專利名稱：一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、及其應用、大量制備豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、及 其應用、大量制備豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。
背景技術：
豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpea trypsin inhibitor, CPTI)是一種屬于 Bowman-Birk家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以與農業(yè)害蟲(主要是鱗翅目、直翅目、鞘翅 目昆蟲)消化道中的絲氨酸蛋白酶形成酶-抑制劑的復合物，從而減弱或阻斷蛋白酶的消 化水解作用，進而使害蟲產生營養(yǎng)不良，出現(xiàn)機能紊亂甚至死亡現(xiàn)象。與傳統(tǒng)的Bt蛋白相 比，CPTI蛋白具有抑蟲或殺蟲譜更廣、對人畜安全等優(yōu)點，是一種生物農藥的潛在開發(fā)對 象，因而在農林業(yè)具有很高的應用和推廣價值。大腸桿菌表達體系是目前應用最廣泛的原核表達體系，主要由表達載體和宿主菌 兩部分組成。表達載體一般具有以下特征穩(wěn)定的遺傳復制、傳代能力；具有篩選標記；可 調控的啟動子，抑制時本底轉錄水平較低；具備外源基因插入的多克隆位點。宿主菌一般選 擇蛋白酶缺陷的菌株，如經(jīng)典的BL21系列菌株就是Ion和ompT蛋白酶缺陷型。但是并非所有外源基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中都能高效表達，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)從豇豆中克隆得到的豇豆胰蛋白酶抑制劑不能在大腸桿菌中高效表達，其表達量較低， 表達的蛋白活性較低。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。本發(fā)明的再一目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明的另一目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑原核表達載體。本發(fā)明的另一目的是提供一種高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因工程菌 株。 本發(fā)明的另一目的是提供上述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的應用。如上所述本發(fā)明的發(fā)明人首先利用PCR反應從豇豆基因組DNA中直接獲得CPTI 基因(CPTI基因不含有內含子)，CPTI基因的開放閱讀框編碼106個氨基酸，該編碼蛋 白 N 端帶有一個 18 個氨基酸的信號肽(SignalP :http //www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/)。將該基因在大腸桿菌中表達，發(fā)現(xiàn)其表達量較低，表達的蛋白活性較低。由于原核表達體系通常不具有識別真核細胞信號肽并將該蛋白成功定位的功能， 而成熟有活性的蛋白總是在信號肽酶切除信號肽后才能形成，同時信號肽主要含疏水性氨 基酸，在原核表達體系中大量表達時常常形成包涵體。因此，本發(fā)明的發(fā)明人在表達上述
3CPTI基因時去除了部分信號肽序列，同時優(yōu)化了序列按照盡可能的去掉信號肽序列、又要 保證不破壞蛋白的二級結構的原則，把基因前30個脫氧核糖核苷酸去除，利于在大腸桿菌 中表達出該基因的重組蛋白。然后將改造優(yōu)化的CPTI基因的編碼序列構建到原核表達載 體PGEX-6p-l中；隨后將構建好的CPTI表達載體轉化到表達菌株BL21 (DE3)中，用誘導劑 IPTG (isopropyl-β -d-1-thiogalactopyranoside,異丙基-β -d-硫代半乳糖苷)誘導融 合蛋白的表達；利用融合蛋白的GST標簽可以與Glutathione Sephrose 4B親和的特性，可 以純化得到純度達到90%以上的融合蛋白GST-CPTI。優(yōu)化后CPTI基因的序列如SEQ ID No. 1所示cttgtagggg ttactactgc agccatggat ctgaaccacc tcggaagtaa tcatcatgat 60gactcaagcg atgaaccttc tgagtcttca gaaccatgct gcgattcatg catctgcact 120aaatcaatac ctcctcaatg ccattgtaca gatatcaggt tgaattcgtg tcactcggct 180tgcaaatcct gcatgtgtac acgatcaatg ccaggcaagt gtcgttgcct tgacattgct 240gatttctgtt acaaaccttg caagtccagg gatgaagatg atgag285根據(jù)本發(fā)明的豇豆胰蛋白酶抑制劑，其由核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的基因編 碼，具體地，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。LVGVTTAAMD LNHLGSNHHD DSSDEPSESS EPCCDSCICT KSIPPQCHCTDIRLNSCHSA 60CKSCMCTRSM PGKCRCLDIA DFCYKPCKSR DEDDE95因此，根據(jù)本發(fā)明的豇豆胰蛋白酶抑制劑原核表達載體，其包括上述豇豆胰蛋白 酶抑制劑CPTI基因。根據(jù)本發(fā)明的高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法包括在原核生物中表達 上述述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的步驟，優(yōu)選在大腸桿菌中表達。