專利名稱：黃花蒿的遺傳轉化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種黃花蒿高效遺傳轉化方法及應用。
背景技術：
青蒿素是我國學者首次從黃花蒿(Artemisia annuaL.)中分離得到的一種倍半萜 內酯過氧化物，是治療瘧疾的特效藥，國際市場需求量日益增長。進一步的藥理研究證明， 青蒿素及其相似物對多種人類和動物腫瘤細胞均具有毒性作用，包括乳腺癌細胞、血癌細 胞、黑色素瘤細胞、腎癌細胞、中樞神經系統(tǒng)腫瘤細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞等，而對正 常細胞損傷很小，并且與傳統(tǒng)化療藥不存在交叉耐藥。因此，青蒿素及其類似物有望被開發(fā) 成高效、低毒、價廉、譜廣的抗癌新藥，具有廣泛的應用前景，從而導致青蒿素的市場進一步 擴大，青蒿素的需求量將進一步上升。然而，目前藥用青蒿素均是從青蒿植株中提取分離而得，由于其含量低，提取環(huán)節(jié) 復雜，安全隱患大，導致青蒿素的生產成本過高。因此，如何有效制備青蒿素是近年來備受 關注的難點與熱點問題。國內外學者通過栽培、傳統(tǒng)遺傳育種、組織培養(yǎng)和發(fā)根培養(yǎng)等方式 試圖培育高產植株或生產青蒿素，但迄今為止均未取得令人滿意的結果。隨著現代分子生 物學和基因工程技術的迅速發(fā)展，通過基因調控手段大幅度提高植株中青蒿素的含量將成 為徹底解決青蒿素生產成本過高問題的必然趨勢。Vergauwe和Han等分別報道了根癌農桿 菌介導的黃花蒿轉化方法，雖然Vergauwe等利用萬古霉素(vancomycin)作為農桿菌抑制 劑，成功地得到轉基因植物，但vancomycin十分昂貴，且嚴重推延了再生苗的產生。Han等 雖然以頭孢霉素為農桿菌抑制劑也得到了轉基因植株，且僅局限于特定的基因型植株和特 定的表達載體。此外，這兩種轉化體系均存在轉化率低和轉化時間長的缺點，未得到推廣應 用。因此，構建成本低、轉化率高、重復性好的黃花蒿遺傳轉化再生體系仍然是黃花蒿資源 改良急需解決的主要問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種黃花蒿的遺 傳轉化方法，以黃花蒿的節(jié)間莖為轉基因的受體材料，采用農桿菌介導法將外源基因導入 黃花蒿受體細胞中，經過選擇再生獲得轉化植株，以縮短現有技術獲得轉基因植株的時間， 提高現有黃花蒿遺傳轉化的效率。為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種黃花蒿的遺傳轉化方 法，該方法包括如下步驟1)、黃花蒿無菌苗的準備將黃花蒿種子滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基上，在每天16 小時、30001uX光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40%的條件下培養(yǎng)，7天后轉至MS培
養(yǎng)基，每40天繼代繁殖一次；2)、菌株的活化及浸染菌液的制備將攜帶目的基因的農桿菌劃線培養(yǎng)在含有100mg/L卡那霉素的L B固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2天，使其活化，挑取單菌落于LB液 體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)，取達到對數生長期的菌液即OD6tltl為0. 6-0. 7，離心，棄上清液， 收集菌體懸浮于MS液體培養(yǎng)基稀釋至0D_ = 0. 3，加入80-120 μ M乙酰丁香酮，得到用于 轉化的浸染液；3)、侵染和共培養(yǎng)取繼代苗齡為30-40天的黃花蒿無菌苗枝梢，去葉芽，切成 1-3厘米長的莖，置于步驟2中的侵染液，間歇搖動使外植體與菌液充分接觸，浸染時間為 15-30min ；取出侵染過的外植體，用無菌濾紙吸干表面菌液，轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基 +100 μ M乙酰丁香酮，于25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)48-60h ；4)、不定芽的誘導I期將共培養(yǎng)后的外植體轉移至誘導培養(yǎng)基MS+0. lmg/L噻二 唑苯基脲(TDZ)，并添加400mg/L羧芐西林(Carb)和25mg/L卡那霉素(Kan)，每周更換新 鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為每天16小時、30001uX光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40% ；5)、不定芽的誘導II期2周后，將步驟4中的外植體轉入含300mg/L羧芐西林 (Carb)和 25mg/L 卡那霉素(Kan)的 MS+0. 