專利名稱：蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致 自身組織損害所引起的疾病，即人體免疫系統(tǒng)攻擊自身的組織。全球約有5 8%的人口 受到約40多種自身免疫性疾病的威脅，包括T細胞介導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞病、自身免疫性甲狀腺病和I型糖尿病等。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中免疫 系統(tǒng)攻擊病患的關(guān)節(jié)部位，多發(fā)性硬化癥是神經(jīng)細胞的神精髓鞘(myelin sheaths)受到攻 擊。這些疾病涉及全身一種或多種組織和器官，嚴(yán)重影響人體健康及生命。針對自身免疫 性疾病，目前無有效療法，且病情反復(fù)發(fā)作。目前常用對抗自體免疫性疾病的方法，一是利 用類固醇來減緩因免疫系統(tǒng)攻擊組織所造成的炎癥反應(yīng)，二是使用免疫抑制藥物，抑制免 疫系統(tǒng)的作用，但這兩種方法都會造成嚴(yán)重的副作用，而且都只能減緩病情的發(fā)展速度，不 能根治疾病。為了改變自身免疫性疾病藥物治療的落后現(xiàn)狀，急需探索新的疾病預(yù)防和治 療方法。原態(tài)(naive ) T細胞被特異性的抗原物質(zhì)激活后，進行增殖和分化，一般形成在 功能上 各異的兩類細胞，即效應(yīng)型記憶T細胞(effector memory, TEM)和中央型記憶T細 胞(central memory，TCM)。在人體T細胞膜上存在兩種鉀通道，一種是電壓門控鉀通道 Kvl. 3，另一種是中等電導(dǎo)鈣激活鉀通道IKCal。近年來，研究發(fā)現(xiàn)鉀通道Kvl. 3在不同類型 T細胞上具有顯著的時空表達差異性，當(dāng)T細胞被激活后，只有發(fā)揮免疫功能的TEM細胞可 顯著地表達1500 2000個Kvl. 3鉀通道。這種鉀通道Kvl. 3高表達情況相繼在患不同自 身免疫性疾病的病人的TEM細胞中得到證實。因此，T細胞膜上鉀通道Kvl. 3給治療自身 免疫性疾病帶來新的希望[J. Clin. Invest.，2003，111 1703 ；Immunity, 2008, 29 :602]。有機小分子藥物首先受到更多的關(guān)注。如Merck公司、澳大利亞Walter andEliza Hall藥物研發(fā)中心、美國加利福尼亞大學(xué)等機構(gòu)篩選、分離、合成、改造和鑒定了大量的有 機小分子藥物候選物[Mol. Pharmacol，2004，65 1364 Journal of Medicinal Chemistry, 2006,49 (4) 1433 ；Mol. Pharmacol, 2005,68 :1254]。但有機小分子候選藥物幾乎均作用鉀 通道Kvl. 3和其它相似鉀通道，因而極可能造成作用較強的毒副反應(yīng)，如有機小分子藥物 作用同源Kvl. UKvl. 2,Kvl. 4,Kvl. 5等活性比Kvl. 3通道低2 70倍。由于篩選設(shè)計有 機小分子候選藥物具有巨大的挑戰(zhàn)性，篩選設(shè)計多肽將成為新的趨勢。中國傳統(tǒng)醫(yī)藥常用“以毒攻毒”的策略治療人類的疑難雜癥，有毒動物，如蝎、蛇、 蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首選。現(xiàn)代研究已表明這些有毒動物的毒液中富含動物活性多肽，這 些多肽可特異性作用細胞膜上離子通道。當(dāng)今，這些動物活性多肽已成為全球競爭研發(fā)的 重要藥物資源[Nat. Rev. Drug. Discov. 20032 63]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供穩(wěn)定的治療自身免疫性疾病的蝎活性多肽。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明通過篩選我國蝎活性多肽基因庫，得到了許多具有重要藥用前景的多肽基因，通過已建立的計算機輔助篩選與設(shè)計技術(shù)[Biophysical Journal, 2004,87 105 ； Proteins, 2008, 70 744 Journal of Proteome Research, 2010，9 :3118]，虛擬蹄選到 3 個 可能特異性作用鉀通道Kvl. 3的蝎活性肽新基因。通過基因工程技術(shù)，獲得了三種蝎活性 多肽，這三種蝎活性多肽分子內(nèi)均含有3對二硫鍵，在體外穩(wěn)定性強，易于長期保存。根據(jù) 蝎活性多肽在分類學(xué)上的結(jié)構(gòu)特征，三者屬于同一亞型的α-KTX家族，且都作用于鉀通道 Kvl. 3。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的蝎活性 肽,命名為ADMR-011。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蝎活性 多肽,命名為ADMR-016。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的蝎活 性多肽，命名為ADMR-019。本發(fā)明還提供了具有通過在SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的 氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的 DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定多肽的核苷酸 序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的 蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的 蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列 的蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO 6所示。同時本發(fā)明提供了具有編碼本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和 ADMR-019DNA分子的載體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種載體，其具有可以編碼本發(fā)明所述蝎活性 多肽ADMR-011的DNA分子。