專利名稱：一種基于可視芯片的檢測食品過敏原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及一種基于可視芯片的檢測方法，尤其涉及食品過敏原的檢測 方法。
背景技術(shù)：
食物過敏是人們對食物產(chǎn)生的一種不良反應，屬機體對外源物質(zhì)(過敏原)產(chǎn)生 的一種變態(tài)反應。食物過敏的臨床表現(xiàn)包括頭痛、哮喘、過敏性鼻炎、蕁麻疹、腸病綜合征、 過敏性休克或死亡等臨床癥狀。食物過敏也是近幾年日益被關(guān)注的一個食品安全問題，目 前被世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為常見的八大類過敏原(食物)是小麥、花生、大豆、堅果類、 牛奶、雞蛋、魚和甲殼類。現(xiàn)在對于食物過敏治療尚無特效方法，嚴格避免食用含有過敏成 分的食品是最有效的療法。正因如此，美國于2006年1月1日正式實施《食品過敏原標識 和消費者保護法規(guī)》。歐盟、日本、澳大利亞及新西蘭等也先后出臺了相關(guān)法令，要求食品標 簽中必須明確標識過敏原物質(zhì)成分，因此建立過敏原檢測方法對于確保食品標簽的一致性 和消費者的安全十分必要。食品過敏原的檢測方法當前主要分為兩類。一類為免疫學方法，針對食品過敏的 致敏蛋白，主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法、放射免疫法、免疫印跡法等，其中最常 用、靈敏度最高的是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，操作最簡便的是免疫層析法。第二類為核酸 擴增方法，能針對食品過敏原特異性基因序列，檢測出食品中的過敏原基因。目前，食品過 敏原已有一些商業(yè)化試劑盒。如美國的Neogen Corporation、英國的I^pnel BioSystems Ltd和德國的R-Biopharm AG公司的食物過敏原花生檢驗試劑盒已通過美國分析化學家協(xié) 會(AOAC)的認可，并被美國美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于食品檢驗。但是，目 前的食品過敏原試劑盒并沒有涵蓋所有的食品過敏原，而且有些食品過敏原的檢測試劑盒 存在漏檢等缺陷；此外，目前的試劑盒檢測通常只針對一種過敏原，但實際上，食品成分復 雜，往往存在多種過敏原，因此非常有必要開發(fā)高通量的檢測產(chǎn)品，實現(xiàn)對多種過敏原的一 次性檢出。目前，無論ELISA方法還是核酸檢測方法，通常只能同時檢測1種過敏原，而在實 際食品檢測中，需要對過敏原進行篩查檢測，即對多種過敏原進行同時檢測?，F(xiàn)在亟待開發(fā) 一種高通量靈敏度、實現(xiàn)出口產(chǎn)品的在線檢測，達到省時、低消耗、經(jīng)濟、快速、有效的食品 過敏原檢測新方法。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種可快速、高通量的基于可視化芯片的樣品中 過敏原的檢測方法。本發(fā)明所提供的一種檢測樣品中過敏原檢測方法，包括(1)制備可視薄膜傳感器芯片，其中在同一個芯片基質(zhì)表面上分別固定對應于多 個過敏原DNA序列的多個特異性探針；
(2)利用對應于多個過敏原DNA序列的多對特異性上游引物和下游引物對檢測樣 品的DNA序列進行多重PCR擴增，其中下游引物的5’端帶有共價結(jié)合的生物素；(3)將步驟O)的PCR擴增產(chǎn)物與可視化芯片上的探針進行雜交，并洗滌；(4)用辣根過氧化酶標記的生物素抗體與芯片進行雜交，并洗脫未雜交的鏈；(5)用辣根過氧化物酶的底物對芯片進行處理和顯色；(6)根據(jù)是否產(chǎn)生可視信號以及產(chǎn)生的可視信號對應的探針位置，確定檢測樣品 中是否含有過敏原以及含有過敏原的種類。