05mg/Ll_ 萘乙酸(NAA)+0. 5mg/L6_ 芐氨基嘌呤 (6-BA)培養(yǎng)基，每周更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為每天16小時、30001uX光照，8小時黑暗， 溫度25 °C，相對濕度40% ；6)、選擇性生長培養(yǎng)3周后，將步驟5中的培養(yǎng)材料轉入含300mg/L羧芐西林 (Carb)和25mg/L卡那霉素(Kan)的MS+0. ang/L6_芐氨基嘌呤(6-BA)伸長培養(yǎng)基，培養(yǎng)條 件為每天16小時、30001uX光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40% ；7)、誘導生根當步驟6中的再生芽達到2厘米高時轉入含100mg/L羧芐西林 (Carb)和25mg/L卡那霉素(Kan)的1/2MS+0. lmg/Ll-萘乙酸(NAA)生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件 為每天16小時、30001uX光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40% ；誘導其生根，使其形 成完整的黃花蒿轉基因植株。上述將黃花蒿種子滅菌是指取黃花蒿種子，用70-75%酒精(V/V)浸泡種子1_2分 鐘后，用5% NaOCl (M/V)浸泡消毒15-20分鐘，然后用無菌水沖洗3_4遍。本發(fā)明所使用的農桿菌菌株為AGL0，質粒載體為pBI121、pBin 19、或 Impactvectorl. 1 (農桿菌禾口質粒均由荷蘭Wageningen大學Maarten Jangsma教授惠贈)。 將農桿菌菌株AGLO浸染后的黃花蒿節(jié)間莖，經共培養(yǎng)、選擇性再生培養(yǎng)、選擇性伸長培養(yǎng) 和選擇性生根培養(yǎng)后，多次反復實驗表明轉化后均能得到黃花蒿的再生完整植株，對再生 植株進行了⑶S染色檢測和PCR檢測，分析結果表明外源基因已經整合到黃花蒿基因組中。 依照本發(fā)明的方法，其它目的外源基因也能應用本發(fā)明的轉化和再生方法導入黃花蒿，從 而拓寬黃花蒿育種途徑。本發(fā)明的優(yōu)點是成本低；不定芽再生率高，不定芽誘導率達60%以上；不定芽再 生速度快；直接產生再生芽，不經過愈傷組織；共培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基能適合多品種和多 種類型基因的遺傳轉化；再生轉化植株沒有嵌合現象。
具體實施例方式下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步地說明，但是它并不限于這些實施例的任一 個或類似實例。實施例1湖南長沙地區(qū)黃花蒿遺傳轉化實例
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選用湖南農業(yè)大學黃花蒿實驗基地成熟的黃花蒿種子，用體積濃度70%的酒精浸 泡種子2分鐘后，用5% NaOCl (M/V)浸泡消毒15分鐘，然后用無菌水沖洗3遍。將滅菌后 的黃花蒿種子接種于1/2MS培養(yǎng)基上，在光照強度為30001UX，每天16小時光照，8小時黑 暗，溫度25 0C，相對濕度40 %的條件下培養(yǎng)，一星期后轉至MS培養(yǎng)基，每40d繼代繁殖一 次。將攜帶目的基因表達載體pBI121-GUS的農桿菌AGLO劃線培養(yǎng)在含有100mg/L卡 那霉素的L B固體培養(yǎng)基上，28°C黑暗培養(yǎng)2天，使其活化，挑取單菌落于L B液體培養(yǎng)基 中，28°C振蕩培養(yǎng)，將達到菌對數生長期的菌液(0D_ = 0. 6)離心，棄上清液，用MS液體培 養(yǎng)基懸浮，直至OD6tltl = 0. 3，加入SOuM乙酰丁香酮，從而得到用于轉化的浸染液。取繼代苗齡約為30天的黃花蒿無菌苗枝梢，去葉芽，切成1厘米長的莖作為遺 傳轉化的外植體，總共200個外植體，置于侵染液，間歇搖動使外植體與菌液充分接觸，時 間分別為20min。