專利名稱：扁滸苔的檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測試劑，具體涉及扁滸苔的檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
扁滸苔屬石莼屬，可以食用或藥用，但大量增殖會引發(fā)綠潮等海洋災(zāi)難，造成有害 生物爆發(fā)和水生生物缺氧死亡等。目前鑒定石莼屬綠藻的方法包括形態(tài)學(xué)觀察、雜交測試 鑒定和分子發(fā)育系統(tǒng)學(xué)鑒別等。形態(tài)學(xué)觀察依據(jù)有葉狀體或絲狀體的形狀、細(xì)胞的形狀、細(xì) 胞的大小、葉狀體的厚度、細(xì)胞的排列方式、葉綠體的位置、蛋白核的數(shù)量等形態(tài)特征，但同 種藻類生活環(huán)境不同會出現(xiàn)較大的變化，不同種的藻類則可能會有相似的形態(tài)，如腸滸苔 通常沒有分枝，而扁滸苔有分枝，但低鹽或鹽休克可以誘導(dǎo)腸滸苔形成分枝，同時形態(tài)學(xué)觀 察耗時較長，要求實(shí)際操作人員有一定形態(tài)學(xué)觀察基礎(chǔ)，難以滿足快速、準(zhǔn)確的鑒定要求。 雜交測試通過對不同性別間配子的雜交實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)，根據(jù)是否存在生殖隔離，即能否雜交 來判斷種類，該方法操作要求更高，試驗(yàn)周期也較長。分子學(xué)鑒別主要是利用藻類細(xì)胞核的 核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列和葉綠體的核酮糖一二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因序列 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并綜合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，來確定種類，但該方法同樣存在實(shí)驗(yàn)周期較長問 題，且該方法的準(zhǔn)確性受分析所用序列、分析方法等多種因素影響，有時可能會獲得不準(zhǔn)確 的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供操作簡單、快速、準(zhǔn)確鑒別扁滸苔的檢測試劑品.ο本發(fā)明還提供了用該試劑盒快速、簡單地判定是否為扁滸苔的檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為扁滸苔的檢測試劑盒，該檢測試 劑盒包括10XPCR反應(yīng)緩沖液、雙蒸水、摩爾濃度為25mM的MgCl2溶液、摩爾濃度為2. 5 mM 的dNTP溶液、濃度為5 U / μ L的Taq DNA聚合酶溶液、摩爾濃度為10 μ M的正向引物和 反向引物，所述反應(yīng)緩沖液與所述MgCl2溶液、所述dNTP溶液、所述Taq DNA聚合酶、所述 正向引物和所述反向引物的體積比為2. 51.52 0.2 1 :1，所述正向引物的核苷酸序 列為5，-CGTTTTCGGA ACCGCCGGTG A-3，，所述反向引物的核苷酸序列為5，-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3，。若為25 μ L PCR反應(yīng)體系，使用時取檢測試劑盒中反應(yīng)緩沖液2.5 μ L，MgCl2溶液 1.5uL, dNTP溶液2 μ L，Taq DNA聚合酶溶液0. 2 μ L，正向引物和反向引物各1 μ L，加入 終濃度約為Ing/ μ L的藻類DNA提取物即模板DNA溶液1 μ L，用雙蒸水補(bǔ)充到25 μ L，若為 50 μ L PCR反應(yīng)體系，各成份體積就相應(yīng)加倍。10XPCR反應(yīng)緩沖液、dNTP溶液、Taq DNA聚合酶購于大連寶生物，正、反向引物引 物由上海英俊合成。