專利名稱：一種海帶孢子體dna的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海帶孢子體DNA的制備，具體地說(shuō)是一種有效去除褐藻多糖的海帶孢子體DNA的制備方法。
背景技術(shù)：
海帶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)海藻之一，它含有豐富的碘、蛋白質(zhì)及各種人體必需的礦物元素。除了食用和藥用價(jià)值外，海帶所產(chǎn)生的褐藻酸和甘露醇是經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的工業(yè)原料。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用到海帶的遺傳與變異、種質(zhì)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究中，而進(jìn)行分子生物學(xué)研究的前提條件是制備高純度的海帶孢子體總DNA。眾所周知，褐藻多糖如半乳糖及其衍生物和褐藻酸等一直是制約褐藻DNA制備的一個(gè)主要因素。與高等植物褐藻多糖相比，褐藻孢子體內(nèi)的褐藻多糖含量高，粘性大且是水溶性的。由于褐藻多糖能夠吸附DNA并與DNA共沉淀，導(dǎo)致所制備的DNA產(chǎn)量低，純度差， 進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)常規(guī)的分子生物學(xué)操作無(wú)法進(jìn)行，如限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，PCR反應(yīng)等。因此， 制備高純度，得率高的海帶孢子體DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前，關(guān)于褐藻DNA制備方法的已有一些報(bào)道。一是利用超速離心來(lái)去除褐藻多糖以純化DNA，但這種方法需要大量的海帶孢子體材料。二是利用^^1!虹0如spin柱的方法來(lái)去除海帶孢子體中的褐藻多糖。三是運(yùn)用CTAB方法，在Sargassum polycystum和 S. siIiquosum的DNA制備中有效地去除褐藻多糖，以此DNA為模板，成功地進(jìn)行了 PCR反應(yīng)。四是將褐藻酸裂解酶和CTAB結(jié)合來(lái)去除褐藻多糖。首先是用褐藻酸裂解酶裂解海帶孢子體組織細(xì)胞，去除海帶孢子體組織表面及細(xì)胞壁外褐藻多糖，再利用CTAB方法去除細(xì)胞內(nèi)剩余的褐藻多糖。上述制備海帶孢子體DNA的方法，過(guò)程繁瑣，既費(fèi)時(shí)費(fèi)用又很高，而且褐藻多糖去除的不是很徹底。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種海帶孢子體DNA的制備方法，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的褐藻多糖去除不夠徹底、過(guò)程繁瑣、既費(fèi)時(shí)費(fèi)用又高的問(wèn)題。本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)簡(jiǎn)單易行的、適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)制備海帶孢子體DNA 的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種海帶孢子體DNA的制備方法，包括如下步驟1)取海帶孢子體在清水中反復(fù)清洗，以去除海帶孢子體表面的雜質(zhì)，并在液氮中迅速將海帶孢子體研成藻粉粉末，研磨1-6次；液氮研磨使海帶孢子體組織細(xì)胞破碎，釋放細(xì)胞內(nèi)DNA ；2)將上述藻粉粉末轉(zhuǎn)65°C預(yù)熱的SDS提取緩沖液中，63_65°C水浴保溫60min ；3)加入占上述溶液1/3體積的KAc溶液，混合均勻，第一次去除褐藻多糖；KAc溶液濃度為 5mol Γ1, ρΗ 7. 5 ；4)離心，取上清，加入異丙醇；離心條件室溫IOOOOrpm(10621 Xg)離心30min,
取上清，加入等體積異丙醇沉淀DNA ；5)離心，棄上清，加入CTAB提取緩沖液使DNA進(jìn)一步溶解，65°C保溫15min，第二次去除褐藻多糖；離心條件室溫12000rpm離心IOmin ；6)離心(離心條件室溫12000rpm離心IOmin)，水相加入兩倍體積的KAc溶液， 離心(室溫IOOOOrpm離心20min)，第三次去除褐藻多糖；7)加入上述溶液等體積的氯仿與異戊醇混合液，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；8)離心，(離心條件室溫12000rpm離心lOmin)，水相用冷的異丙醇于-18 至_20°C沉淀；9)離心，用70%冷乙醇(重量百分比濃度)洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase， 終濃度為0. 1 μ g μ Γ1,以消化RNA，得終產(chǎn)品海帶孢子體DNA ；離心條件室溫12000rpm離心 15min。本發(fā)明通過(guò)三次去除褐藻多糖，并且CTAB提取緩沖液和KAc溶液配合使用，使得褐藻多糖去除的更徹底，并且操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力。進(jìn)一步地，所述步驟1)中于液氮中研磨時(shí)，液氮中加入10%海帶孢子體重量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。進(jìn)一步地，所述SDS提取緩沖液的組成為2. 0% sodium dodecylsulfate (SDS)， 5Ommol L-1 ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA), IOOmmol L-1 Tris. HCl, ρΗ 8. 0, 500mmol L-1 NaCl,2% β-巰基乙醇。進(jìn)一步地，所述氯仿與異戊醇混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為M 1。進(jìn)一步地，所述CTAB 提取緩沖液的組成為200mmol L^1Tris-HCl,ρΗ 8. 0,50mmol L1 ethylenediaminetetra-acetic acid,2mol L1 NaCl,2% cetyltrimethyl ammonium bromide。DNA濃度及純度測(cè)定在獲得產(chǎn)品海帶孢子體DNA后，將制備的DNA溶解在TE緩沖液中，1)應(yīng)用普通瓊脂糖電泳進(jìn)行DNA分子量大小的檢測(cè)，幻使用BioWwtometer進(jìn)行DNA濃度及純度測(cè)定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、速度快。本發(fā)明DNA提取步驟簡(jiǎn)化，整個(gè)制備DNA過(guò)程在5_他內(nèi)完成。2、效果好。本發(fā)明有效地去除了褐藻多糖；得到了純度較高(OD26tlA)D28ciS 1. 7-1. 9)的海帶孢子體DNA03、提取效率高。本發(fā)明在液氮中研磨，可使胞外或胞內(nèi)核酸酶失活，減少了 DNA的降解；產(chǎn)量為30 μ g g—1 (濕重)，能夠滿足常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。4、無(wú)污染。本發(fā)明避免了使用有毒化學(xué)藥品。5、操作費(fèi)用較低。本發(fā)明在制備DNA的過(guò)程中沒(méi)有使用蛋白酶K等試劑。