根據(jù)本發(fā)明的高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因工程菌株，其具有上述 豇豆胰蛋白酶抑制劑基因，優(yōu)選為大腸桿菌重組菌株。雖然豇豆胰蛋白酶抑制劑在一些豆類植物中含量比較豐富，但是天然提取和純化 CPTI的工藝繁瑣、產量低和成本高，不適合大規(guī)模的推廣和應用，制約了 CPTI蛋白的在農 林領域防治鱗翅目害蟲的應用。本發(fā)明的優(yōu)化CPTI基因可以在大腸桿菌中高效表達，表達量顯著提高，而且表 達蛋白的比活也提高，在抑制劑濃度為0. 05mg/mL時，抑制活性達0. 204，在抑制劑濃度為 0. 2mg/mL時，抑制活性達0. 807。大腸桿菌(E. coli)表達體系是目前應用最廣的一個外源基因表達體系。大腸桿 菌表達體系的優(yōu)點是，遺傳學和生理學背景清楚；容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；外源基因 經(jīng)?？梢赃_到高效表達。所用的大腸桿菌菌株BL21(DE3)。BL21(DE3)是一個λ DE3 ( λ DE3 是λ噬菌體的突變株)的溶原菌，即在BL21的染色體上整合有ADE3的一段染色體。本 發(fā)明所使用的表達載體為PGEX-6p_l(GE，Healthcare)帶有Ptac可誘導的強啟動子，表達 出N端帶有一個^kDa的GST標簽的融合蛋白。GST作為一種純化的標簽，可以方便地純化 純度非常高的目的蛋白，同時GST還具有穩(wěn)定分子量較小的CPTI蛋白的作用。


圖1為豇豆CPTI基因的PCR擴增產物，M =DNA分子量標準，1 陰性對照，2 :CPTI基因。圖2為PGEX-6p-l-CPTI表達載體的雙酶切驗證，1 重組質粒雙酶切的產物，M DNA分子量標準。圖3為融合蛋白GST-CPTI誘導表達檢測，M 蛋白Marker，1 :IPTG誘導的菌液，2 未添加IPTG誘導的菌液。圖4為融合蛋白GST-CPTI親和層析純化，M 蛋白Marker，1 純化后的融合蛋白 GST-CPTI。圖5為胰蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶的抑制活性。
具體實施例方式實施例1豇豆基因組DNA的提取及CPTI基因的擴增產物豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpea trypsin inhibitor, CPTI)基因中不含有內含子， 通過提取豇豆基因組DNA，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表出來的序列設計引物，擴增出CPTI基因。豇豆種子(購自中國農科院)種于花盆中，大約30天后取其葉片提取基因組DNA。 采用 The chargeswitch gDNA plant kit (購自 invitrogen 公司)提取豇豆基因組 DNA。 以上述豇豆基因組DNA為模板，利用PCR反應擴增出CPTI基因(圖1)。CPTI基因的PCR產 物送往上海生工生物工程有限公司測序。測序結果表明CPTI基因的編碼序列是由321bp 基組成，編碼106個氨基酸，含有一個終止密碼子，與已經(jīng)發(fā)表序列非常高的同源性(90% 以上)。實施例2改造CPTI基因CPTI基因的開放閱讀框編碼106個氨基酸，該編碼蛋白N端帶有一個18個氨基酸 的信號肽(SignalP ;http://www. cbs. dtu. dk/services/SiRnalP/)。原核表達體系通常不 具有識別真核細胞信號肽并將該蛋白成功定位的功能，而成熟有活性的蛋白總是在信號肽 酶切除信號肽后才能形成，同時信號肽主要含疏水性氨基酸，在原核表達體系中大量表達 時常常形成包涵體。按照盡可能的去掉信號肽序列，又要保證不破壞蛋白的二級結構的原 則，把基因前30個脫氧核糖核苷酸去除。本發(fā)明所表達的CPTI從第11個氨基酸到第106 個氨基酸。設計上、下游引物并分別引入酶切位點BamH I和)(h0 I。上游弓丨物 CPTI-BamH I_F :gaa att ggatcc ctt gta ggg gtt act act下游弓丨物 CPTI-Xho I-R :gaa att ctc gag ctc ate ate ttc atePCR反應程序為95°C熱變性5分鐘；95°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30 秒；30個循環(huán)，72°C延伸10分鐘。PCR產物經(jīng)過1 %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因條
市ο實施例3GST-CPTI融合蛋白表達載體的構建BamH I和Xho I雙酶切CPTI基因條帶和PGEX_6p_l表達載體，在T4 Iigase作用 下16°C過夜連接。次日，將連接產物轉化DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含氨芐抗生素固體LB平 板，37°C過夜培養(yǎng)。菌落PCR呈陽性的克隆，提取質粒作酶切驗證(圖2)。將質粒送往上海 生工公司測序，結果表明表達載體的構建完全正確。實施例4GST-CPTI融合蛋白的表達將構建好的表達載體質粒轉化表達菌株BL21 (DE3)。挑取單菌落至含100 μ g/ml氨芐抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)，待0D600達到0. 5左右時，取出500 μ 1菌液做 對照，剩余菌液加入IPTG至終濃度0. 5mmol/L誘導表達，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3小時。取500 μ 1 菌液，12000rpm離心1分鐘，收集菌體，用80 μ IPBS重懸菌體，加入20 μ 1 5x SDS-PAGE loading buffer，沸水煮5分鐘，取10 μ 1進行SDS-PAGE凝膠電泳(電泳結果見圖3)。實施例5GST-CPTI融合蛋白的純化挑取單克隆于20ml含氨芐抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。