其中，作為優(yōu)選，所述載體為具有可以編碼所述蝎活性多肽 ADMR-011的DNA分子的pGEX_6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQ ID NO 4所示核 苷酸序列的pGEX-6p-l。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種載體，其具有可以編碼本發(fā)明所述蝎活性 多肽ADMR-016的DNA分子。其中，作為優(yōu)選，所述載體為具有可以編碼所述蝎活性多肽 ADMR-016的DNA分子的pGEX-6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQ ID NO :5所示核 苷酸序列的pGEX-6p-l。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種載體，其具有可以編碼本發(fā)明所述蝎活 性多肽ADMR-019的DNA分子。其中，作為優(yōu)選，所述載體為具有可以編碼所述蝎活性多肽ADMR-Oll的DNA分子的pGEX_6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQ ID NO 6所示核 苷酸序列的pGEX-6p-l。本發(fā)明也提供了所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的制備方法，包 括

步驟1 獲取具有可以編碼SEQ ID NO =USEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的氨 基酸序列的DNA分子；步驟2 將步驟1所獲得的DNA分子與表達載體融合，構(gòu)建重組表達載體，并轉(zhuǎn)化 宿主細胞；步驟3 誘導(dǎo)含重組表達載體的宿主細胞表達融合蛋白，分離純化表達的融合蛋 白。目前利用基因工程技術(shù)獲得DNA分子的方法有很多種，包括利用限制性內(nèi)切酶酶 切具有編碼所述蝎活性多肽DNA分子的載體或以具有編碼所述蝎活性多肽的DNA分子的 cDNA為模板PCR擴增。在一個實施方案中，本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-Oll的制備方法所述步驟1具體 為以具有編碼SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :7所示核苷 酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :8所示核苷酸序列的下游引物擴增。在一個實施方案中，本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-016的制備方法所述步驟1具體 為以具有編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :9所示核苷 酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :10所示核苷酸序列的下游引物擴增。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-019的制備方法所述步驟1具 體為以具有編碼SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ ID N0:11所示 核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的下游引物擴增。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述表達載體包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和 PMAL系列。在一個優(yōu)選實施方案中，表達載體為pGEX系列中的pGEX-6p-l。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述宿主細胞為大腸桿菌表達菌株，包括Rosetta系 列和BL21系列菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞為Rosetta(DE3)菌株。 實驗表明，本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016和ADMR-019可特異性作用 于鉀通道Kvl. 3，并可在大鼠動物水平有效地治療多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身 免疫性疾病。因此本發(fā)明還提供了所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾 病藥物中的應(yīng)用，所述鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾病包括自身免疫性疾病，具體為多發(fā)性硬化癥 或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。


圖1示重組蝎活性多肽ADMR-Oll及其GST融合表達蛋白的電泳檢測圖，其中，泳 道1為蛋白質(zhì)分子量Marker ；2泳道為ADMR-Oll未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細胞蛋白；泳道3為 ADMR-011經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細胞蛋白；泳道4為親和層析后的融合蛋白GST-ADMR-011 ；泳道 5為超濾脫鹽濃縮后的融合蛋白GST-ADMR-011 ；泳道6為融合蛋白GST-ADMR-011經(jīng)EK酶 切后的產(chǎn)物；泳道7為經(jīng)HPLC分離純化的ADMR-Oll多肽；圖2示重組蝎活性多肽ADMR-016及其GST融合表達蛋白的電泳檢測圖，其中，泳道1為ADMR-016未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細胞蛋白；泳道2為ADMR-016經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細胞蛋 白；泳道3為超濾脫鹽濃縮后的融合蛋白GST-ADMR-016 ；泳道4為融合蛋白GST-A DMR-016 