扁滸苔的檢測方法，包括下述步驟31)DNA提取挑取單株藻體，稱取0.1 0.2 g的藻體放入1.5 ml第一離心管中，加 200 μ L 65°C水浴預(yù)熱ρΗ8.0的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)抽提液，研磨至勻漿，再加 入400yL 65°C水浴預(yù)熱的十六烷基三甲基溴化銨抽提液，顛倒混勻后于65°C水浴1 h，冷 卻至室溫，12000 rpm離心10 min，取第一上清液至第二離心管中，加入體積為300 μ L的 三羥基氨基甲烷飽和酚(Tris飽和酚)，體積為300 μ L的氯仿和異戊醇混合液，顛倒混勻后 靜置，12000rpm離心lOmin，取第二上清液至第三離心管中，加入與第二上清液等體積的氯 仿和異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，12000rpm離心lOmin，取第三上清液至第四離心管中， 加入與第三上清液等體積的異丙醇，輕輕顛倒混合均勻，于_20°C下沉淀lh，12000rpm離 心lOmin，棄去第三上清液，在第四離心管加入質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇500 μ L，至沉淀 懸浮，12000rpm離心5min，棄去第四上清液，室溫干燥，再在第四離心管加入50 μ L無菌水 溶解沉淀，得到模板DNA溶液，使用分光光度計(jì)調(diào)整模板DNA溶液濃度為Ing/ μ L，于-20 °C貯存?zhèn)溆茫鍪榛谆寤@抽提液含有質(zhì)量百分濃度為m的十六烷基三甲 基溴化銨、摩爾濃度為1.4 M的氯化鈉(NaCl)，摩爾濃度為20mM的乙二銨四乙酸二鈉 (EDTA 二鈉)，摩爾濃度為IOOmM的三羥基氨基甲烷鹽酸(Tris · HCl)，所述氯仿和異戊醇 混合液由氯仿與異戊醇按體積比為M 1配制；2)PCR反應(yīng)在所述檢測試劑盒取反應(yīng)緩沖液2. 5 μ L、MgCl2溶液1. 5 μ L，dNTP溶液 2uL, Taq DNA聚合酶溶液0. 2 μ L，正向引物和反向引物各1 μ L，加入1 μ L模板DNA溶液， 用雙蒸水定容至25 μ L，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為94°C，預(yù)變性2 min ；然后進(jìn)入下 列循環(huán)94°C，變性30 s，60°C，退火40 s, 72°C，延伸40 s，；34個循環(huán)；最后72°C，延伸10 min ；得到PCR產(chǎn)物；3)檢測取上述PCR產(chǎn)物5μ L于質(zhì)量百分濃度為2%的瓊脂糖TAE凝膠中，進(jìn)行電泳 分離，電泳后經(jīng)EB染色，根據(jù)有無330bp特異性片段來判斷，若有330bp特異性片段就為扁滸苔。2%瓊脂糖TAE凝膠由瓊脂糖與TAE緩沖液按重量體積比2 :100配置得到；CTAB、 EDTA、Tris · HC1、瓊脂糖、TAE緩沖液等均為市售化學(xué)產(chǎn)品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于扁滸苔的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括 IOXPCR反應(yīng)緩沖液，25mM的MgCl2溶液，2. 5mM的dNTP溶液，5U/μ L的Taq DNA聚合酶溶 液，10 μ M的正向引物和反向引物，它們的體積比為2. 5:1.5:2 0.2 1 :1，正向引物的核 苷酸序列為5，-CGTTTTCGGA ACCGCCGGTG A-3，，反向引物的核苷酸序列為5，-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3’ ；該檢測試劑盒只需要少量藻體在數(shù)小時內(nèi)就可以獲得準(zhǔn)確結(jié)果，DNA 含量為IOpg也能靈敏檢測，能夠準(zhǔn)確的將扁滸苔從其他海藻樣品種分離出來，不僅能檢測 具有較多鑒定特征的扁滸苔成熟藻體，還可以對形態(tài)特征較少的幼苗以及其他發(fā)育形態(tài)扁 滸苔藻體進(jìn)行快速鑒定，該檢測試劑盒對操作人員要求不高，因此本發(fā)明是一種操作簡單、 快速、準(zhǔn)確鑒別扁滸苔的檢測試劑盒。扁滸苔的檢測方法通過DNA提取得到模板DNA溶液、 模板DNA溶液與檢測試劑盒的各溶液組成為PCR反應(yīng)體系，通過PCR反應(yīng)得到PCR產(chǎn)物，用 瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)是否出現(xiàn)330bp的特異性片段就可快速、簡單地 判定是否為扁滸苔。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1扁滸苔的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括下述各管10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5yL、摩 爾濃度為25mM的MgCl2溶液1. 5 μ L、摩爾濃度為2. 