優(yōu)選的，本發(fā)明所述步驟(1)中的可視薄膜傳感器芯片的基質(zhì)表面上還固定有陽 性對照序列，所述陽性對照序列的3’端帶有共價結(jié)合的生物素，該序列一方面可以作為實 驗的陽性對照，同時還可用作探針陣列的定位點，用于協(xié)助確定探針陣列雜交點的位置。所 述陽性對照序列可以例如為 SEQ ID NO :25，即 5，-ALD_aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa_3，-Biotin (ALD指醛基修飾；biotin為生物素修飾)。優(yōu)選的，本發(fā)明的所述步驟(1)中，在同一個芯片基質(zhì)表面上所固定的對應于每 個過敏原DNA序列的特異性探針至少有兩個。由于每個過敏原DNA序列的特異性探針至少 固定有兩個，由此檢測樣品時，結(jié)果可以互相印證，進一步保證檢測的可靠性。優(yōu)選的，所述步驟(1)具體包含如下步驟用點樣儀將多個特異性探針點到同一 個芯片基質(zhì)表面上，然后在濕度為70%的環(huán)境下放置2小時使探針固定在芯片表面，接著 用濃度為0.1% (w/v)的SDS清洗芯片，再用滅菌水清洗芯片，最后干燥，并于4°C下保存。優(yōu)選的，所述步驟⑵中，多重PCR擴增的反應程序為95°C預變性15min、94°C變 性30s、溫度58°C退火30s、72°C延伸20s后，再重復上述預變性、變性、退火、延伸步驟，進行 35個循環(huán)；循環(huán)完成后在72°C進行5min充分延伸，最后在4°C下保存。優(yōu)選的，所述步驟C3)具體包含如下步驟將2μ L PCR擴增產(chǎn)物用滅菌水稀釋至 10 μ L，95°C變性5min后，立即冰浴3min，再取10 μ L的冰浴后的PCR擴增產(chǎn)物溶液用雜交 緩沖液(5 X SSC和5mg/ml酸處理酪素)稀釋至100 μ L，并滴加到芯片上，45°C水浴lOmin， 再用200 μ L 0. IX SSC沖洗并吹干。優(yōu)選的，所述步驟⑷具體包含如下步驟將芯片用100 μ L辣根過氧化酶標記的 生物素抗體溶液進行處理5min，用200 μ L 0. 1 X SSC溶液沖洗并吹干。優(yōu)選的，所述步驟( 具體包含如下步驟用100 μ L辣根過氧化物酶的底物溶液 處理芯片，室溫避光放置5min后，用無菌水洗凈吹干。所述步驟(6)中，檢測結(jié)果用肉眼即可進行分析，也可以進行照相保存。優(yōu)選的，所述辣根過氧化物酶的底物為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。本發(fā)明還提供了一種供檢測樣品中過敏原的可視薄膜傳感器芯片，其中在同一個 芯片基質(zhì)表面上分別固定對應于多個過敏原DNA序列的多個特異性探針。無論是在本發(fā)明所提供的過敏原檢測方法中，還是在本發(fā)明所提供的可視薄膜傳 感器芯片中，優(yōu)選的，所述多個過敏原選自于小麥、花生、大豆、腰果、牛奶、雞蛋、魚和甲殼 類中的多種。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，所述多個過敏原為大豆、花生、小麥、腰果。此 時，所使用的分別對應于大豆、花生、小麥、腰果過敏原DNA序列的多個特異性探針可以分 別為SEQ ID NO :3、6、9、12，對應于大豆、花生、小麥、腰果過敏原DNA序列的特異性上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO :1-2、4-5、7-8、10-11。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實施方式
，所述多個過敏原為雞蛋、牛奶、魚和蝦。此時， 所使用的分別對應于雞蛋、牛奶、魚和蝦過敏原DNA序列的多個特異性探針可以分別為SEQ ID NO :15、18、21、24，對應于雞蛋、牛奶、魚和蝦過敏原DNA序列的特異性上游引物和下游 引物分別為 SEQ ID NO :13-14、16-17、19-20、22-23。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實施方式
