專利名稱：μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及μ -芋螺毒素-KIIIA的制備方法，尤其涉及μ -芋螺毒素-KIIIA的基因工程制備方法，屬于μ -芋螺毒素-KIIIA的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著分子生物學與電生理，尤其是膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，人們認識到Na+通道的結(jié)構(gòu)和功能變化是慢性疼痛的病理生理機制，應用特異性的Na+通道亞型阻止藥治療慢性頑固性疼痛可取得良好的效果。μ-芋螺毒素是高度特異的Na+通道阻滯劑，可以區(qū)分Na+通道的不同亞型 (Shon K, Olivera BM, Watkins M, et al. μ -Conotoxin PIIIA, a new peptide for discriminating among tetrodotoxin-sensitive Na channel subtypes.)，因其序歹llfei， 活性高，選擇性強，已證實具有顯著的鎮(zhèn)痛效果O7Usetani N. Drugs from the sea. Karger Basel Freiburg Paris London New York. 2000 ; 1-5.)，對于發(fā)展鈉通道探針及鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。高選擇性的TTX-R鈉通道抑制劑對神經(jīng)性疼痛或炎癥痛非常有效，且副作用低。 作用于TTX-R VSSCs的芋螺毒素μ -SmIIΙΑ, SIIIA和KIIIA等，已發(fā)現(xiàn)具有顯著的鎮(zhèn)痛作用(Haefner B.Drugs from the deep -marine natural products as drug candidates. Drug Discov Today. 2003 ；8 (12) :536-544.)，目前芋螺毒素的獲得主要是直接提取或人工化學合成(權(quán)規(guī)茹，羅素蘭，林秋金，長孫東亭，張本.芋螺毒素RNA的提取及其cDNA合成的研究.中國海洋藥物雜志.2005 ;24 (2) :1-5.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用基因工程獲得μ -芋螺毒素--ΚΙΙΙΑ的方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種μ-芋螺毒素--ΚΙΙΙΑ的基因工程制備方法，包括將μ-芋螺毒素KIIIA基因插入帶有Trx-tag的原核表達載體構(gòu)建得到重組原核表達載體；將所述的重組原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導目的蛋白的表達；收集并純化所表達的蛋白，即得。其中，所述的μ -芋螺毒素-KIIIA基因是通過合成單鏈DNA序列，形成雙鏈目的 DNA序列而獲得的；所述的帶有Trx-tag的原核表達載體優(yōu)選為pET_3h⑴；硫氧還蛋白 (Thioredoxin, Trx)是一組小分子蛋白質(zhì)，分子量約為lld，廣泛存在于真核生物和原核生物中，它們都包含二硫鍵活性位點序列-Cys-Gly-Pro-Cys-，是巰基-二硫鍵氧化還原酶。其主要作用是可以增加重組蛋白的可溶性，使蛋白質(zhì)在大腸桿菌中可溶性表達，有利于蛋白純化和活性的研究。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前基因工程中比較成熟、經(jīng)典的表達方法。 而PET表達體系則為該系統(tǒng)中的經(jīng)典，本發(fā)明采用了 pET載體作為蛋白表達載體，該載體的特點是帶有Trx-tag，會產(chǎn)生Trx和目的蛋白的融合蛋白。
所述的重組表達載體的構(gòu)建包括以下內(nèi)容pET-3h(+)載體的酶切；酶切產(chǎn)物的膠回收及純化；目的序列和載體的連接；連接產(chǎn)物的鑒定。連接產(chǎn)物的鑒定包括制備感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)化反應、重組質(zhì)粒提取和鑒定。針對于μ-芋螺毒素二硫鍵較多結(jié)構(gòu)較復雜的特點，本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌 0rigami2(DE3)為大腸桿菌宿主菌。