專利名稱：用于檢測口腔炎癥指數(shù)的方法和試劑、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療檢查領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及檢測口腔炎癥指數(shù)的方法、該方法所涉及的試劑和試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥是一種應(yīng)對感染、損傷或各種有害狀況的重要免疫反應(yīng)。炎癥過程對機(jī)體來說是很重要的，因?yàn)樗?wù)于修復(fù)損傷、殺傷病原微生物和腫瘤的過程中。然而，持久的炎癥是有害的，因?yàn)檠装Y細(xì)胞釋放有毒分子和損害正常細(xì)胞和組織的酶。非解決性炎癥是疾病的一種主要驅(qū)動力，它明顯地推動著多種疾病的病變過程， 所述疾病包括動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖、癌癥、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、炎癥性腸道疾病、神經(jīng)退行性疾病、多發(fā)性硬化癥、或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病。檢測炎癥過程對醫(yī)生來說是非常重要的，因?yàn)樗某霈F(xiàn)意味著重大疾病、傷害或有害狀況的存在。往往帶有嚴(yán)重炎癥特征的疾病例子有心肌梗死、活動性結(jié)核、骨髓炎 (骨感染)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、cholecytistiM感染膽)、和腎盂腎炎(腎感染)和癌癥擴(kuò)散?；加忻黠@炎癥的病人往往會表現(xiàn)出眾所周知的炎癥跡象和癥狀，如發(fā)燒、乏力和食欲不振。然而，這些癥狀和體征既不敏感、也不特異地顯示炎癥的存在。有些疾病和身體狀況會在更具體的、可診斷的病癥出現(xiàn)之前，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。因此，檢測炎癥癥狀的出現(xiàn)，將有利于更及時(shí)地診斷和治療這些疾病和不適。目前最有名和最廣泛使用的血液炎癥檢測指標(biāo)是紅細(xì)胞沉降率或ESR。ESR由 Fahraeus發(fā)現(xiàn)，Wintrobe和^festergren進(jìn)行了改善和推廣，所形成的魏氏血沉率或WESR， 有感于炎癥蛋白的總體升高，測量紅細(xì)胞在60分鐘內(nèi)沉降的距離。醫(yī)生們曾試圖開發(fā)其他更容易或更快、或者更敏感或具體的炎癥檢測方法。這些檢測包括C反應(yīng)蛋白或CRP，白細(xì)胞計(jì)數(shù)，orosomucoid蛋白，紅細(xì)胞或血紅蛋白和纖維蛋白原(參照美國專利號5137832，美國專利號4843869，美國專利號5506145)。然而，對于口腔而言，口腔是與血液分隔開來的環(huán)境，血液中的炎癥水平并不能反映在口腔炎癥的狀況。因此，目前的血液炎癥檢測方法不能用于為在口腔炎癥的診斷?？谇皇沁M(jìn)入人體內(nèi)的通道，許多事件在此發(fā)生?？谇唤邮苁澄铮⒐腆w的食物顆粒變小，與唾液混合，啟動消化過程?？谇徽衬ひ约巴僖合袤w分泌提供潤滑液，幫助言語表達(dá)、吞咽和食物消化。因此，口腔特別容易發(fā)生感染、損傷或各種有害狀況。此外，口腔內(nèi)有一套特有的發(fā)生在口腔內(nèi)的疾病和不適，包括齲齒、牙周疾病、口腔潰瘍等。有些情況如不良嗅覺、口臭、甚至打鼾也可能與口腔健康有關(guān)。由不同原因所致的炎癥反應(yīng)可能同時(shí)出現(xiàn)在口中。不同事件之間可能相互影響，因?yàn)椴煌瑏碓吹难装Y因子可能會在一個(gè)相對局部共享的環(huán)境中形成一個(gè)相互影響的水平。這應(yīng)該有別于體內(nèi)血液環(huán)境。因此，目前迫切需要檢測口腔炎癥水平的方法或輔助檢測口腔炎癥水平的方法及其相關(guān)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供涉及這一領(lǐng)域的輔助檢測方法及相關(guān)產(chǎn)品。為有助于理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。除非另外說明，本文所用的術(shù)語“ 口腔炎癥指數(shù)”是指在口腔內(nèi)所發(fā)生的炎癥程度的量化指標(biāo)。在此申請中，所述“口腔炎癥指數(shù)”具體由口腔內(nèi)可收集到的嗜中性白血球細(xì)胞的量的相對水平代表，其可以用于輔助判斷所述哺乳動物口腔炎癥的存在與否、嚴(yán)重程度和/或改善情況。