，所述多個過敏原為大豆、花生、小麥、腰果、雞 蛋、牛奶、魚和蝦，由于芯片上固定了幾乎全部的常見過敏原，可滿足全部食品的常見過敏 原的檢測。此時，對應于該8種過敏原DNA序列的8種特異性探針為SEQ ID NO :3、6、9、 12、15、18、21、對；利用對應于所述8種過敏原0嫩序列的8對特異性上游引物和下游引物 SEQ ID NO 1-2、4-5、7-8、10-11、13-14、16-17,19-20,22-23 對檢測樣品的 DNA 序列進行多 重PCR擴增?？梢曅酒鳛橐环N新型基因芯片技術(shù)，可將特定的分子結(jié)合轉(zhuǎn)變成肉眼觀察到的 信號，使結(jié)果分析的過程形象化。可視芯片的基質(zhì)是表面經(jīng)過特殊處理的硅片。使用時首 先將探針固定在芯片表面，然后使用經(jīng)過生物素標記的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物與芯 片上的探針進行特定雜交。接著用辣根過氧化酶抗體處理，洗去未雜交的鏈，并用四甲基聯(lián) 苯胺(TMB)處理。這時結(jié)合了生物素標記的雜交DNA鏈就會在辣根過氧化酶抗體和TMB的 作用下產(chǎn)生沉淀改變芯片的厚度，從而產(chǎn)生肉眼可辨的信號。可視芯片既具有基因芯片快 速、準確、高效、高通量的特點，又可脫離昂貴的基因芯片實驗設備的限制，有利于食物過敏 原的快速檢測檢驗。目前在過敏原檢測領(lǐng)域，傳統(tǒng)的免疫學法和核酸擴增法由于其本身的缺陷，限制 了其應用。而使用可視蛋白芯片，則由于芯片制作系統(tǒng)昂貴、檢測操作復雜、費時、專業(yè)性強 等缺陷，也限制了其在產(chǎn)業(yè)上的大規(guī)模應用?，F(xiàn)實生活中，一種食品中通常不可能只含有一 種過敏原。利用傳統(tǒng)的方法，需要對每一種過敏原分別進行檢測，浪費時間，成本也高。而 本發(fā)明的方法，利用多重PCR技術(shù)，針對多個過敏原采用特異性的引物對和特異性的探針， 可同時檢測出同一食品中的多個過敏原，方法簡便快速，節(jié)省時間，降低了成本。本發(fā)明所 提供的可視薄膜傳感器芯片中固定有針對多種過敏原的探針，所述多種過敏原囊括了常見 的八種過敏原，使用該芯片可以很方便的使用本發(fā)明的方法對檢測樣品進行檢測?；诳梢暠∧じ惺芷餍酒枚嘀豍CR擴增技術(shù)對過敏原樣品進行檢測時，由于 需保證特異性，通常針對過敏原的特異性引物對和特異性探針難于選擇，這也是現(xiàn)有技術(shù) 中未見其在過敏原檢測領(lǐng)域應用的一個重要原因。同時，由于多重PCR反應體系中，包含多 對引物對，不同的引物對之間容易發(fā)生競爭性擴增，嚴重影響反應結(jié)果；各個引物必須高度 特異性，以避免出現(xiàn)非特異性擴增；此外，不同引物對所要求的PCR擴增條件也不相同。因 此針對特定過敏原設計的4重或多于4重PCR反應的引物對以及探針更是難于選擇。然而 本申請卻解決了上述問題。本申請的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)采用本申請中所選擇的8對引物和 探針非常適合本申請的過敏原檢測技術(shù)，引物對相互之間具有高度特異性，反應結(jié)果也準 確高效，從而克服了基于可視薄膜感受器芯片利用多重PCR擴增技術(shù)進行過敏原樣品檢測 的技術(shù)難題。


下面結(jié)合附圖，進一步說明本發(fā)明技術(shù)方案的具體實施方式