經(jīng)EK酶切后的產(chǎn)物；泳道5為經(jīng)HPLC分離純化的ADMR-016多肽；圖3示重組蝎活性多肽ADMR-019及其GST融合表達蛋白的電泳檢測圖，其中， 泳道1為超濾脫鹽濃縮后的融合蛋白GST-ADMR-019 ；泳道2為融合蛋白GST-ADMR-019經(jīng) EK酶切后的產(chǎn)物；泳道3為經(jīng)HPLC分離純化的ADMR-019多肽，泳道4為蛋白質(zhì)分子量 Marker ；圖4示重組蝎活性多肽ADMR-Oll與GST蛋白質(zhì)的色譜分離純化圖；圖5示重組蝎活性多肽ADMR-016與GST蛋白質(zhì)的色譜分離純化圖；圖6示重組蝎活性多肽ADMR-019與GST蛋白質(zhì)的色譜分離純化圖；圖7示重組蝎活性多肽ADMR-Ol 1質(zhì)譜分析圖；圖8示重組蝎活性多肽ADMR-016質(zhì)譜分析圖；圖9示重組蝎活性多肽ADMR-019質(zhì)譜分析圖；圖10示IOOpM蝎活性多肽ADMR-Oll對鉀通道Kvl. 3電流的抑制示意圖；圖11示InM蝎活性多肽ADMR-016對鉀通道Kvl. 3電流的抑制示意圖；圖12示 InM蝎活性多肽ADMR-019對鉀通道Kvl. 3電流的抑制示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒 本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法和應(yīng)用已經(jīng)通 過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所 述的產(chǎn)品、方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明，通過篩選我國蝎活性多肽基因庫，利用基因工程技術(shù)，獲得了三種新 型蝎活性多肽，分子內(nèi)均具有3對二硫鍵，在體外穩(wěn)定性強，易于長期保存。在一個實施方 案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名為ADMR-011。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名 為ADMR-016。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的 蝎活性多肽命名為ADMR-019。本發(fā)明還提供了具有通過在SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的 氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的 DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定多肽的核苷酸 序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼蝎活性多肽ADMR-Oll的DNA分子，其 核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子，其 核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。同時本發(fā)明提供了具有編碼本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和 ADMR-019DNA分子的載體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種載體，其具有可以編碼本發(fā)明所述蝎活性 多肽ADMR-Oll的DNA分子。其中，在一個實施方案中，所述載體為具有可以編碼所述蝎活 性多肽ADMR-Oll的DNA分子的pGEX_6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了 一種載體，其具有可以編碼本發(fā)明所述蝎活性 多肽ADMR-016的DNA分子。其中，在一個實施方案中，所述載體為具有可以編碼所述蝎活 性多肽ADMR-016的DNA分子的pGEX_6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種載體，其具有可以編碼本發(fā)明所述蝎活性 多肽ADMR-019的DNA分子。其中，在一個實施方案中，所述載體為具有可以編碼所述蝎活 性多肽ADMR-Oll的DNA分子的pGEX_6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQ ID NO 6 所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。為了制備本發(fā)明所述蝎活性多肽，本發(fā)明也提供了所述蝎活性多肽的制備方法， 包括步驟1 獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016或ADMR-019的DNA分 子；步驟2 將步驟1所獲得的DNA分子與表達載體融合，構(gòu)建重組表達載體，并轉(zhuǎn)化 宿主細胞；步驟3 誘導(dǎo)含重組表達載體的宿主細胞表達融合蛋白，分離純化表達的融合蛋 白。目前利用基因工程技術(shù)獲得DNA分子的方法有很多種，包括利用限制性內(nèi)切酶酶 切具有編碼所述蝎活性多肽DNA分子的載體或以具有編碼所述蝎活性多肽DNA分子的 cDNA為模板PCR擴增。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了以具有編碼所述蝎活性多肽ADMR-011的cDNA 為模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :8所示的核 苷酸序列的下游引物擴增，獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADMR-011DNA。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了以具有編碼權(quán)利所述蝎活性多肽ADMR-016的 cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:10所 示的核苷酸序列的下游引物擴增，獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADMR-016DNA分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了以具有編碼所述蝎活性多肽ADMR-019的 cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:12所 示的核苷酸序列的下游引物擴增，獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADMR-019DNA分子。