侵染完畢后取出外植體用無菌濾紙吸干表面菌液，轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基 MS+lOOuM乙酰丁香酮，于25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)48h。共培養(yǎng)結束后將外植體轉移至誘 導培養(yǎng)基MS+0. lmg/L噻二唑苯基脲，并添加400mg/L Carb和25mg/L Kan,每周更換新 鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照強度30001uX，每天16小時光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對 濕度40%。2周后將外植體轉入含300mg/L Carb和25mg/L Kan的培養(yǎng)基MS+0. 05mg/L NAA+0. 5mg/L 6_BA，每周更換新鮮培養(yǎng)基，3周后將培養(yǎng)材料轉入含300mg/L Carb和25mg/ L Kan伸長培養(yǎng)基MS+0. 2mg/L 6_BA，直到再生芽達到2厘米高時轉入含100mg/L Carb和 25mg/L Kan生根培養(yǎng)基l/2MS+0. lmg/L NAA，誘導生根。最后獲得46株抗性苗。為了更一 步驗證，隨機選取在選擇培養(yǎng)基上產生20株抗性植株上進行了 GUS檢測，其中19株抗性植 株都檢測到了 GUS表達。進一步GUS染色陽性植株進行PCR檢測。用NPTII基因設計引物，上 游引物為 PF 5 ‘ -GATTGAACAAGATGGATT-3 ‘,下游引物為 PR 5，-CATTTTCCACCATGATATTC-3，， 擴增600bp的NPTII基因片段，所檢測的植株中均擴增出了目的片段。實施例2廣西桂林地區(qū)黃花蒿遺傳轉化實例選用桂林野生成熟的黃花蒿種子，用體積濃度75%的酒精浸泡種子1分鐘后，用 5%Na0Cl(M/V)浸泡消毒20分鐘，然后用無菌水沖洗4遍。將滅菌后的黃花蒿種子接種于 1/2MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件和繼代方式與實例1相同。將攜帶目的基因表達載體pBinl9-GUS的農桿菌AGLO劃線培養(yǎng)在含有100mg/L卡 那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28°C黑暗培養(yǎng)2天，使其活化，挑取單菌落于L B液體培養(yǎng)基中，
振蕩培養(yǎng)，將達到菌對數生長期(0D· = 0. 7)的菌液離心，棄上清液，于MS液體培養(yǎng) 基懸浮，直至OD6tltl = 0. 3，加入120 μ M乙酰丁香酮，從而得到用于轉化的浸染液。取繼代苗齡約為35天的黃花蒿無菌苗枝梢，去葉芽，切成1. 5厘米長的莖作為遺 傳轉化的外植體，總共300個外植體，置于侵染液，間歇搖動使外植體與菌液充分接觸，時 間分別為25min。侵染完畢后取出外植體用無菌濾紙吸干表面菌液，轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基 MS+100yM乙酰丁香酮，于25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)48h。共培養(yǎng)結束后將外植體轉移至 誘導培養(yǎng)基MS+0. lmg/L噻二唑苯基脲，并添加400mg/L Carb和25mg/L Kan，每周更換新 鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照強度30001uX，每天16小時光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對 濕度40%。2周后將外植體轉入含300mg/L Carb和25mg/L Kan的培養(yǎng)基MS+0. 05mg/L NAA+0. 5mg/L 6-BA,每周更換新鮮培養(yǎng)基，3周后將培養(yǎng)材料轉入含300mg/L Carb和25mg/LKan伸長培養(yǎng)基MS+0. ang/L 6-BA，直到再生芽達到2厘米高時轉入含100mg/L Carb和 25mg/L Kan生根培養(yǎng)基l/2MS+0. lmg/L NAA，誘導生根。最后獲得46株抗性苗。