。圖1所示為芯片點樣伩點樣排列示意圖；其中，M表示陽性對照；1表示腰果探針； 2表示花生探針；3表示小麥探針；4表示大豆探針；5表示雞蛋探針；6表示魚探針；7表示 蝦探針；8表示牛奶探針。圖2所示為利用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測樣品中過敏原的結(jié)果圖其中，11為空白 對照檢測結(jié)果圖；12為腰果樣品檢測結(jié)果圖；13為花生樣品檢測結(jié)果圖；14為小麥樣品檢 測結(jié)果圖；15為大豆樣品檢測結(jié)果圖；16為改為雞蛋樣品檢測結(jié)果圖；17為魚樣品檢測結(jié) 果圖；18為蝦樣品檢測結(jié)果圖；19為牛奶樣品檢測結(jié)果圖。圖3所示為利用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測混合樣品中過敏原的結(jié)果圖其中，21為 空白對照(ddH20)檢測結(jié)果圖；22為腰果DNA檢測結(jié)果圖；23為蝦DNA檢測結(jié)果圖；24為 牛奶和蝦混合DNA檢測結(jié)果圖；25為牛奶、蝦和魚混合DNA檢測結(jié)果圖；26為牛奶、蝦、魚和 雞蛋混合DNA檢測結(jié)果圖；27為大豆和腰果混合DNA檢測結(jié)果圖；觀為大豆、腰果和小麥混 合DNA檢測結(jié)果圖；29為大豆、腰果、小麥和花生混合DNA檢測結(jié)果圖。圖4所示為利用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測實際樣品的結(jié)果圖其中，31為雅娜白巧 克力草莓燕麥條(法國)樣品的檢測結(jié)果圖；32為奧里恩香酥巧克力(韓國)樣品的檢 測結(jié)果圖；33為公雞直條形意大利面(西班牙)樣品的檢測結(jié)果圖；34為瑞士三角黑巧克 力(瑞士)樣品的檢測結(jié)果圖；35為豆豉鯪魚(中國)樣品的檢測結(jié)果圖；36為空白對照 (ddH20)檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式針對食品中常見的8類過敏原小麥、花生、大豆、腰果、牛奶、雞蛋、魚和甲殼類， 依據(jù)大豆Lectin基因、小麥Gliadin基因、花生Arah 3基因、腰果Anao3基因、魚和蝦16S rRNA、牛和雞線粒體DNA設計特異性引物序列和探針。引物和探針序列參見表1。表1利用特異性序列設計的引物和探針
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中多個過敏原的檢測方法，包括(1)制備可視薄膜傳感器芯片，其中在同一個芯片基質(zhì)表面上分別固定對應于多個過 敏原DNA序列的多個特異性探針；(2)利用對應于多個過敏原DNA序列的多對特異性上游引物和下游引物對檢測樣品的 DNA序列進行多重PCR擴增，其中下游引物的5’端帶有共價結(jié)合的生物素；(3)將步驟O)的PCR擴增產(chǎn)物與可視化芯片上的探針進行雜交，并洗滌；(4)用辣根過氧化酶標記的生物素抗體與芯片進行雜交，并洗脫未雜交的鏈；(5)用辣根過氧化物酶的底物對芯片進行處理和顯色；(6)根據(jù)是否產(chǎn)生可視信號以及產(chǎn)生的可視信號對應的探針位置，確定檢測樣品中是 否含有過敏原以及含有過敏原的種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中的可視薄膜傳感器 芯片的基質(zhì)表面上還固定有陽性對照序列，所述陽性對照序列的3’端帶有共價結(jié)合的生物 素；所述陽性對照序列優(yōu)選為SEQ ID NO :25。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，在同一個芯片基質(zhì) 表面上所固定的對應于每個過敏原DNA序列的特異性探針至少有兩個。