0rgami2 (DE!3)為K-12衍生的宿主菌，具有硫氧還蛋白還原酶突變型(trxB)和谷胱甘肽還原酶(gor)突變型基因，具有增加胞漿內(nèi)二硫鍵的形成的特性。0rgami2(DE3)表達的活性蛋白量比其它大腸桿菌宿主菌高10倍以上，是表達富含二硫鍵蛋白的理想宿主。即使和其他大腸桿菌宿主菌的總體表達水平相似，0rgami2(DE3) 表達的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。Orgami宿主菌與氨芐抗性質(zhì)粒相容，可用于 pET-32載體，硫氧還蛋白標簽能夠進一步增強在胞漿內(nèi)形成二硫鍵。本發(fā)明對IPTG誘導目的蛋白的表達條件進行了優(yōu)化和篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始菌濃度(OD6J以及誘導時間對于蛋白表達量有著較為顯著的影響，進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，當0D_ =l.o左右時，蛋白表達量最高。當誘導時間為20h，蛋白的表達量增加率最高。所述的蛋白的純化方式包括將重組蛋白上Ni-NTA瓊脂糖樹脂親和層析，收集洗脫峰，用kphadex G25凝膠過濾除鹽，即得。本發(fā)明利用Trx和0rgami2(DE3)對蛋白空間構(gòu)成的特殊性質(zhì)，建立了表達了融合蛋白芋螺毒素KIIIA(Trx-CTX)的基因工程方法，本發(fā)明基因工程表達的融合蛋白 μ-芋螺毒素KIIIA具備與天然蛋白相同的構(gòu)像、活性。小鼠福爾馬林實驗，小鼠扭體模型，小鼠熱板模型等實驗證實具有優(yōu)秀的鎮(zhèn)痛活性。本發(fā)明基因工程方法具有融合蛋白產(chǎn)量大，易于提取、純化方便，中間流程少等特點，建立了一個方便、經(jīng)濟獲得μ-芋螺毒素 KIIIA的途徑，為將μ -芋螺毒素-KIIIA開發(fā)成臨床鎮(zhèn)痛藥奠定了基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明目的基因電泳圖；1.單鏈目的DNA ;2.單鏈目的DNA ;3. DNA marker ； 4.雙鏈目的基因。圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；1. DNA marker ；2. pET-32a ；3.被BamH I消化的pET-32a ；4.重組質(zhì)粒；5.被BamH I消化的重組質(zhì)粒。圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒中目的基因序列測定圖。圖4為本發(fā)明Trx-CTX的免疫印跡分析圖。圖5為本發(fā)明不同0D600值時誘導表達結(jié)果圖；1.未誘導；2.蛋白標準marker ； 3. 0. 11 ；4. 0. 23 ；5. 0. 47 ；6. 0. 65 ；7. 0. 77 ；8. 0. 94 ；9. 1. 16。圖6為本發(fā)明不同誘導劑濃度誘導蛋白表達結(jié)果圖；1.未誘導2.誘導的 pET_32a ；3.標準蛋白 markers ；4. 0. lmmol/L ；5. 0. 2mmol/L ；6. 0. 4mmol/L ；7. 0. 6mmol/L ； 8. 0. 8mmol/L ；9. 1. Ommol/L ；10. 1. 2mmol/L。圖7為本發(fā)明不同時間誘導蛋白表達結(jié)果圖；1.標準蛋白markers ；2.未誘導； 3. Ih ；4. 2h ；5. 4h ；6. 6h ；7. 8h ；8. IOh ；9. 20h。圖8為本發(fā)明所制備的蛋白過鎳瓊脂糖凝膠的電泳結(jié)果圖。圖9為本發(fā)明蛋白過鎳瓊脂糖凝膠洗脫曲線。圖10為本發(fā)明蛋白經(jīng)凝膠過濾除鹽洗脫曲線；1.純化的Trx-CTX ；2. imidazole
4和其它。圖11為本發(fā)明Trx-CTX對小鼠福爾馬林實驗的影響圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實驗試劑
限制性內(nèi)切酶Kpn I、EcoR INEB
限制性內(nèi)切酶BamH ITakaRa
T4-DNA連接酶NEB
T4多核苷酸激酶TakaRa
酵母粉上海生工
胰蛋白胨上海生工
氨芐青霉素哈爾濱制藥總廠
氯化鈉國產(chǎn)分析純
瓊脂粉上海生工
SDS-PAGE (5%濃縮膠，15%分離膠)
TEMEDBio-Rad
過硫酸銨Bio-Rad
聚丙烯酰胺Promaga
甲叉聚丙烯酰胺Promaga
蛋白質(zhì)MarkerTakaRa
DNA MarkerTakaRa
十二烷基硫酸鈉(SDS)Sigma
異硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)TakaRa
考馬斯亮藍G250TakaRa
TrisSigma
甘氨酸Sigma
EDTABoehringer Mannheim
溴酚蘭國產(chǎn)分析純
考馬斯亮藍測蛋白試劑盒南京建成生物工程研究所
Ni-NTA樹脂Novagen
Sephadex G-25Amersham
生理鹽水國藥集團化學試劑有限公司
醋酸丹東市勝利化工廠
鹽酸嗎啡沈陽第一制藥廠批號050501
大腸桿菌 Origami2 (DE3)Novagen
Pet-32a (+)NEB實施例1 μ -芋螺毒素-KIIIA基因的表達和純化一、實驗方法(一)、μ-芋螺毒素-KIIIA基因的獲得1、合成單鏈DNA序列根據(jù)μ -芋螺毒素-KIIIA氨基酸序列，按照大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計其DNA序列，5’端添加Kpn I酶切位點和腸激酶識別序列，3’端添加TAA終止密碼子及EcoR I酶切位點。具體序列如下5' -C GAC GAC GAC GAC AAG TGC TGC AAC TGC AGC AGC AAA TGG TGC CGT GAT CAT AGC CGC TGC TGC TAA G_3'3' -CATGG CTG CTG CTG CTG TTC ACG ACG TTG ACG TCG TCG TTT ACC ACG GCA CTA GTA TCG GCG ACG ACG ATT CTTAA-5‘；2、形成雙鏈目的DNA序列將上述合成的兩條單鏈DNA分別用T4多核苷酸激酶磷酸化、退火成為雙鏈DNA，具體步驟如下首先將合成的DNA單鏈分別溶于300 μ L與200 μ L去離子水中，終濃度約為 10 μ mol/L ；將兩條單鏈5'端磷酸化，反應體系見表1 表 權(quán)利要求
1.一種μ-芋螺毒素--KIIIA的基因工程制備方法，包括將μ-芋螺毒素KIIIA基因插入帶有Trx-tag的原核表達載體構(gòu)建得到重組原核表達載體；將所述的重組原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. Coli)，IPTG誘導目的蛋白的表達；收集并純化所表達的蛋白，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的基因工程制備方法，其特征在于所述的芋螺毒素-KIIIA基因是通過合成單鏈DNA序列，形成雙鏈目的DNA序列而獲得的。
3.按照權(quán)利要求1所述的基因工程制備方法，其特征在于所述的帶有Trx-tag的原核表達載體為pET-32a(+)。
4.按照權(quán)利要求1所述的基因工程制備方法，其特征在于所述大腸桿菌(E.Coli)是大腸桿菌 0rigami2(DE3)。
5.按照權(quán)利要求1所述的基因工程制備方法，其特征在于IPTG誘導目的蛋白的表達的條件是OD6tltl = 1.0。
6.按照權(quán)利要求1所述的基因工程制備方法，其特征在于所述誘導時間為20小時。
7.按照權(quán)利要求1所述的基因工程制備方法，其特征在于，所述的蛋白的純化方式包括將重組蛋白上Ni-NTA瓊脂糖樹脂親和層析，收集洗脫峰，用S印hadex G25凝膠過濾除鹽，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制備方法，包括將μ-芋螺毒素-KIIIA基因插入帶有Trx-tag的原核表達載體構(gòu)建得到重組原核表達載體；將所述的重組原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導目的蛋白的表達；收集并純化所表達的蛋白，即得。本發(fā)明利用Trx和Orgami2(DE3)對蛋白空間構(gòu)成的特殊性質(zhì)，建立了表達了融合蛋白μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程方法，所制備的融合蛋白具備與天然蛋白相同的構(gòu)像、活性。動物實驗證實，所制備的融合蛋白具有優(yōu)秀的鎮(zhèn)痛活性。本發(fā)明方法具有融合蛋白產(chǎn)量大，易于提取、純化方便，中間流程少等特點，建立了一個方便、經(jīng)濟的獲得μ-KIIIA的途徑。
文檔編號C12N15/09GK102154257SQ20101058881
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者李鳳蘭, 李暉, 李金波, 管薈苓, 董欽, 蔣倩倩, 趙雪嬌, 馬健慧 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學