為了更 一步驗證，隨機選取在選擇培養(yǎng)基上產生20株抗性植株上進行了 GUS檢測，所有抗性植株 都檢測到了 GUS表達，而非抗性對照植株則無GUS反應。用與實例1同樣的方法，進一步對 GUS染色陽性植株進行PCR檢測，所檢測的植株中均擴增出了目的片段。實施例3重慶酋陽地區(qū)黃花蒿遺傳轉化實例選用酋陽地區(qū)野生的黃花蒿種子，用體積濃度為75%的酒精浸泡種子90秒，用 5% NaOCl (M/V)浸泡消毒18分鐘，然后用無菌水沖洗3遍。將滅菌后的黃花蒿種子接種于 1/2MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件和繼代方式與實例1相同。將攜帶目的基因表達載體Impactvectorl. I-GUS的農桿菌AGLO劃線培養(yǎng)在含有 100mg/L卡那霉素的L B固體培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)2天，待長出菌落后，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中二8°C振蕩培養(yǎng)，將達到菌對數生長期(0D· = 0. 6)的菌液離心，棄上清液， 用MS液體培養(yǎng)基懸浮，直至0D_ = 0. 3，加入120 μ M乙酰丁香酮，從而得到用于轉化的浸 染液。取繼代苗齡約為40天的黃花蒿無菌苗枝梢，去葉芽，切成2厘米長的莖作為遺傳 轉化的外植體，總共500個外植體，置于侵染液，間歇搖動使外植體與菌液充分接觸，時間 為15min。侵染完畢后取出外植體用無菌濾紙吸干表面菌液，轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+100uM 乙酰丁香酮，于25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)60h。共培養(yǎng)結束后將外植體轉移至誘導培養(yǎng)基 MS+0. lmg/L噻二唑苯基脲，并添加400mg/L Carb和25mg/L Kan,每周更換新鮮培養(yǎng)基，培 養(yǎng)條件為光照強度30001uX，每天16小時光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40%。2 周后將外植體轉入含 300mg/L Carb 和 25mg/L Kan 的培養(yǎng)基MS+0. 05mg/LNAA+0. 5mg/L 6-BA,每周更換新鮮培養(yǎng)基，3周后將培養(yǎng)材料轉入含300mg/L Carb和25mg/L Kan伸長培 養(yǎng)基MS+0. 2mg/L 6-BA，直到再生芽達到2厘米高時轉入含100mg/L Carb和25mg/L Kan 生根培養(yǎng)基l/2MS+0. lmg/LNAA，誘導生根。最后獲得46株抗性苗。為了更一步驗證，隨機選取在選擇培養(yǎng)基上產生30株抗性植株上進行了 GUS檢 測，其中28株抗性植株都檢測到了 GUS表達，用與實例1同樣的方法，進一步對GUS染色陽 性植株進行PCR檢測，所檢測的植株中27株擴增出了目的片段。本發(fā)明中，除非特別說明，所采用的MS培養(yǎng)基來自公開報道的MS培養(yǎng)基，該培 養(yǎng)基包括無機成分，有機成分，鐵鹽，蔗糖和瓊脂粉。按照常規(guī)的高壓蒸汽滅菌方法滅菌 (121°C下滅菌20分鐘)。文中的1/2MS培養(yǎng)基也屬于本領域內的常規(guī)技術，指MS鹽和維生 素減半，其它不變。本發(fā)明中的LB液體培養(yǎng)基、及LB固體培養(yǎng)基的配制也屬于本領域內的 常規(guī)技術。
權利要求
1.一種黃花蒿的遺傳轉化方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)、黃花蒿無菌苗的準備將黃花蒿種子滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基上，在每天16小 時、30001uX光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40%的條件下培養(yǎng)，7天后轉至MS培養(yǎng) 基，每40天繼代一次；2)、菌株的活化及浸染菌液的制備將攜帶目的基因的農桿菌劃線培養(yǎng)在含有IOOmg/ L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)兩天，使其活化，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基 中，28°C振蕩培養(yǎng)，取達到對數生長期的菌液即OD6tltl為0. 