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的檢測方法，其特征在于，所述多個過敏原選自于小 麥、花生、大豆、腰果、牛奶、雞蛋、魚和甲殼類中的多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的檢測方法，其特征在于，所述多個過敏原為大豆、花 生、小麥、腰果，所使用的分別對應于大豆、花生、小麥、腰果過敏原DNA序列的多個特異性 探針分別為SEQ ID NO :3、6、9、12，對應于大豆、花生、小麥、腰果過敏原DNA序列的特異性 上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO :1-2,4-5,7-8,10-11 ；雞蛋、牛奶、魚和蝦，所使用 的分別對應于雞蛋、牛奶、魚和蝦過敏原DNA序列的多個特異性探針分別為SEQ ID NO :15、 18、21、24，分別對應于雞蛋、牛奶、魚和蝦過敏原DNA序列的特異性上游引物和下游引物分 別為SEQ ID NO :13-14、16-17、19-20、22-23 ；或者大豆、花生、小麥、腰果、雞蛋、牛奶、魚和 蝦，分別對應于該8種過敏原DNA序列的8種特異性探針為=SEQ ID NO :3、6、9、12、15、18、 21、24，利用對應于所述8種過敏原DNA序列的8對特異性上游引物和下游引物SEQ ID NO 1-2、4-5、7-8、10-11、13-14、16-17、19-20、22-23 對檢測樣品的 DNA 序列進行多重 PCR 擴增。
6.一種用于檢測樣品中過敏原的可視薄膜傳感器芯片，其中在同一個芯片基質(zhì)表面上 分別固定對應于多個過敏原DNA序列的多個特異性探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的可視薄膜傳感器芯片，其特征在于，所述可視薄膜傳感器芯 片的基質(zhì)表面上還固定有陽性對照序列，所述陽性對照序列的3’端帶有共價結(jié)合的生物 ο
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的可視薄膜傳感器芯片，其特征在于，在同一個芯片基質(zhì)表面 上所固定的對應于每個過敏原DNA序列的特異性探針至少有兩個。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的可視薄膜傳感器芯片，其特征在于，所述多個過敏 原選自于小麥、花生、大豆、腰果、牛奶、雞蛋、魚和甲殼類中的多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的可視薄膜傳感器芯片，其特征在于，所述多個過敏 原為大豆、花生、小麥、腰果，所使用的分別對應于大豆、花生、小麥、腰果過敏原DNA序列的 多個特異性探針分別為SEQ ID N0:3、6、9、12;雞蛋、牛奶、魚和蝦，所使用的分別對應于雞蛋、牛奶、魚和蝦過敏原DNA序列的多個特異性探針分別為SEQ ID NO :15、18、21、M ；或者 大豆、花生、小麥、腰果、雞蛋、牛奶、魚和蝦，分別對應于該8種過敏原DNA序列的8種特異 性探針為:SEQ ID NO :3、6、9、12、15、18、21、24。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測樣品中多個過敏原的方法，包括制備可視薄膜傳感器芯片，其中在同一個芯片基質(zhì)表面上分別固定對應于多個過敏原DNA序列的多個特異性探針；利用對應于多個過敏原DNA序列的多對特異性上游引物和下游引物對檢測樣品的DNA序列進行多重PCR擴增，其中下游引物的5’端帶有共價結(jié)合的生物素；將步驟(2)的PCR擴增產(chǎn)物與可視化芯片上的探針進行雜交，并洗滌；用辣根過氧化酶標記的生物素抗體與芯片進行雜交，并洗脫未雜交的鏈；用辣根過氧化物酶的底物對芯片進行處理和顯色；根據(jù)是否產(chǎn)生可視信號以及產(chǎn)生的可視信號對應的探針位置，確定檢測樣品中是否含有過敏原以及含有過敏原的種類。本發(fā)明的方法能快速、高通量且能同時檢測樣品中是否存在多種過敏原。
文檔編號C12Q1/68GK102108404SQ20101058839
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者吳亞君, 楊海榮, 王瑋, 袁飛, 陳穎 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院