除非另外說明，本文所用的術(shù)語“個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)”由檢測對象口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度的增長倍數(shù)表示，該指數(shù)的計(jì)算公式如下Ii = nt/nh其中的Ii為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)；nt為從檢測對象中獲取的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度；nh為該檢測對象在無炎癥的健康情況下所獲取的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度。除非另外說明，本文所用的術(shù)語“比較性口腔炎癥指數(shù)”由檢測對象的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度，相對于無炎癥的健康參照者的增長倍數(shù)。該指數(shù)的計(jì)算公式如下Ic = nt/nr其中的I。為比較性口腔炎癥指數(shù)；nt為從檢測對象中獲取的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度；！^為無炎癥的健康參照者的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，無炎癥的健康參照者的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目OO設(shè)定為10，000。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測口腔炎癥指數(shù)和 /或釋放口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的溶液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測口腔炎癥指數(shù)和/或檢測口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)量的試劑盒。本發(fā)明又一個(gè)目的是上述溶液和試劑盒在制備檢測口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)量的產(chǎn)品中的用途。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供檢測哺乳動物口腔內(nèi)口腔炎癥指數(shù)的方法。本發(fā)明還一個(gè)目的是提供一種輔助檢測哺乳動物口腔炎癥治療情況的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于釋放口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的溶液，其特征在于， 所述溶液包括用于釋放口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的鹽離子和酸離子；優(yōu)選地，所述鹽離子和酸離子由化合物提供，所述化合物選自氯化鉀，氯化鈉和磷酸鈉的一種或多種；所述溶液可進(jìn)一步包含用于提供細(xì)胞所需能量的化合物；優(yōu)選地，提供所述細(xì)胞所需能量的化合物為D_葡萄糖。所述溶液可進(jìn)一步包含用于調(diào)節(jié)該溶液的PH值和緩沖性能的化合物；優(yōu)選地，所CN 102533933 A述化合物選自無水磷酸二氫鉀，磷酸鈉和無水磷酸氫二銨的一種或多種。此外，所述溶液還可進(jìn)一步包含用于著色的化合物；優(yōu)選地，所述化合物為酚紅鈉。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述溶液中包含0. 01-10. 00克/L氯化鉀，0. 01-10. 00克/L無水磷酸二氫鉀，0. 01-10. 00克/L氯化鈉，，0. 01-10. 00克/L無水二元磷酸鈉，0. 01-10. 00克 /LD-葡萄糖和0. 01-0. 02克/L酚紅鈉；更優(yōu)選地，所述溶液包括0. 4克/L氯化鉀，0. 06克/L無水磷酸二氫鉀，8. 0克/L 氯化鈉，0. 04788克/L無水二元磷酸鈉，1. 0克/L D-葡萄糖和0. 011克/L酚紅鈉。并且，所述溶液可以為水溶液、酒精溶液或葡萄糖溶液；優(yōu)選地，所述酒精溶液中的酒精濃度為1-70% (V/V)；或優(yōu)選地，所述葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度為0. 1-15% (g/ml)。另一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)量的試劑盒，所述試劑盒包括上述用于釋放口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的溶液。在上述試劑盒中，還可以進(jìn)一步包括用于特異性固定所述嗜中性白血球細(xì)胞的固定劑和/或用于對所述嗜中性白血球細(xì)胞進(jìn)行特異性染色的染色劑；優(yōu)選地，所述固定劑為甲醛，所述染色劑為吖啶橙。