂1放入48份水中，加熱至沸騰后加入將混勻的C組原料，隨后加入山梨酸，再等其降溫至50°C時(shí)加入混合后的A、B組混合物，攪 拌均勻，待凝固后切成長(zhǎng)條使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Bt蛋白體外抗蟲鑒定的方法。該方法將Bt基因連接到原核表達(dá)載體pET-28B上，將含有Bt基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)Bt蛋白，提取誘導(dǎo)表達(dá)出的Bt蛋白，將此Bt蛋白拌入玉米螟幼蟲人工飼料中喂養(yǎng)玉米螟幼蟲，數(shù)天后統(tǒng)計(jì)玉米螟幼蟲的死亡率和生長(zhǎng)狀況。該方法操作簡(jiǎn)單，快速，不受時(shí)間和季節(jié)限制、經(jīng)濟(jì)成本低，能快速地進(jìn)行Bt蛋白抗蟲鑒定。
文檔編號(hào)C12R1/21GK102086452SQ20101058525
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者盧彩霞, 孫靜, 岳潤(rùn)清, 朱衛(wèi)紅, 柏松, 王延召, 鐵雙貴, 齊建雙 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院