5mM的dNTP溶液2 μ L、濃度為5U/ μ L 的Taq DNA聚合酶溶液0.2 μ L、摩爾濃度10 μ M的正向引物和反向引物各1 μ L和雙蒸水， 正向引物的核苷酸序列為5’ -CGTTTTCGGA ACCGCCGGTG Α-3’，反向引物的核苷酸序列為 5，-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3，，該檢測試劑盒可以與終濃度約為Ing/μ L的藻類DNA 提取物(模板DNA) 1 μ L，用雙蒸水補(bǔ)充到25 μ L，組成25 μ L PCR反應(yīng)體系。上述實(shí)施例中檢測試劑盒的各成份的體積相應(yīng)增加1倍，模板DNA的體積也增加 1倍，用雙蒸水補(bǔ)充到50 μ L，就為50 μ L PCR反應(yīng)體系。實(shí)施例2PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化鎂離子濃度的優(yōu)化按如下PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，25 μ L反 應(yīng)體系為2. 5μ L 10XPCR反應(yīng)緩沖液、鎂離子05mM)(選擇體積分別為1、1. 5、2、2. 5、3 yL)、2yL dNTP (2. 5mM)、lyL檢測扁滸苔的正向引物Ucm6f (10 μ Μ)，1 μ L檢測扁滸苔的 反向引物 Ucm2r (ΙΟμΜ),Ο. 2yL Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、1 μ L 模板 DNA (lng/μ L)，最 后用雙蒸水補(bǔ)充到25 μ L ；反應(yīng)條件為94°C，預(yù)變性2 min ;94°C，變性30 s，60°C，退火40 s, 72°C，延伸40 s，34個循環(huán)；72°C，延伸10 min;結(jié)果表明鎂離子與反應(yīng)緩沖液的體積比1.5μ L :2. 5μ L較佳。Taq DNA聚合酶濃度的優(yōu)化按如下PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對Taq DNA聚合酶濃 度進(jìn)行優(yōu)化，25μ L反應(yīng)體系為2. 5μ L 10XPCR反應(yīng)緩沖液、1.5μ L鎂離子Q5mM)、2yL dNTP (2. 5πιΜ)、 μ 檢測扁滸苔的正向引物Ucm6f (10 μ Μ)，1 μ L檢測扁滸苔的反向引物 Ucm2r (10 μ Μ)、選擇體積分別為 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5 μ L 的 Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、 1 μ L模板DNA (1 ng/μ L)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到25 μ L ；反應(yīng)條件為94°C，預(yù)變性2 min； 94°C，變性30 s，60°C，退火40 s, 72°C，延伸40 s，；34個循環(huán)；72°C，延伸10 min ；結(jié)果表 明Taq DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液的體積比0. 2 μ L :2. 5 μ L較佳。dNTP濃度的優(yōu)化按如下PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對dNTP濃度進(jìn)行優(yōu)化，25 μ L 反應(yīng)體系為2. 5μ L 10XPCR反應(yīng)緩沖液、1. 5μ L鎂離子Q5mM)、選擇體積分別為0. 5、1、2、2.5、3μ L的dNTP (2. 5mM)、1 μ L檢測扁滸苔的正向引物Ucm6f (10μΜ)，1μ 檢測扁 滸苔的反向引物 Ucm2r (ΙΟμΜ),Ο. 2yL Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、1 μ L 模板 DNA (1 ng/ μ L)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到25 μ L ；反應(yīng)條件為:94°C，預(yù)變性2 min ;94°C，變性30 s，60°C， 退火40 s, 72°C，延伸40 8，34個循環(huán)；721，延伸10 min ；結(jié)果表明dNTP與反應(yīng)緩沖液的 體積比2μ L :2. 