此外，所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括檢測嗜中性白血球細(xì)胞的特異成分或產(chǎn)物所需的檢測試劑；優(yōu)先地，所述特異性成分為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，組織蛋白酶G，髓過氧化物酶，乳鐵蛋白和明膠酶的一種或多種；其檢測試劑包括檢測該特異蛋白所需的抗體及其相應(yīng)的檢測試劑；其檢測試劑為酶聯(lián)反應(yīng)所需的試劑。又一方面，本發(fā)明提供上述溶液或上述試劑盒在制備檢測哺乳動物口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)量的產(chǎn)品中的用途；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。再一方面，本發(fā)明提供一種檢測哺乳動物口腔炎癥指數(shù)的方法，所述方法包括檢測包含所述哺乳動物口腔內(nèi)含物的樣本中嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量； 優(yōu)選地，所述口腔炎癥指數(shù)為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)或比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。其中，上述方法優(yōu)選具體包括1)所述哺乳動物用適量溶液漱口，從而獲得包含所述哺乳動物口腔內(nèi)含物的溶液；2)使用固定劑固定經(jīng)步驟1)獲得的溶液中的嗜中性白血球細(xì)胞；3)使用染色劑將經(jīng)步驟2、固定的嗜中性白血球細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)；優(yōu)選地，在步驟2、前，先離心所述包含哺乳動物口腔內(nèi)含物的溶液；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述離心速度為20-100g，時(shí)間為10-30分鐘；更優(yōu)選地，所述離心速度為20g，時(shí)間為 10分鐘。并且，所述步驟1)中的溶液優(yōu)選為上述用于從哺乳動物口腔內(nèi)釋放嗜中性白血球細(xì)胞的溶液；所述步驟2)中的固定劑優(yōu)選為甲醛；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述固定劑為2. 5% (g/ml) 的甲醛水溶液；所述步驟幻中的染色劑優(yōu)選為吖啶橙；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述染色劑為1. 6% (g/ml)的吖啶橙水溶液。此外，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量和被檢測哺乳動物在健康狀態(tài)下口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)?？蛇x地，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量和健康狀態(tài)下的哺乳動物參照者口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述健康狀態(tài)下的哺乳動物參照者口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量為10000。本發(fā)明還提供另外一種檢測哺乳動物口腔炎癥指數(shù)的方法，所述方法包括檢測包含所述哺乳動物口腔內(nèi)含物的樣本中嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量，所述特異成分如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，組織蛋白酶G，髓過氧化物酶，乳鐵蛋白和明膠酶。這些特異蛋白可以采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，使用相應(yīng)的抗體，通過酶聯(lián)反應(yīng)來進(jìn)行檢測。；優(yōu)選地，所述口腔炎癥指數(shù)為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)或比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。此外，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量和被檢測哺乳動物在健康狀態(tài)下口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)?？