專利名稱：傳染性支氣管炎病毒h120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其操作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其操作方法。
背景技術：
傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis, IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一種急性高度接觸性傳染病。該病毒可感染所有日齡的雞，導致生長遲緩、死亡和飼料報酬降低；還常常因霉形體混合感染以及大腸桿菌病等繼發(fā)感染而提高雞群的死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失。目前， 該病呈世界廣泛流行，是嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一。IBV的基因組為單股正鏈RNA，長約27. 6kb，具有典型的5'帽子和3' Poly A尾巴結構，至少有10個明顯的開放閱讀框(ORF)，分別編碼病毒的結構蛋白和非結構蛋白。其中S蛋白構成了 IBV的最表層纖狀突起，是最重要的保護性抗原，其作用表現(xiàn)為刺激機體產生中和抗體，在病毒吸附細胞過程中發(fā)揮作用，因此決定病毒的組織嗜性，但并不是IBV毒力的唯一決定性因素。N蛋白是IBV病毒內部核衣殼的組成蛋白，在病毒復制、組裝中有作用，蛋白的磷酸化對其功能的發(fā)揮具有重要作用。3a、3b、fe*恥均為病毒編碼的非結構蛋白，在IBV感染細胞內均可檢測到，但其功能目前還不清楚。最近發(fā)現(xiàn)3a、3b、fe*^編碼區(qū)的缺失不影響IBV病毒的復制和病毒的致病性。IBV RNA基因組因具有獨特的先導引物轉錄機制，具有很高的錯配率。在免疫接種程序、家禽密度等因素的影響下，IBV正以不同的速度和不同的進化方向發(fā)生變異。目前世界上已分離的主要流行株有M41株、Corm株、澳大利亞T株、Hotle株、Gray株等，不同毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異。疫苗接種是預防IB的重要手段，相繼研制出常規(guī)的IB活苗和滅活苗，其中雞胚適應毒H120和H52弱毒苗已被世界各國廣泛應用。 由于不同血清型IBV毒株之間交叉保護力弱，這給IB的免疫預防帶來了很大的困難。常規(guī)單一毒株疫苗常有免疫失敗的報道，弱毒疫苗還存在重組、毒力返強等問題。針對IBV新的流行情況研制有效的新疫苗迫在眉睫。反向遺傳操作技術(reverse genetics)，即病毒的全長感染性cDNA克隆技術，包括病毒基因組全長cDNA克隆構建技術和由cDNA轉錄病毒RNA的感染性轉錄本制備技術， 能在病毒DNA水平上對其進行人工操作，解決了 RNA病毒基因組難以操作的難題，從而為 RNA病毒的基因復制與表達調控機理研究、新疫苗的研制等提供了強有力的手段。IB病毒的基因組是目前已知RNA病毒中最大的一類病毒，其反向遺傳操作技術難度較大。本研究建立了傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為該病新型疫苗的研制奠定了堅實的基礎
發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含1)構建RNA病毒的全長cDNA分子，該全長cDNA分子其5，端具有完整的T7 RNA 聚合酶啟動子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結構；2)輔助cDNA，輔助cDNA編碼所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的核蛋白(N) 的cDNA序列，其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶啟動子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結構。3)轉染細胞。全長cDNA分子中基因組的第738位的堿基從C突變?yōu)門。全長cDNA分子中基因組的第17243位的堿基從G突變?yōu)門。構建全長cDNA分子的多個重組質粒中的cDNA序列兩端具有限制性內切酶識別位點，以實現(xiàn)片段間的定向克隆，用于構建所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的全長cDNA 分子。所述的限制性內切酶是Bsa I。全長cDNA分子中將fe基因替換成綠色熒光基因。所述的傳染性支氣管炎病毒為H120疫苗株。其中所述的轉染細胞是BHK-21。一種反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，按以下步驟進行1)將所述多個重組質粒酶切后連接成全長cDNA分子；2)將全長cDNA和所述輔助cDNA在體外轉錄成RNA后，共轉染病毒復制許可的宿主細胞；3)收獲宿主細胞及上清液，接種雞胚尿囊腔救獲病毒。