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述將步驟1所獲得的DNA分子與表達載體融合，構(gòu) 建重組表達載體，并轉(zhuǎn)化宿主細胞具體為步驟1所得DNA分子通過凝膠電泳回收和雙酶切 插入表達載體，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。其中，本發(fā)明所述表達載體包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和pMAL系列。在一個優(yōu)選實施方案中，表達載體為PGEX系列中的pGEX-6p-l。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化宿主細胞為大腸桿菌表達菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌 株。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞為Rosetta(DE3)菌株。真核細胞偏愛的密碼子和原 核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達真核基因的時候，真核基因中的一些密碼子對于原 核細胞來說可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達效率和表達水平很低。Rosetta (DE3)是攜帶 PRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，可以補充大腸桿菌缺乏的七種稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA， CCC, GGA及CGG)對應(yīng)的tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。 本發(fā)明所述制備方法所述步驟3具體為IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)含重組表達載體的宿主 細胞，收集菌體超聲波破碎，取上清親和層析得到融合蛋白，再經(jīng)脫鹽濃縮、小腸激酶酶 切和色譜分離，獲取色譜純的蝎活性多肽。其中，所述親和層析的層析介質(zhì)為根據(jù)表達 載體的選擇性標(biāo)簽選擇的與之相匹配的層析介質(zhì)。在一個優(yōu)選實施方案中，表達載體為 pGEX-6p-l，親和層析的層析介質(zhì)為GST親和層析膠。在具體實施方案中，本發(fā)明所述制備方法具體為以具有編碼所述蝎活性多肽 ADMR-Ol 1 ,ADMR-016或ADMR-019的DNA分子的cDNA為模板，用根據(jù)編碼成熟肽部分的核苷 酸序列設(shè)計的引物，獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016或ADMR-019的DNA 分子，凝膠電泳回收和雙酶切獲取的DNA分子及表達載體pGEX-6p-l，連接構(gòu)建重組表達質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)獲得重組菌。然后IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)含重組表達載體的宿主 細胞，收集菌體超聲波破碎，取上清GST親和層析得到融合蛋白，再經(jīng)脫鹽濃縮、小腸激酶 酶切和色譜分離，獲取色譜純的蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6或ADMR-019。本發(fā)明通過膜片鉗技術(shù)鑒定了所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019 對鉀通道Kv 1. 3的藥理學(xué)活性。結(jié)果顯示，所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019 可特異性抑制鉀通道Kvl.3電流，抑制電流半數(shù)的多肽濃度(IC50值)分別為91pM、 2. 58nM、l. 4InM，表明蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019可特異性作用自身免疫 疾病的靶標(biāo)鉀通道Kvl.3。本發(fā)明通過在大鼠動物水平上模擬治療多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎檢測蝎 活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016和ADMR-019藥物治療效果。結(jié)果顯示，蝎活性多肽ADMR-Ol 1、 ADMR-016和ADMR-019治療后，大鼠多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀得到顯著改善， 表明蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019能有效地治療多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明通過對蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的毒性作用研究，發(fā)現(xiàn) 蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019在超過自身免疫疾病動物模型治療劑量100倍 的劑量下對小鼠無明顯毒性，表明蝎活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016和ADMR-019毒副作用小。