蛇x地，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量和健康狀態(tài)下的哺乳動物參照者口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的比較性口腔炎癥指數(shù)。還一方面，本發(fā)明提供一種輔助檢測哺乳動物口腔炎癥治療情況的方法，所述方法包括在對哺乳動物口腔炎癥進(jìn)行治療之前和之后，根據(jù)上述任一項(xiàng)方法分別檢測哺乳動物口腔內(nèi)的口腔炎癥指數(shù)，然后比較治療之前和之后的口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述口腔炎癥指數(shù)為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)或比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述首先，本發(fā)明通過下述研究披露了以前未知的發(fā)生并嵌入口腔黏膜組織中的炎癥來源。清除該炎癥來源，可以治愈病人的慢性牙周炎和經(jīng)常性潰瘍。這表明，嵌入黏膜組織的炎癥是與炎癥相關(guān)的口腔疾病的一種誘因。在這一研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明建立了通過檢測哺乳動物口腔內(nèi)口腔炎癥指數(shù)而輔助診斷口腔炎癥的方法。所選擇的參與這項(xiàng)研究的患者45歲，患有15年的牙周炎病，由三個(gè)不同的牙周炎專家診斷確認(rèn)有此病。該患者每三個(gè)月就需要到牙周炎專科進(jìn)行專業(yè)清理。該患者也經(jīng)常遭受口腔潰瘍的困擾(圖1A)。采用一個(gè)Y形的特制清洗工具徹底清潔該患者的口腔，包括清洗粘膜和牙齦組織。該工具的設(shè)計(jì)專門優(yōu)化了清洗能力、并可避免傷害任何有關(guān)組織(圖1B)，被稱之為除炎刷(具體參見中國發(fā)明專利申請CN201010109442. 1)。用除炎刷對口腔黏膜組織進(jìn)行刷擦，然后用水沖洗。發(fā)白的殘?jiān)鼜目谇火つそM織中釋放出來，偶爾會有血跡的出現(xiàn)，但沒有發(fā)生持續(xù)出血現(xiàn)象。
隨后，潰瘍樣點(diǎn)(ulcer-like spot)出現(xiàn)在附近的黏膜牙齦交界處(圖1C)的黏膜組織上。令人驚奇的是，褐色分泌物從潰瘍樣點(diǎn)中釋放出來(圖2A)。該分泌物用Turk’ s 溶液進(jìn)行染色，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行了觀察。很顯然，該分泌物中含有大量的嗜中性白血球(neutrophil)(圖2B)，這些細(xì)胞都含有典型的多形核特征(圖2C)。該樣本由吖啶橙 (Acridine orange)進(jìn)行了染色，在熒光顯微鏡下被證實(shí)含有嗜中性白血球(圖2D)。該褐色分泌物似乎含有一個(gè)具有結(jié)構(gòu)單元的嗜中性白血球聚集群體，這些匯集一起的嗜中性白血球群體被稱之為口炎斑(oral inflammatory plague)。在褐色分泌物中出現(xiàn)的嗜中性白血球是一種炎癥癥狀；嗜中性白血球釋放可以損傷牙齒和組織的分解酶。從一個(gè)潰瘍樣點(diǎn)中可釋放出多于10個(gè)口炎斑，隨后潰瘍樣點(diǎn)被治愈。然后口炎斑將不會再從患過潰瘍樣點(diǎn)的部位中釋放出來?？谘装叽嬖谟跐儤狱c(diǎn)中的時(shí)侯，患者會在該部位有一種熱度和不舒服的感覺。一旦口炎斑被釋放出來，患者就立刻感到一種如釋重負(fù)的感覺。這些都表明口炎斑是一種炎癥反應(yīng)。據(jù)推測，口炎斑嵌入在黏膜組織中(圖3)。支持這一想法的事實(shí)是，需要花時(shí)間和力量將口炎斑從黏膜組織中釋放出來。很多口炎斑可匯集在一起，由于黏膜組織的折疊，口炎斑被嵌入其中，形成一種“結(jié)”狀構(gòu)造，被稱之為“口炎結(jié)”(oral inflammatory knotitis)?？谘捉Y(jié)可導(dǎo)致可見的炎癥癥狀，如上述所說的潰瘍樣點(diǎn)(圖3)。在潰瘍樣點(diǎn)處可見的白色殘?jiān)虺恋砦锟赡苁怯墒戎行园籽蛩碌募?xì)胞死亡而造成的。通過除炎刷清洗的過程，發(fā)現(xiàn)這個(gè)病患者口腔中含有12個(gè)以上的潰瘍樣點(diǎn)。這些潰瘍樣點(diǎn)存在于黏膜牙齦交界處附近、舌頭下邊、腭扁桃體附近，并在臉頰內(nèi)部；這些都是不能輕易被當(dāng)前口腔清潔措施所清理的地方。有些潰瘍樣點(diǎn)比其它更難清除，可能是因?yàn)槠渌诓课?、大小和?fù)雜程度所致。從一個(gè)潰瘍樣點(diǎn)中釋放出來的口炎斑的數(shù)目有所不同， 有的有10個(gè)左右，有的高達(dá)100個(gè)以上。有的口炎斑為褐色，有的口炎斑為黃色?？谘装叩捏w積也有所變化，有的在10微升左右，有的高達(dá)200微升以上。從這個(gè)病患者中釋放的口炎斑總量估計(jì)在10毫升以上?？