5μ L較佳。引物濃度的優(yōu)化按如下PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，25μ L反 應(yīng)體系為2.5yL 10XPCR反應(yīng)緩沖液、1.5yL鎂離子Q5mM)、2yL dNTP Q.5mM)、選擇 體積分別為0. 25,0. 5、1、2、2· 5μ L的檢測扁滸苔的正向引物Ucm6f (10 μ Μ)和反向引物 Ucm2r (ΙΟμΜ),Ο. 2yL Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、1 μ L 模板 DNA (1 ng/yL)，最后用雙蒸 水補(bǔ)充到25yL ；反應(yīng)條件為94°C，預(yù)變性2 min ;94°C，變性30 s，60°C，退火40 s, 72°C,延伸40 8，34個循環(huán)；721，延伸10 min ；結(jié)果表明正向、反向引物與反應(yīng)緩沖液的體積比 IyL :2. 5μ L 較佳。實(shí)施例3分別對來自我國不同地區(qū)的3株孔石莼i/. /^rtol5a, 2株緣管滸苔K linza, 2株曲 滸苔U. flexuosa，6株滸苔U. prolifera, 3株石莼屬未鑒定種分離物以及5株扁滸苔U. compressa共21個樣品，進(jìn)行檢測。按如下DNA提取方法分別提取得到各自的模板DNA溶液挑取單株藻體，稱取0. 1 0. 2g的藻體放入1. 5ml第一離心管中，加200 μ L 65°C水浴預(yù)熱pH8. 0的CTAB抽提液 (含 2% CTAB、1.4 M 的 NaCl、20mM 的 EDTA 二鈉禾口 100 mM 的 Tris · HCl )，研磨至勻菜，再 加入400 μ L 65°C水浴預(yù)熱的CTAB抽提液，顛倒混勻后于65°C水浴lh，冷卻至室溫，12000 rpm離心IOmin，取第一上清液至第二離心管中，加入體積為300 μ L的Tris飽和酚和體 積為300 μ L的氯仿和異戊醇混合液(氯仿M 異戊醇1)，顛倒混勻后靜置，12000rpm離心 lOmin，取第二上清液至第三離心管中；加入與第二上清液等體積的氯仿和異戊醇混合液， 輕輕顛倒混勻，12000rpm離心lOmin，取第三上清液至第四離心管中，向第三上清液中加入 與第三上清液等體積的異丙醇，輕輕顛倒混合均勻，于-20°C下沉淀1 h，12000rpm離心 lOmin,棄去第三上清液，在第四離心管加入質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇500 μ L，至沉淀懸 浮，12000rpm離心5min，棄第四上清液，室溫干燥，再在第四離心管加入50 μ L無菌水溶解 沉淀，得到模板DNA溶液，使用分光光度計(jì)調(diào)整模板DNA溶液濃度約為1 ng/ μ L，于_20°C 貯存?zhèn)溆茫蝗「髯缘哪０錎NA溶液1 μ L，分別與實(shí)施例1的檢測試劑盒的反應(yīng)體系混合，用雙蒸水 補(bǔ)充到25 μ L，組成25 μ L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)循環(huán)條件為94°C，預(yù)變性 anin ;94°C，變性 30 s，60°C，退火 40 s, 72°C，延伸 40 s，；34 個循環(huán)；72°C，延伸 10 min，得 到PCR產(chǎn)物；再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳后經(jīng)EB染色，根據(jù)有無330bp特 異性片段來判斷，若有330bp特異性片段就為扁滸苔，結(jié)果顯示5個扁滸苔樣品都能檢測 出330bp的特異性擴(kuò)增片段，而其他樣品沒有特異性片段產(chǎn)生，PCR反應(yīng)和糖凝膠電泳、染 色都為常規(guī)技術(shù)，在此不作詳細(xì)說明，本實(shí)施例檢測結(jié)果說明本發(fā)明的檢測試劑盒對扁滸 苔特異，靈敏。
權(quán)利要求
1.扁滸苔的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括10XPCR反應(yīng)緩沖液和雙蒸水、摩爾濃度 為25 mM的MgCl2溶液、摩爾濃度為2. 5mM的dNTP溶液、濃度為5 U / μ L的Taq DNA聚 合酶溶液、摩爾濃度為IOyM的正向引物和反向引物，其特征在于所述反應(yīng)緩沖液與所述 MgCl2溶液、所述dNTP溶液、所述Taq DNA聚合酶、所述正向引物和所述反向引物的體積比 為2. 5 1. 5 2 0. 2 1 :1，所述正向引物的核苷酸序列為5，-CGTTTTCGGA ACCGCCGGTG A-3，，所述反向引物的核苷酸序列為5，-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3，。