所述1)步驟中先以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉錄成cDNA ；然后對所述cDNA進行PCR擴增，擴增過程中病毒基因組17243位的堿基突變；擴增后連接到 PMD19-T載體后進行篩選，篩選后進行病毒基因組738位的堿基突變；接著接種LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后按照方法回收目的片段；最后各目的片段通過酶切位點連接成全長cDNA分子。所述2、步驟中以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉錄成cDNA，然后進行 N蛋白基因PCR擴增，接著進行Hind III和Bio I雙酶切；同時pVAXl載體同樣進行Hind III和》ιο I雙酶切；接著將兩者連接獲得重組質粒pVAXN ；最后以篩選的pVAXN為模板， PCR擴增后回收含N基因的輔助cDNA。構建全長cDNA分子過程中將fe基因替換成綠色熒光基因。1)步驟中將H120株基因組根據(jù)IIs型限制性內切酶Bsa I的分布情況分成10段進行擴增，然后將按照權利要求10中的方法獲得目的片段TM1、TM2、……、TM10，最后按照摩爾濃度1 1將TM2禾口 TM3、TM4禾口 TM5、TM6禾口 TM7、TM8禾口 TM9混合進行連接，獲得中間產物 TM2-3、TM4-5、TM6-7、TM8-9，然后將 TM1、TM2-3、TM4-5，TM6-7、TM8-9、TMlO 分別按照摩爾濃度1 1 1的比例混合連接，獲取中間產物TM1-5、TM6-10，最后將TM1-5、TM6-10 按照摩爾濃度1 1比例混合連接得到全長cDNA分子。


圖1 H120病毒株全基因組分段擴增的策略。根據(jù)IIs型限制性內切酶Bsa I的分布情況，分TMla、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9和TMlO等10個片段對全基因組進行分段擴增。圖2 H120病毒株全基因組RT-PCR分段擴增結果。RT-PCR獲得10個DNA片段TMla、 TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9 禾口 TM10，片段的大小與理論值一致，分另Ij為 0. 9kb、 3. 7kb、2. 9kb、2. 6kb、3. 7kb、3. 7kb、3. 6kb、3. 2kb、3. Ikb、0. 9kb。其中 M 為 DL5000 Marker。圖3 H120病毒株全基因組cDNA分段拼接的策略。其中圖片頂端的字母代表堿基， 是片段間用來連接的末端互補序列；根據(jù)DNA片段的摩爾濃度，按照1 1的比例將TM2和 TM3、TM4和TM5、TM6和TM7、TM8和TM9混合，利用各個片段間的酶切位點進行連接，獲取中間產物 TM2-3, TM4-5, TM6-7, TM8-9 ；再次Mf TMU TM2-3 禾Π ΤΜ4-5，ΤΜ6-7, ΤΜ8-9 禾Π TMlO 按照1 1 1的比例混合后連接，獲取中間產物ΤΜ1-5、ΤΜ6-10 ；最后將ΤΜ1-5、ΤΜ6-10按照 1 1的比例混合后連接，獲取傳染性支氣管炎病毒Η120株基因組全長CDNA，其5’端具有完整的Τ7 RNA聚合酶啟動子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結構。圖4獲取fe基因替換成綠色熒光基因的H120株全基因組cDNA的示意圖。采用高保真PCR擴增綠色熒光基因(EGFP)，用其替換pMDTM9質粒中的fe基因，再通過體外拼接獲取fe基因替換成綠色熒光基因的傳染性支氣管炎病毒H120株基因組全長cDNA，其5’ 端具有完整的T7 RNA聚合酶啟動子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結構。圖5拯救病毒H120-R的測序鑒定結果。測序結果表明H120-R株基因組第738位的堿基為T，而非其親本H120株的C，和設定的遺傳標記結果相符，突變消除了該處的Bsa I 限制性內切酶識別位點；測序結果表明H120-R株基因組第17243位的堿基為T，而非其親本H120毒株的G，和設定的遺傳標記結果相符，該處的突變引入了一個Bsa I限制性內切酶識別位點。圖6拯救病毒H120_5a/EGFP感染雞胚的熒光檢測結果。取H120_5a/EGFP種毒接種雞胚的咽喉部位粘液、絨毛尿囊膜、羊膜和腸系膜等組織，在熒光倒置顯微鏡下經(jīng)藍光激發(fā)后，均能在大量的細胞內檢測到綠色的熒光，表明H120-fe/EGFP重組病毒能夠在被感染的雞胚中表達綠色熒光蛋白。圖7拯救病毒H120-R、H120-5a/EGFP的致雞胚矮小化試驗。結果表明H120-R和 H120-5a/EGFP感染雞胚后均能引起雞胚死亡，出現(xiàn)特征性變化羊膜增厚，緊貼胚體，雞胚發(fā)育受阻，胚體比同日齡正常雞胚矮小，蜷曲，與其親本毒株H120對雞胚的致病性相同。圖8拯救病毒H120-R、H120_fe/EGFP在雞胚中生長曲線的測定。采用熒光定量 RT-PCR測定H120-R、H120-fe/EGFP及其親本毒株H120感染雞胚后不同時間段的病毒滴度， 結果表明H120-R及其親本毒株H120的病毒滴度在接種雞胚3 后達到最高峰，然后逐漸下降；而H120-fe/EGFP的病毒滴度在接種雞胚4 后達到最高峰。