谘装咧惺戎行园籽虻臐舛裙罍y在107ml左右。因此， 該病患者的口腔黏膜組織中含有至少108個(gè)嗜中性白血球。這可能是一個(gè)具有顯著影響力的炎癥反應(yīng)，由此而導(dǎo)致口腔疾病。當(dāng)12個(gè)潰瘍樣點(diǎn)中的3至5個(gè)被清除后，該病患者注意到他已經(jīng)沒有牙周炎疾病了。這表明清除潰瘍樣點(diǎn)是治療牙周炎的有效措施。令人驚喜的是，隨著潰瘍樣點(diǎn)的進(jìn)一步清除，患者的口腔潰瘍也較少發(fā)生。在潰瘍樣點(diǎn)清除結(jié)束后，該患者也不再遭受口腔潰瘍的困擾了。這表明口腔炎癥是導(dǎo)致口腔復(fù)發(fā)性潰瘍的誘因。該病患者也注意到，在潰瘍樣點(diǎn)清除以后，他的口臭問題也得以消除?？梢韵胂螅?被困在潰瘍樣點(diǎn)里面的微生物是導(dǎo)致口臭的原因(圖幻。有趣的是，他的感覺系統(tǒng)改善了， 他能聞到更多的氣味。據(jù)推測，在口腔中的嗜中性白血球可能會破壞呼吸系統(tǒng)中的感覺細(xì)胞。因此，清除潰瘍樣點(diǎn)可治療牙齦疾病，也有益于身體健康。這些研究表明，當(dāng)前口腔衛(wèi)生習(xí)慣的不足，導(dǎo)致了食品殘留(圖2B)，細(xì)胞碎片(白色沉淀物，如圖1)和微生物(口臭問題)的積累，這些將誘發(fā)嗜中性白血球的聚集(圖3)。 然而，嗜中性白血球?qū)⒉荒芮宄嬖谟陔[藏區(qū)域的、已經(jīng)硬化了的殘留物、碎片和微生物沉淀物。該區(qū)域的嗜中性白血球聚集群體將導(dǎo)致口炎斑，釋放炎癥因子和破壞性物質(zhì)?？谇火つそM織折疊和更多口炎斑在該區(qū)域的形成，將導(dǎo)致口炎結(jié)(knotitis)，從而誘發(fā)出可見的炎癥癥狀，如口腔潰瘍或潰瘍樣點(diǎn)。隨著口炎結(jié)的增長，炎癥將進(jìn)一步加重，從而導(dǎo)致口腔疾病，如牙周炎的出現(xiàn)。存在于隱藏區(qū)域的、已經(jīng)硬化了的殘留物、碎片和微生物沉淀物是誘發(fā)嗜中性白血球聚集、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的來源。因此，在口腔內(nèi)的炎癥水平可以由口腔內(nèi)可收集的嗜中性白血球數(shù)目來代表。獲得口腔內(nèi)的嗜中性白血球指數(shù)可以有助于對口腔炎癥水平進(jìn)行判斷。這些嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)目可以在進(jìn)行特異性染色之后，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)算；也可以通過計(jì)算這些嗜中性白血球細(xì)胞的特異性成分(或產(chǎn)物)的濃度所代表。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，提供了個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)(Ii)的表達(dá)方式，為該個(gè)體由炎癥所致的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度的增長倍數(shù)。該炎癥指數(shù)的計(jì)算公式如下Ii = nt/nh其中的Ii為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)；nt為從炎癥檢測對象中獲取的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度；nh為該檢測對象在無炎癥的健康情況下所獲取的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度。檢測對象可為人類或其它哺乳類動物。此外，本發(fā)明還提供了比較性口腔炎癥指數(shù)(I。)的表達(dá)方式，為炎癥檢測對象的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度，相對于無炎癥的健康參照者的增長倍數(shù)。該炎癥指數(shù)的計(jì)算公式如下Ic = nt/nr其中的I。為比較性口腔炎癥指數(shù)；nt為從炎癥檢測對象中獲取的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度為無炎癥的健康參照者的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)濃度。檢測對象可為人類或其它哺乳類動物。在其中的一個(gè)實(shí)施例中，檢測對象為人類；無炎癥的健康參照者的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目OO為10，000?？梢悦鞔_的是，口腔炎癥指數(shù)是嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)或其特異性成分(或產(chǎn)物) 濃度的增長倍數(shù)，這可以在某種程度上反映炎癥的程度，幫助醫(yī)生和病人進(jìn)一步了解該口腔炎癥問題。在檢測口腔炎癥指數(shù)時(shí)，嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目或其特異性成分(或產(chǎn)物)從口腔釋放出的效率，受所用取樣緩沖液和條件的影響。本發(fā)明公開了可以產(chǎn)生一致性和可重復(fù)性結(jié)果的取樣緩沖液、程序和條件，將在具體實(shí)施方式