將活化的菌 種按1 100的比例接種于IL含氨芐抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，培養(yǎng)兩個小 時至0D600 = 0. 5，加入IPTG至終濃度為0. 2mmol/L, 16°C過夜誘導。次日用大容量冷凍離 心機4°C，4000rpm, 30分鐘收集菌體。然后用30ml PBS重懸，冰浴下超聲裂解。細胞裂解物 用高速冷凍離心機4°C，15000rpm離心30分鐘。將得到的上清以lml/min的流速上樣于用 PBS平衡的Glutathione Sephrose 4B層析柱，待上樣結束后，繼續(xù)用20倍柱體積的PBS沖 洗非特異性結合的蛋白。然后用3倍柱體積的洗脫液(lOmmol/L還原型谷胱甘肽，50mmol/ L Tris-HCl,pH 8.0)洗脫目的蛋白。聚丙烯凝膠電泳檢測融合蛋白的純度(圖4)將洗脫 下來的目的蛋白加入IOkDaMillipore濃縮離心管中，將Glutathione Sephrose 4B洗脫液 換成 20mmol/L Tris pH 8. 0, lOOmmol/LNaCl, 3mmol/L DTT 并濃縮至 1. 5ml。-20°C，保存。 利用分光光度計測量該蛋白的^Onm吸光度值，計算出IL菌液中可以得到25mg GST-CPTI 蛋白。實施例6融合蛋白GST-CPTI對胰蛋白酶的抑制活性的測定(1)酶活抑制活性測定原理胰蛋白酶可作用于人工合成底物苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯胺(ΒΑΡΝΑ)，釋放出 黃色的對硝基苯胺，該物質在410nm下有最大吸收值。胰蛋白酶抑制劑可抑制這一反應，使 410nm吸光度值下降，其下降程度與胰蛋白酶抑制劑活性成正比。用分光光度計在410nm處 測定吸光度值的變化，可對胰蛋白酶抑制劑活性進行定量分析。(2)溶液的配制^ ! 30. Omg (Trypsin 1 :250, porcine pancrease) 5mmol/L CaCl2 和lmmol/LHCl溶液(ρΗ3· 0)，并定容至100ml。保存于4°C冰箱中。稱取60mg的BAPNA用Iml 二甲基亞砜(DMSO)溶解，然后用50mmol/ LTris-HCl (pH8. 1)和 5mmol/L CaCl2 溶液定容至 100ml。(3)融合蛋白GST-CPTI抑制胰蛋白酶活性的測定方法對照組取200 μ 1純化的蛋白GST-CPTI (不同濃度)到750 μ 1 ΒΑΡΝΑ溶液(37°C預熱) 中，37°C反應10分鐘，立即用100 μ 1醋酸溶液終止該反應，然后加入200 μ 1胰蛋白酶，混 合均勻。以水為空白，410nm測定吸光度值Al。抑制組取200 μ 1純化的蛋白GST-CPTI (不同濃度)加入到750 μ 1 ΒΑΡΝΑ溶液(37°C預 熱)中，然后加入200 μ 1胰蛋白酶溶液，37°C反應10分鐘，立即用100 μ 1醋酸溶液終止該 反應。以水為空白，410nm測定吸光度值Α2。無抑制組取200 μ 1胰蛋白酶溶液加入到750 μ 1 ΒΑΡΝΑ溶液(37°C預熱)中，37°C反應10分鐘，加入100 μ 1醋酸溶液終止該反應，然后再加入200 μ 1純化的蛋白GST-CPTI (不同濃 度)，混合均勻。以水為空白，410nm測定吸光度值A3。融合蛋白GST-CPTI對胰蛋白酶活性的抑制
權利要求
1.一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一種豇豆胰蛋白酶抑制劑，其特征在于，所述豇豆胰蛋白酶抑制劑由核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示的基因編碼。
3.—種豇豆胰蛋白酶抑制劑，其特征在于，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
4.一種豇豆胰蛋白酶抑制劑原核表達載體，其特征在于，所述載體包括權利要求1所 述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。
5.一種高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于，所述方法包括在原核 生物中表達包括權利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的步驟。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括在大腸桿菌中表達包括權 利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的步驟。
7.一種高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因工程菌株，其特征在于，所述菌株具 有權利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。
8.一種高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因工程菌株，其特征在于，所述菌株為 具有權利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的大腸桿菌。
9.權利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、及其應用、大量制備豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。如上所述本發(fā)明的發(fā)明人首先利用PCR反應從豇豆基因組DNA中直接獲得CPTI基因(CPTI基因不含有內含子)，然后優(yōu)化改造所述CPTI序列，改造后的序列在大腸桿菌中的表達量和表達比活性都有顯著改進。
文檔編號C12R1/19GK102127552SQ20101059032
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權日2010年12月8日
發(fā)明者李峰, 陸慶宇, 高偉 申請人:北京林業(yè)大學