圖1為海帶孢子體DNA普通瓊脂糖電泳圖譜；圖2以本發(fā)明制備的DNA為模板擴(kuò)增出ITS基因的部分片段的電泳圖譜；
圖3為以本發(fā)明制備的DNA為底物進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)的電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1海帶孢子體DNA的制備將用清水反復(fù)沖洗的0. 2-0. 3g新鮮的海帶孢子體置于液氮中，加入0. 02g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，迅速研成粉末(1-6次)；將藻粉轉(zhuǎn)入65°C預(yù)熱的SDS提取緩沖液[2. 0% sodium dodecyl sulfate (SDS),50mmol L1 ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA), 50mmol L-1 Tris-HCl, pH 8. 0,500mmol L-1 NaCl,2% β-巰基乙醇]的離心管中，邊加熱邊混合均勻，65°C水浴保溫60min ；加入1/3的體積的5mol L—1 KAc,混合均勻，冰上放置30min ；IOOOOrpm(10621 Xg)離心IOmin ；取上清，加入等體積異丙醇，室溫12000rpm 離心 IOmin ；棄上清，水相加入 CTAB 緩沖液[200mmol L^1Tris-HCKpH 8. 0) ,50mmol Γ1 ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA),2mol L-1 NaCl, 2% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) ]，65°C保溫15min，第二次去除褐藻多糖；IOOOOrpm離心20min ；水相用兩倍體積的KAc溶液，離心(室溫IOOOOrpm離心20min)，第三次去除褐藻多糖；加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)抽提lOmin，室溫12000rpm離心IOmin ；取上清，水相加入1倍體積的冷異丙醇沉淀，_20°C沉淀30min ； 12000rpm室溫離心15min ；用冷70%乙醇洗DNA沉淀， 稍干后溶于TE中，加入RNase，終濃度為0. Iyg μ Γ1。使用BioWiotometer進(jìn)行DNA濃度及純度測(cè)定；普通瓊脂糖凝膠電泳染色后顯示所提取的海帶DNA大小在23. OKb以上。具體應(yīng)用1 以本發(fā)明實(shí)施例1制備的DNA為模板，擴(kuò)增出ITS基因的部分片段(圖 3)。PCR擴(kuò)增所用正向引物為L(zhǎng)B1 :5，CGCGAGTCATCAGCTCGCATT3’，反向引物為L(zhǎng)B2 5，AGCTTCACTCGCCGTACTGG3，。PCR 反應(yīng)組成反應(yīng)總體積為 25 μ L。IXPCR buffer (50mM KCl，0· 01 % gelatin, IOmM Tris. HCl, pH 9. 0), 2. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTP，0. 2 μ M 引物， 40-50ng DNA，，2. OU Taq 酶。反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性 2min，94°C 60s，55°C 90s，72°C 150s, 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin0進(jìn)行測(cè)序，正向測(cè)序結(jié)果如下GGGAATCCTGTCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACCTACCGATTGAATGTTTCGGTGAAGATTCCGG ACTGTGGCTCGCGTGCTTCACGGCGCTCTTGCCGTGGGAAGTTATCTAAACCTCAACATTTAGAGGAAGGTGAAGT CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCT ATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGG GGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAA TCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATG TCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATC AAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTC GCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCC GAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGG CGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTTCGGACCTCCGATCAAGCAAGAGGACCCGCTGAATTTAAGCATATAACTAA GCGGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATT反向測(cè)序結(jié)果如下CGGGGGGCTTGCTTCTTTTCTCCGCTTAGTTATATGCTTAAATTCAGCGGGTCCTCTTGCTTGATCGGA GGTCCGAACGAAAGTGGTACGGTTTCCAACGCTGACCCAGAAGGGTCGGCGTCGGAGCGCCGGAATGAGGCAGGCAT