部分進(jìn)行詳細(xì)的闡述。經(jīng)過深入研究，本發(fā)明人揭示了口腔炎癥水平與口腔嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)，并且在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種通過檢測口腔內(nèi)口腔炎癥指數(shù)而輔助判斷炎癥程度的方法，并提供了該方法所涉及到的相關(guān)產(chǎn)品。首先，本發(fā)明提供了一種用于從哺乳動物口腔內(nèi)釋放嗜中性白血球細(xì)胞的新型溶液，采用該溶液作為口腔內(nèi)含物中嗜中性白血球細(xì)胞的取樣溶液，可以從口腔釋放嗜中性白血球，而不傷害人體，并能固定保留嗜中性白血球的多形核特征，可以確保獲得具有一致性和可重復(fù)性的結(jié)果；其次，基于上述溶液以及包括該溶液的試劑盒，本發(fā)明提供了檢測口腔炎癥指數(shù)的方法，通過測量口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量，可間接檢測和評價(jià)哺乳動物口腔炎癥水平。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施例，其中圖1為潰瘍樣點(diǎn)及其清除工具，其中IA 潰瘍出現(xiàn)在腭扁桃體附近；IB —個(gè)專門設(shè)計(jì)的工具“除炎刷”，它可以用來清除嵌入在口腔中的炎癥源；IC 一個(gè)潰瘍樣點(diǎn)出現(xiàn)在黏膜牙齦交界處附近；ID 潰瘍樣點(diǎn)清洗后痊愈。圖2為口炎斑和嗜中性白血球，其中2A 用除炎刷清洗后，從一個(gè)潰瘍樣點(diǎn)釋放來的褐色分泌物(箭頭所示)；2B:褐色分泌物用Turk’ s溶液染色，該分泌物含有大量的嗜中性白血球，食物殘?jiān)坪跏窍嚓P(guān)的(箭頭)；2C 分泌物中的細(xì)胞具有典型的多形核特征； 2D 樣品用吖啶橙(Acridineorange)染色，在熒光顯微鏡下觀察。圖3為口腔內(nèi)發(fā)生炎癥提出的模型。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。_仿丨丨1 個(gè)口耆Φ胎血3求_麗白徹丨丨此實(shí)施例中測試了接受潰瘍樣點(diǎn)清除治療的患者(下稱“一號病人”)和未接受相應(yīng)治療的普通患者(下稱“二號病人”)在10個(gè)月前后的口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目。所述一號病人45歲，患有15年牙周炎，伴隨有偶爾的口臭和口腔潰瘍；二號病人 30歲，患有口腔潰瘍并且經(jīng)常發(fā)生口臭。在2010年1月1日和2010年10月2日對一號病人和二號病人分別進(jìn)行了口腔嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)目的檢測，具體檢測步驟如下1、收集口腔中的嗜中性白血球細(xì)胞，用適量的取樣緩沖液漱口，以釋放口腔中的嗜中性白血球細(xì)胞。采用15毫升的取樣緩沖液進(jìn)行兩次洗漱口腔，每次30秒，從口中釋放嗜中性白血球細(xì)胞，將所得的漱口液樣本混合為30毫升的樣本。該取樣緩沖液為0.4克/L 氯化鉀，0. 06克/L無水磷酸二氫鉀，8. 0克/L氯化鈉，0. 04788克/L無水二元磷酸鈉，1. 0 克/LD-葡萄糖和0. 011克/L酚紅鈉；2、用固定液將嗜中性白血球細(xì)胞固定。采用2. 5%的甲醛固定嗜中性白血球細(xì)胞， 然后在4攝氏度環(huán)境下儲藏，直至使用。3、如果嗜中性白血球細(xì)胞濃度偏低，需要將其濃縮，以便于準(zhǔn)確計(jì)算。在這一具體的實(shí)施例中，在20g的離心轉(zhuǎn)速下，集中嗜中性白血球細(xì)胞。4、在進(jìn)行特異性染色之后，檢測和計(jì)算嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)。在這一具體的實(shí)施例中，嗜中性白血球細(xì)胞由1.6%的吖啶橙(Aridine orange) (AO)染色，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)也可以由該細(xì)胞所特有的成分(或產(chǎn)物)濃度所反映；在口腔取樣時(shí)，可收集這一特有的成分(或產(chǎn)物)，然后進(jìn)行定量分析，測定其濃度。所測定的嗜中性白血球細(xì)胞特有成分(或產(chǎn)物)可能是蛋白質(zhì)、去氧核糖核酸、核糖酸或其它在其細(xì)胞所特有的成分(或產(chǎn)物)。這些特有成分(或產(chǎn)物)的檢測和定量分析，可以由現(xiàn)有的可知的方法進(jìn)行。在科技文獻(xiàn)中，現(xiàn)有很多方法用來檢測蛋白質(zhì)、去氧核糖核酸、核糖酸和其它化合物。比如說，ELISA可以檢測蛋白質(zhì)；PCR可以檢測去氧核糖核酸；特異性探針雜交可以檢測RNA ；小分子化合物可以由高壓液相色譜或氣象色譜檢測等等。檢測結(jié)果見下表1。表1、一號病人和二號病人的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)和口腔炎癥指數(shù)的比較