具體實施例方式以下實施例詳細描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權利要求具體限定。1構建傳染性支氣管炎病毒H120株的全長基因組cDNA
IB病毒的基因組大小在27. 6kb左右，不同分離株在長度上略有差異。根據(jù)傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株基因組全序列(GenBank登錄號FJ80765》上IIs型限制性內切酶 BsaI 的分布情況，分 TMla, TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9 禾口 TMlO 等 10 個片段對全基因組進行分段擴增(圖1)。設計覆蓋該病毒全基因組的10對引物，引物序列及其在基因組中的位置(見表1)在TMla擴增片段的上游引物TMlS中引入T7 RNA聚合酶啟動子的核心序列，以保證完成全長cDNA拼接后能在體外轉錄產生病毒基因組RNA ；引物 MU1S、MUlA將H120株病毒基因組第738位的堿基C突變?yōu)門，消除了該處的Bsa I限制性內切酶識別位點(GGTCTC — GGTCTT)，突變前密碼子CTC與突變后密碼子CTT均編碼Leu， 為同義突變，能夠作為拯救病毒的遺傳標記，將突變后的DNA片段命名為TMl ；在引物TM6A、 TM7S中引入點突變，擴增后將H120株病毒基因組第17243位的堿基G突變?yōu)門，突變前密碼子GGG與突變后密碼子GGT均編碼Gly，為同義突變，獲得的序列GGTCTC為Bsa I限制性內切酶識別序列，能夠用于全長cDNA的構建，也能作為拯救病毒的遺傳標記；在引物TM1S、 TM4A、TM5S、TM5A、TM6S、TM8A、TM9S和TMlOA的5，端分別引入Bsa I限制性內切酶識別序列，以保證后續(xù)全長cDNA的拼接；在下游引物TMlOA中引入25個堿基T，以保證在TMlO片段3’端具有polyA尾巴結構。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。表1 Hl20基因組全長cDNA擴增引物
引物名稱引物位置引物序列(5’-3’ )TMlS1-19GAGhCCTAATACGACTCACTATAGGGACTYKMQKiAaATATTAATTMlA898-919CACGAGCATCCAGTGTTTCTACMUlS751-772GGAGTTGACAAAATAACACCTGMUlA725-750CTTCAATAGGAAAAGACCACAAACAGTM2S875-896CAGCATGCCAGTGGTCTCTTACTM2A4382-4403GCTACAAAATCAGTTGGGTCTCTM3S4367-4386CACAACTTTTGGGTGGAGACTM3A7261-7280CCACTAATGACACCACCAGCTM4S7165-7186GCAACTGTCAAGTCAGGGTCTCTM4A9743-9758GGTCTCCAGGATGTGGCTCTTCTM5S9753-9767GGTCTCATCCTGGTTTTGGAGTM5A13480-13495GGTCTCCCAGACGCTAATGCACTM6S13490-13506GGTCTCGTCTGGTATTACTCATC
權利要求
1.一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)包括1)構建RNA病毒的全長cDNA分子，該全長cDNA分子其5，端具有完整的T7RNA聚合酶啟動子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結構；2)輔助cDNA，輔助cDNA編碼所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的核蛋白(N)的 cDNA序列，其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶啟動子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結構；3)轉染細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，全長cDNA分子中基因組第738位的堿基從C突變?yōu)門。
3.根據(jù)權利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，全長cDNA分子中基因組第17243位的堿基從G突變?yōu)門。
4.根據(jù)權利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，構建全長cDNA分子的多個重組質粒中的cDNA序列兩端具有限制性內切酶識別位點，以實現(xiàn)片段間的定向克隆，用于構建所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的全長cDNA 分子。