CCTGCGCACGTTTGGTGAGTCGAGAGTCGCCGCCGAAGCGAGCGCCGTCAACAACTCTGTGCGGCAGGGCGCGAGAG GCTTCGTTCACGAGATTAGGTGCACTCGGAGCATGGGAACTCCGGAACACTCAAAGTCCGCCGCCGCGACTCCCCCG TCGTGAGACAGGAGAGAAGAGGGGCGAGTGGTGTCAACAGACACTCCGACAAGCATGCTCCCAGGAGTATCCCGGAA GCGCAAGATGCGTTCAAAGTTTTGATGATTCACTGGATTCTGCAAGTCGCAAGACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCT TCATCGTTGTGGGAGCCAAGACATCCGTCGCTGAAAGTTTTACAACGTTAAAGGTTGGGGGAGCCGCGGCTAGCGCA GCGCCCCTTTGAGTTCAGATTCAGAGTTTAATGGGTTGAAATGTGGGGTGCGCTTTGATTCGAGGGCCTTTTCACAG GCTCTCGGCGAGGCGCCCCTCGCCCAACTTCGCATAACGAATTCTTTCTCGGGGTAAAGAGGCCGCACGAAGCGGCC TCACAGACAATTTATAGAGCGGGGGGGATTGAACGAACCCGCTTTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGG AAACCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGTTGAGGTTTAGATAACTTCCCACGGCAAGAGCGCCGTGAAGCAC GCGAGCCACAGTCCGGAATCTTCACCGAAACATTCAATCGGTAGGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGAC GTAATCAATGCDNA正反向測(cè)序結(jié)果與GenBank上已登錄的海帶ITS序列進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá) 99%以上，可判斷為海帶的ITS序列。具體應(yīng)用2 以本發(fā)明實(shí)施例1制備提取的DNA為底物，進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，酶切反應(yīng)圖譜如圖3所示。酶切底物為1-2 μ g海帶孢子體DNA，限制性內(nèi)切酶分別是EcoRI，Sau3Al和 HindIII0酶切反應(yīng)時(shí)間為6-7h。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種海帶孢子體DNA的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)取海帶孢子體在清水中反復(fù)清洗，以去除海帶孢子體表面的雜質(zhì)，并在液氮中迅速將海帶孢子體研成藻粉粉末；2)將上述藻粉粉末轉(zhuǎn)入SDS提取緩沖液中，63-65°C保溫60min；3)加入KAc溶液，混合均勻，第一次去除褐藻多糖；4)離心，取上清，加入異丙醇；5)離心，棄上清，加入CTAB提取緩沖液，第二次去除褐藻多糖；6)離心，在水相加入KAc溶液，第三次去除褐藻多糖；7)加入氯仿與異戊醇混合液抽提；8)離心，水相用異丙醇于-18至-20°C沉淀；9)離心，用70%冷乙醇洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，得終產(chǎn)品海帶孢子體DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述海帶孢子體DNA的制備方法，其特征在于所述步驟1)中于液氮中研磨時(shí)，液氮中加入10%海帶孢子體重量的聚乙烯吡咯烷酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述海帶孢子體DNA的制備方法，其特征在于所述SDS提取緩沖液的組成為2· 0% sodium dodecyl sulfate, 50mmol L-1 ethylenediaminetetra-acetic acid, IOOmmol L^1Tris-HCl, pH 8. 0,500mmol L-1 NaCl,2% β-巰基乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述海帶孢子體DNA的制備方法，其特征在于所述氯仿與異戊醇混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為24 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述海帶孢子體DNA的制備方法，其特征在于所述CTAB提取緩沖液的組成為:200mmol L—1 Tris-HCl, pH 8. 0，50mmol L—1 ethyl enediaminetetra-acetic acid，2mol L—1 NaCl，2% cetyltrimethyl ammonium bromide。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種海帶孢子體DNA的制備方法，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的褐藻多糖去除不夠徹底、過(guò)程繁瑣、既費(fèi)時(shí)費(fèi)用又高的問(wèn)題。技術(shù)方案步驟如下，1)取海帶孢子體在清水中反復(fù)清洗后置于液氮中，迅速研成粉末；2)將藻粉轉(zhuǎn)入SDS提取緩沖液中，65℃保溫60min；3)加入KAc溶液，混合均勻，第一次去多糖；4)離心，取上清，加入異丙醇沉淀DNA；5)離心，棄上清，加入CTAB溶液第二次去多糖；6)離心，水相用KAc溶液第三次去多糖；7)加入氯仿∶異戊醇抽提；8)重復(fù)4)步，9)離心，70％冷乙醇洗DNA沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，得產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)速度快，效果好，提取效率高，無(wú)污染，操作費(fèi)用較低。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102154308SQ20101058869
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者姜春梅, 王莎莎, 王高歌 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)