權(quán)利要求
1.一種釋放口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的溶液，其特征在于，所述溶液包括用于釋放口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的鹽離子和酸離子；優(yōu)選地，所述鹽離子和酸離子由化合物提供，所述化合物選自氯化鉀，氯化鈉和磷酸鈉的一種或多種。
2.如權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于，所述溶液可進(jìn)一步包含用于提供細(xì)胞所需能量的化合物；優(yōu)選地，提供所述細(xì)胞所需能量的化合物為D-葡萄糖。
3.如權(quán)利要求1或2所述的溶液，其特征在于，所述溶液可進(jìn)一步包含用于調(diào)節(jié)該溶液的PH值和緩沖性能的化合物；優(yōu)選地，所述化合物選自無水磷酸二氫鉀，磷酸鈉和無水磷酸氫二銨的一種或多種。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的溶液，其特征在于，所述溶液可進(jìn)一步包含用于著色的化合物；優(yōu)選地，所述化合物為酚紅鈉。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的溶液，其特征在于，所述溶液包含0.01-10. 00克/ L氯化鉀，0.01-10. 00克/L無水磷酸二氫鉀，0.01-10. 00克/L氯化鈉，0. 01-10. 00克/L 無水二元磷酸鈉，0. 01-10. 00克/L D-葡萄糖和0. 01-0. 02克/L酚紅鈉；優(yōu)選地，所述溶液包括0. 4克/L氯化鉀，0. 06克/L無水磷酸二氫鉀，8. 0克/L氯化鈉， 0. 04788克/L無水二元磷酸鈉，1. 0克/L D-葡萄糖和0. 011克/L酚紅鈉。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的溶液，其特征在于，所述溶液為水溶液、酒精溶液或葡萄糖溶液；優(yōu)選地，所述酒精溶液中的酒精濃度為1-70% ；優(yōu)選地，所述葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度為0. 1-15%。
7.一種用于檢測口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)量的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于特異性固定所述嗜中性白血球細(xì)胞的固定劑；和/或用于對所述嗜中性白血球細(xì)胞進(jìn)行特異性染色的染色劑；優(yōu)選地，所述固定劑為甲醛；優(yōu)選地，所述染色劑為吖啶橙。
9.如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括檢測嗜中性白血球細(xì)胞的特異成分或產(chǎn)物所需的檢測試劑；優(yōu)先地，所述特異性成分為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，組織蛋白酶G，髓過氧化物酶，乳鐵蛋白和明膠酶的一種或多種；其檢測試劑包括檢測該特異蛋白所需的抗體及其相應(yīng)的檢測試劑；其檢測試劑為酶聯(lián)反應(yīng)所需的試劑。
10.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的溶液或如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備用于檢測口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)量的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