2.用權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒檢測扁滸苔的方法，其特征在于包括下述步驟1)DNA提取挑取單株藻體，稱取0.1 0.2g的藻體放入1.5ml第一離心管中，加 200 μ L 65°C水浴預(yù)熱pH8. 0的十六烷基三甲基溴化銨抽提液，研磨至勻漿，再加入400 μ L 65°C水浴預(yù)熱的十六烷基三甲基溴化銨抽提液，顛倒混勻后于65°C水浴lh，冷卻至室溫， 12000 rpm離心lOmin，取第一上清液至第二離心管中，加入體積為300 μ L的三羥基氨基甲 烷飽和酚，體積為300 μ L的氯仿和異戊醇混合液，顛倒混勻后靜置，12000rpm離心lOmin， 取第二上清液至第三離心管中，加入與第二上清液等體積的氯仿和異戊醇混合液，輕輕顛 倒混勻，12000rpm離心lOmin，取第三上清液至第四離心管中，加入與第三上清液等體積的 異丙醇，輕輕顛倒混合均勻，于_20°C下沉淀lh，12000rpm離心lOmin，棄去第三上清液，在 第四離心管加入質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇500 μ L，至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄去 第四上清液，室溫干燥，再在第四離心管加入50 μ L無菌水溶解沉淀，得到模板DNA溶液， 使用分光光度計(jì)調(diào)整模板DNA溶液濃度為Ing/ μ L，于_20°C貯存?zhèn)溆?，所述十六烷基三?基溴化銨抽提液含有質(zhì)量百分濃度為洲的十六烷基三甲基溴化銨、摩爾濃度為1.4M的 氯化鈉，摩爾濃度為20mM的乙二銨四乙酸二鈉，摩爾濃度為IOOmM的三羥基氨基甲烷 鹽酸，所述氯仿和異戊醇混合液由氯仿與異戊醇按體積比為M 1配制；2)PCR反應(yīng)在所述檢測試劑盒取反應(yīng)緩沖液2. 5 μ L、MgCl2溶液1. 5 μ L，dNTP溶液 2uL, Taq DNA聚合酶溶液0. 2 μ L，正向引物和反向引物各1 μ L，加入1 μ L模板DNA溶液， 用雙蒸水定容至25 μ L，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為94°C，預(yù)變性^iin ；然后進(jìn)入下列 循環(huán)94°C，變性30 s，60°C，退火40 s, 72°C，延伸40 s，34個循環(huán)；最后72 °C，延伸10 min ；得到PCR產(chǎn)物；3)檢測取上述PCR產(chǎn)物5μ L于質(zhì)量百分濃度為2%的瓊脂糖TAE凝膠中，進(jìn)行電泳 分離，電泳后經(jīng)EB染色，根據(jù)有無330bp特異性片段來判斷，若有330bp特異性片段就為扁滸苔。
全文摘要
本發(fā)明公開了扁滸苔的檢測試劑盒及檢測方法，該檢測試劑盒包括10×PCR反應(yīng)緩沖液，MgCl2溶液，dNTP溶液，TaqDNA聚合酶溶液，正向引物和反向引物，它們的體積比為2.5∶1.5∶2∶0.2∶1∶1，正向引物的核苷酸序列為5′-CGTTTTCGGA ACCGCCGGTGA-3′，反向引物的核苷酸序列為5′-GGCCAGGTCCACGGCCCGCTCT-3′；檢測方法通過DNA提取得到模板DNA溶液、模板DNA溶液與檢測試劑盒的各溶液組成為PCR反應(yīng)體系，通過PCR反應(yīng)得到PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)是否出現(xiàn)330bp的特異性片段條帶就快速、簡單地判定是否為扁滸苔，準(zhǔn)確將扁滸苔從其他海藻樣品種分離出來，能檢測具有較多鑒定特征的扁滸苔成熟藻體，還可以對形態(tài)特征較少的幼苗以及其他發(fā)育形態(tài)扁滸苔藻體進(jìn)行快速鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102051417SQ20101058571
公開日2011年5月11日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者朱水芳, 段維軍, 郭立新, 陳先鋒 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心