因此本發(fā)明還提供了所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾病 藥物中的應(yīng)用，所述鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾病包括自身免疫性疾病，具體為多發(fā)性硬化癥或 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019分子內(nèi)均具有3對二硫 鍵，在體外穩(wěn)定性好，易于長期保存。膜片鉗技術(shù)鑒定顯示可特異性作用鉀通道Kvl. 3，特異 性強，是目前國際上已發(fā)現(xiàn)的活性強的多肽。動物實驗表明，重組多肽ADMR-011、ADMR-016 和ADMR-019可以有效治療大鼠的多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，藥物效果顯著，并且對實驗動物毒副作用小。本發(fā)明所述蝎活性多肽的制備方法簡單易行，操作方便，易于生產(chǎn)和 制備高純度的ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6和ADMR-019蝎活性多肽。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的蝎活性多肽及其制備方 法與應(yīng)用進行詳細說明。實施例1 蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6和ADMR-019基因的獲取取40只海南斑等蝎(Isometrus maculates)蝎尾腺，用Trizol試劑 (Invitrogen)提取總RNA，提取方法參照Trizol試劑盒說明書。用Poly A TractmRNA Isolation System(Promega)試劑盒純化 mRNA,并米用 SuperscriptPlasmid System cDNA library construction kit (Gibco/BRL)試劑盒構(gòu)建 cDNA 文庫。將 cDNA 克隆到 pSPORTl 載 體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，隨機挑選cDNA克隆進行測序。對測序的結(jié)果進行序列分析， 共獲得可能與鉀離子通道相互作用的236個蝎活性肽新基因。通過建立的計算機輔助篩 選與設(shè)計技術(shù)[Biophysical Journal, 2004,87 105 ；Proteins, 2008, 70 744 Journal of ProteomeResearch，2010，9 3118]，分別預(yù)測136個蝎活性肽基因編碼多肽的空間結(jié)構(gòu)， 然后通過計算機虛擬篩選它們與鉀通道Kvl. 3的相互作用，獲得了具有編碼蝎活性多肽 ADMR-OlU ADMR-016和ADMR-019DNA分子的cDNA基因，所編碼的成熟肽分別為具有如SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :3 所示氨基酸序列的蝎活性多肽 ADMR-Ol 1、ADMR_016 禾口 ADMR-019。 實施例2 擴增編碼蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-016和ADMR-019的DNA分子1、引物設(shè)計分別以蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-016和ADMR-019的cDNA基因序列中編碼成熟 肽部分的核苷酸序列作為PCR反應(yīng)的模板序列設(shè)計引物。設(shè)計的引物為ADMR-Oll上游引物為SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列；ADMR-011下游引物為SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列；ADMR-016上游引物為SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列；ADMR-016下游引物為SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列；ADMR-019上游引物為SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列；ADMR-019下游引物為SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列；2、擴增DNA分子以蝎毒cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物和具有 SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列的下游引物進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系為IOXtaq buffer (with 1. 5mM Mg2+) 5μ 1dNTP (5mM)4 μ 1上游引物(100ng/ul)Ιμ 下游引物(100ng/ul)Ιμ 模板(5-50ng/y1)1 μ 1Taq 酶(2U/ μ 1)0. 5 μ 1加入滅菌蒸餾水補足體系總量50 μ 1。PCR反應(yīng)程序為
94°C 預(yù)變性300 s
94°C 變性45s〕
55°C退火45s [32個循環(huán)
72°C延伸45s J72°C 延伸200s3、重組表達載體構(gòu)建將PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳回收，用EcoRI和XhoI雙酶切，將酶切后的片段插入經(jīng) EcoRI和XhoI雙酶切的表達載體pGEX-6p-l (購自Pharmacia公司)，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci (中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。從含氨芐青霉素的LB平板中挑取單菌 落，在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)5小時，然后用PCR擴增的方法對這些培 養(yǎng)物進行鑒定。PCR擴增模板用培養(yǎng)獲得的菌液，擴增的引物、反應(yīng)條件和反應(yīng)過程同DNA 分子擴增過程。選取PCR鑒定正確的菌種進行測序，獲得序列正確的含重組表達載體的菌 種，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。