6-0. 7，離心，棄上清液，收集菌體 懸浮于MS液體培養(yǎng)基中稀釋OD6tltl = 0. 3，加入80-120 μ mol/L乙酰丁香酮，得到用于轉化 的浸染液；3)、侵染和共培養(yǎng)取繼代苗齡為30-40天的黃花蒿無菌苗枝梢，去葉芽，切成1-3 厘米長的莖，置于步驟2中的侵染液中，間歇搖動使外植體與菌液充分接觸，侵染時間為 15-30min ；取出侵染過的外植體，用無菌濾紙吸干表面菌液，轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基 +100 μ mol/L乙酰丁香酮，于25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)48_60h ；4)、不定芽的誘導I期將共培養(yǎng)后的外植體轉移至添加有0.lmg/L噻二唑苯基脲、 400mg/L羧芐西林及25mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，每周更換新鮮培養(yǎng)基， 培養(yǎng)條件為每天16小時、30001uX光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40% ；5)、不定芽的誘導II期2周后，將步驟4中的外植體轉入含300mg/L羧芐西林和25mg/ L卡那霉素的MS+0.05mg/L 1_萘乙酸+0. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤培養(yǎng)基，每周更換新鮮培養(yǎng) 基，培養(yǎng)條件為每天16小時、30001uX光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40% ；6)、選擇性伸長培養(yǎng)3周后，將步驟5中的培養(yǎng)材料轉入含300mg/L羧芐西林和25mg/ L卡那霉素的MS+0. 2mg/L 6-芐氨基嘌呤培養(yǎng)基伸長培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為每天16小時、 30001ux光照，8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40% ；7)、誘導生根當步驟6中的再生芽達到2厘米高時轉入含100mg/L羧芐西林和25mg/L 卡那霉素的1/2MS+0. lmg/Ll-萘乙酸生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為每天16小時、30001ux光照， 8小時黑暗，溫度25°C，相對濕度40% ；誘導其生根，使其形成完整的黃花蒿轉基因植株。
2.如權利要求1所述的黃花蒿的遺傳轉化方法，其特征在于所述步驟1中將黃花蒿 種子滅菌是指取黃花蒿種子，用70-75%酒精(V/V)浸泡種子1-2分鐘后，用5% NaOCl (M/ V)浸泡消毒15-20分鐘，然后用無菌水沖洗3-4遍。
3.如權利要求1所述的黃花蒿的遺傳轉化方法，其特征在于所述步驟2中乙酰丁香 酮的濃度為100 μ mol/L。
4.如權利要求1所述的黃花蒿的遺傳轉化方法，其特征在于所述步驟3中以黃花蒿 節(jié)間莖為轉化材料。
全文摘要
一種黃花蒿的遺傳轉化方法，該方法主要包括黃化蒿無菌苗的準備，菌株的活化和浸染菌液的制備，黃花蒿節(jié)間莖作為轉化外植體與菌液共培養(yǎng)，然后把經過共培養(yǎng)的外植體挑出，轉入到選擇培養(yǎng)基上進行脫菌和選擇培養(yǎng)，將選擇培養(yǎng)基中產生的抗性植株轉入到選擇伸長培養(yǎng)基和選擇生根培養(yǎng)基中先后進行伸長培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，直至抗性芽再生為完整的植株。對獲得的抗性植株分別進行了GUS檢測和PCR檢測，結果表明外源基因已經整合到黃花蒿的基因組中。本發(fā)明具有操作簡單、取材方便、轉化效率高，可廣泛用于黃花蒿的基因工程操作中。
文檔編號C12N15/82GK102127566SQ201010593768
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權日2010年12月17日
發(fā)明者劉仲華, 劉碩謙, 田娜, 黃建安 申請人:湖南農業(yè)大學