11.一種檢測哺乳動物口腔炎癥指數(shù)的方法，其特征在于，所述方法包括檢測包含所述哺乳動物口腔內(nèi)含物的樣本中嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量；優(yōu)選地，所述口腔炎癥指數(shù)為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)或比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括1)所述哺乳動物用適量溶液漱口，從而獲得包含所述哺乳動物口腔內(nèi)含物的溶液；2)使用固定劑固定經(jīng)步驟1)獲得的溶液中的嗜中性白血球細(xì)胞；3)使用染色劑將經(jīng)步驟幻固定的嗜中性白血球細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)；優(yōu)選地，在步驟幻前，先離心所述包含哺乳動物口腔內(nèi)含物的溶液；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述離心速度為20-100g，時(shí)間為10-30分鐘；更優(yōu)選地，所述離心速度為20g，時(shí)間為10分鐘。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中的溶液為如權(quán)利要求1-6 中任一項(xiàng)所述的溶液；優(yōu)選地，所述步驟2、中的固定劑為甲醛；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述固定劑為2. 5%的甲醛；優(yōu)選地，所述步驟幻中的染色劑為吖啶橙；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述染色劑為1. 6%的吖啶橙。
14.如權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量和被檢測哺乳動物在健康狀態(tài)下口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)。
15.如權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量和健康狀態(tài)下的哺乳動物參照者口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述健康狀態(tài)下的哺乳動物參照者口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞的數(shù)量為 10000。
16.一種檢測哺乳動物口腔炎癥指數(shù)的方法，其特征在于，所述方法包括檢測包含所述哺乳動物口腔內(nèi)含物的樣本中嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量，所述特異性成分選自中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，組織蛋白酶G，髓過氧化物酶，乳鐵蛋白和明膠酶的一種或多種；優(yōu)選地，所述口腔炎癥指數(shù)為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)或比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量和被檢測哺乳動物在健康狀態(tài)下口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括通過將所述樣本中檢測到的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量和健康狀態(tài)下的哺乳動物參照者口腔內(nèi)的嗜中性白血球細(xì)胞特異成分或產(chǎn)物的含量進(jìn)行比較，計(jì)算所述哺乳動物的比較性口腔炎癥指數(shù)。
19.一種檢測哺乳動物口腔衛(wèi)生改善情況的方法，其特征在于，所述方法包括在對哺乳動物口腔衛(wèi)生進(jìn)行改善之前和之后，根據(jù)權(quán)利要求10-18中任一項(xiàng)所述方法分別檢測哺乳動物口腔炎癥指數(shù)，然后比較改善之前和之后的口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述口腔炎癥指數(shù)為個(gè)性化的口腔炎癥指數(shù)或比較性口腔炎癥指數(shù)；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于釋放口腔內(nèi)嗜中性白血球細(xì)胞的溶液，以及包含所述溶液的試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了檢測哺乳動物口腔炎癥指數(shù)的方法。所述口腔炎癥指數(shù)可以由從口腔中所獲取的嗜中性白血球細(xì)胞數(shù)或嗜中性白血球細(xì)胞特有的成分或產(chǎn)物的濃度所表達(dá)。此外，本發(fā)明還公開了輔助檢測哺乳動物口腔炎癥治療情況的方法。
文檔編號C12Q1/06GK102533933SQ201010588508
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者潘申權(quán) 申請人:潘申權(quán)