蝎活性多肽ADMR-016和ADMR-019的DNA分子擴增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序以及重組 表達載體構(gòu)建與ADMR-Oll相同。實施例3蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6和ADMR-019的表達和純化提取測序序列正確的含重組表達載體的pGEX-6p-l-ADMR_011菌種的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌Rosetta (DE3)。IPTG (華美生物工程公司)誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，收集菌體，懸 浮于緩沖液(50mM Tris-Cl, l.OmM EDTA,pH8. 0)中，超聲波破碎菌體，離心收集上清。所得 上清通過GST親和層析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液脫鹽濃縮、小腸激酶(EK) 酶切，獲得蝎活性多肽ADMR-011。利用高效液相色譜對ADMR-011多肽進一步分離，去除GST 蛋白質(zhì)，得到色譜純ADMR-Oll多肽。ADMR-Oll多肽理論分子量為4258. 7Da，經(jīng)質(zhì)譜分析顯 示它的分子量為4258. 8Da，與根據(jù)氨基酸序列推斷的分子量一致。其中，對不同階段得到的 ADMR-Oll多肽及其與GST融合蛋白進行了 PAGE電泳檢測，結(jié)果見圖1，高效液相色譜分離 純化和質(zhì)譜分析結(jié)果見圖4和圖7。ADMR-Oll多肽理論分子量為4258. 7Da，經(jīng)質(zhì)譜分析顯 示它的分子量為4258. 8Da，與根據(jù)氨基酸序列推斷的分子量一致。蝎活性多肽ADMR-016和ADMR-019的表達和純化方法和步驟與ADMR-Oll多肽相 同，相關(guān)的多肽的分離純化和質(zhì)譜檢測結(jié)果見圖2、圖3圖5、圖6、圖8和圖9。ADMR-016 和ADMR-019多肽理論分子量分別為3912. 6Da、3940. 6Da,經(jīng)質(zhì)譜分析，它們分子量分別為 3912. 9Da、3940. 7Da，與根據(jù)氨基酸序列推斷的分子量一致。實施例4 蝎活性多肽ADMR-011,ADMR-016和ADMR-019對鉀通道Kvl. 3的藥理學(xué) 活性分析將C0S-7細胞在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37°C、5% C02條件下培養(yǎng)，將鉀 通道Kvl. 3重組質(zhì)粒分別用Sofast 的轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細胞在0. 8mg/mL Geneticin 培養(yǎng)基上選擇性培養(yǎng)。利用全細胞膜片鉗用儀器(EPC-10雙通道膜片鉗放大器HEKA， Elektronik, Lambrecht, Germany)，對重組蝎活性多肽 ADMR-OlU ADMR-016 和 ADMR-019 的藥理學(xué)活性進行測定和分析。實驗參數(shù)的設(shè)置、數(shù)據(jù)的采集和刺激的施加均通過Pulse 軟件(Elektronik，Lambrecht, Germany)來控制。儀器的濾波器設(shè)置為 IOkHz (Bessel)，電極阻抗為2-5ΜΩ，在電極與細胞膜之間形成高阻(1-5GQ)封接后，進行快電容自動補 償(c-fast)，稍加負(fù)壓破膜后，進行慢電容自動補償(c-slow)，在_70mV的鉗制電位下， 從-60mV起給予IOmV步幅遞增、80ms步寬的去極化脈沖刺激至+50mV，觀察電流情況，將多 肽 ADMR-011、ADMR-016 和 ADMR-019 通過 MPS-2(INBI0 Inc, Wuhan, China)灌注系統(tǒng)實現(xiàn) 精確灌注。將3種蝎活性多肽溶解后，經(jīng)DAD給藥系統(tǒng)(ALA)噴射給藥，給藥管尖端距記錄 細胞ΙΟΟμπι左右，結(jié)果見圖10、圖11和圖12。

由圖10、圖11和圖12可知ADMR-Oll對鉀通道Kvl. 3的藥理學(xué)活性為91ρΜ， ADMR-016對鉀通道Kvl. 3的藥理學(xué)活性為2. 58nM，ADMR-019對鉀通道Kvl. 3的藥理學(xué)活 性為1.41nM，是目前國際上已發(fā)現(xiàn)的活性強的多肽。實施例5 蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019治療多發(fā)性硬化癥的藥效
實驗實驗動物選取近交系雌性Wistar大鼠(6_8周齡，體重150士 IOg)，豚鼠 (300-400g購自武漢大學(xué)實驗動物中心)。主要試劑福氏完全佐劑(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)， 豚鼠 MBP (Sigma)。全脊髓勻漿-福氏完全佐劑混合乳劑(GPSCH-CFA)的配制將豚鼠處死后，迅速取 出脊髓，用超聲破碎儀(Sonics & Materials Inc, America)制成50%的PBS勻漿，與等量 的福氏完全佐劑(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳劑。EAE的誘導(dǎo)Wistar大鼠EAE模型=Wistar大鼠雙后腿足墊皮內(nèi)注射 0.4mlGPSCH-CFA乳劑，或同時皮內(nèi)注射約IX IOltl百日咳疫苗。每日稱重，觀察神經(jīng)癥狀。 飼養(yǎng)2周即出現(xiàn)實驗性自身免疫性腦脊髓炎。將實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠隨機分為分為五組正常對照組(陰性 對照組)、模型對照陰(模型鼠+生理鹽水)、A給藥組(模型鼠+ADMR-Oll多肽)、B給藥組 (模型鼠+ADMR-016多肽)和C給藥組(模型鼠+ADMR-019多肽)，每組10只。給藥組將 多肽ADMR-Ol 1、ADMR-016和ADMR-019分別按100 μ g · kg-1劑量皮下注射，每天上午1次， 正常對照組和模型對照陰皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)給藥。給藥14天后，觀察大鼠患實 驗性自身免疫性腦脊髓炎狀況，根據(jù)大鼠狀況評分，記錄每只動物最高臨床評分，取它們的 均值為平均臨床評分，結(jié)果見表1。評分標(biāo)準(zhǔn)為無任何臨床癥狀，0分；尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙，1分；雙 后肢無力，被動翻身后可以恢復(fù)，2分；雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復(fù)，3分；四肢癱瘓伴 尿、便失禁，4分；瀕死狀態(tài)或死亡，5分。表IEAE模型中各實驗組大鼠的評分(