5.根據(jù)權利要求4所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，所述的限制性內切酶是Bsa I。
6.根據(jù)權利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，全長cDNA分子中的fe基因替換成綠色熒光基因。
7.根據(jù)權利要求1-6中任何一項的反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，其中所述的傳染性支氣管炎病毒為H120疫苗株。
8.根據(jù)權利要求1-6中任何一項的反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，其中所述的轉染細胞是BHK-21。
9.一種利用上述任一項權利要求的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，按以下步驟進行1)將所述多個重組質粒酶切后連接成全長cDNA分子；2)將全長cDNA和所述輔助cDNA在體外轉錄成RNA后，共轉染病毒復制許可的宿主細胞；3)收獲宿主細胞及上清液，接種雞胚尿囊腔救獲病毒。
10.根據(jù)權利要求9的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，所述1)步驟中先以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉錄成cDNA ；然后對所述 cDNA進行PCR擴增，擴增過程中基因組17243位的堿基突變；擴增后連接到pMD19_T載體后進行篩選，篩選后進行病毒基因組第738位的堿基突變；接著接種LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后按照方法回收目的片段；最后各目的片段通過酶切位點連接成全長cDNA分子。
11.根據(jù)權利要求9的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，所述2)步驟中以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉錄成cDNA，然后進行N蛋白基因PCR擴增，接著進行Hind III和Β ο I雙酶切；同時pVAXl載體同樣進行Hind III和 Xho I雙酶切；接著將兩者連接獲得重組質粒pVAXN ；最后以篩選的pVAXN為模板，PCR擴增后回收含N基因的輔助cDNA。
12.根據(jù)權利要求10的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，構建全長cDNA分子過程中將fe基因替換成綠色熒光基因。
13.根據(jù)權利要求10所述的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，將H120株基因組根據(jù)IIs型限制性內切酶BsaI的分布情況分成10段進行PCR擴增，然后將按照權利要求10中的方法獲得目的片段TM1、TM2、……、TM10，最后按照摩爾濃度1 Mf TM2禾Π ΤΜ3、ΤΜ4禾Π ΤΜ5、ΤΜ6禾Π ΤΜ7、ΤΜ8禾Π ΤΜ9 t昆合進 亍連接，獲得中間產物 ΤΜ2-3、ΤΜ4-5、ΤΜ6-7、ΤΜ8-9，然后將 ΤΜ1、ΤΜ2-3、ΤΜ4-5，ΤΜ6-7、ΤΜ8-9、TMlO 分別按照摩爾濃度1 1 1的比例混合連接，獲取中間產物ΤΜ1-5、ΤΜ6-10，最后將ΤΜ1-5、ΤΜ6-10按照摩爾濃度1 1比例混合連接得到全長cDNA分子。
14.根據(jù)權利要求13所述的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，構建全長cDNA分子過程中將fe基因替換成綠色熒光基因，其余按照權利要求14 的方法獲得全長cDNA分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)及其操作方法，該系統(tǒng)包含用于構建所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株基因組全長cDNA的多個重組質粒，及其輔助cDNA，其中所述輔助cDNA編碼傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株核蛋白(N)。通過上述反向遺傳操作系統(tǒng)，成功拯救獲得了基因突變或基因置換的H120病毒株。本發(fā)明為進一步開展傳染性支氣管炎病毒分子病毒學研究奠定了堅實的基礎。本發(fā)明還涉及由所述反向遺傳操作系統(tǒng)產生和衍生的在疾病診斷、疫苗研制上的應用。
文檔編號C12N15/09GK102382812SQ201010588470
公開日2012年3月21日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權日2010年12月15日
發(fā)明者劉梅, 周生, 唐夢君, 尤素蘭, 戴亞斌, 戴有理, 沈欣悅, 程旭, 許玲霞, 趙寶華 申請人:周生, 唐夢君, 江蘇省家禽科學研究所