權(quán)利要求
1.作用于鉀通道Kvl.3的α-KTX家族蝎活性多肽，其特征在于，具有如SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
2.具有通過在SEQID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列中取代、 缺失或添加一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列的多肽，其可特異性作用于鉀通道 Kvl. 3。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述蝎活性多肽的DNA分子。
4.編碼SEQID NO 1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列。
5.編碼SEQID NO :2所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列。
6.編碼SEQID NO 3所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO 6 所示的核苷酸序列。
7.具有權(quán)利要求3所述DNA分子的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述載體，其特征在于，所述載體為pGEX-6p-l。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述載體，其特征在于，所述載體具有如SEQID NO 4, SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6所示核苷酸序列。
10.權(quán)利要求1所述蝎活性多肽的制備方法，包括步驟1 獲取具有可以編碼SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的氨基酸 序列的DNA分子；步驟2 將步驟1所獲得的DNA分子與表達載體融合，構(gòu)建重組表達載體，并轉(zhuǎn)化宿主 細胞；步驟3 誘導(dǎo)含重組表達載體的宿主細胞表達融合蛋白，分離純化表達的融合蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟1具體為以具有編碼SEQID NO :1所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物 和具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列的下游引物擴增。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟1具體為以具有編碼SEQID NO :2所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列的上游引物 和具有SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列的下游引物擴增。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述制備方法，其特征在于，所述步驟1具體為以具有編碼SEQID NO 3所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ IDNO 11所示的核苷酸序列的上游引物 和具有SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列的下游引物擴增。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述制備方法，其特征在于，步驟2所述表達載體為pGEX-6p-l。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述制備方法，其特征在于，步驟2所述宿主細胞為 Rosetta(DE3)菌株。
16.權(quán)利要求1所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kvl.3相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述應(yīng)用，其特征在于，所述鉀通道Kvl.3相關(guān)疾病為自身免疫性疾病。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述應(yīng)用，其特征在于，所述自身免疫性疾病為多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了三種蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明三種蝎活性多肽分別為具有如SEQ ID NO1所示氨基酸序列的ADMR-011、具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的ADMR-016和具有如SEQID NO9所示氨基酸序列的ADMR-019。本發(fā)明所述制備方法為獲取具有編碼蝎活性多肽的DNA分子與表達載體融合構(gòu)建重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，誘導(dǎo)表達融合蛋白，分離純化表達的融合蛋白。本發(fā)明還提供了所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kv1.3相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK102127160SQ20101058827
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者吳英亮, 曹志賤, 李文鑫, 韓松 申請人:武漢摩爾生物科技有限公司