專利名稱：厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方 法。
背景技術(shù)：
厚樸是我國(guó)特有的、常用的珍貴中藥材，被列為國(guó)家珍稀瀕危植物和二級(jí)保護(hù)中 藥材 藥用厚木卜e括厚樸(Magnolia officinalis Rehd. et ffils. subsp. officinalis) 和凹葉厚樸 OK officinalis subsp. biloba (Rehd. et ffils.) Law)及其中間類型(劉 玉壺等，1996)。厚樸藥材含揮發(fā)油成分30余種、酚性化合物9種、生物堿9種以及一些其 它化學(xué)成分。其中，厚樸酚(Magnolol，5, 5'-di-2-propenyl-l, 1'-biphenyl-2, 2’_diol) 及其異構(gòu)體和厚樸酚(Honokiol，3’，5-di-2-propenyl-l, l'-biphenyl-2, 4’_diol)占絕對(duì) 優(yōu)勢(shì)。一直以來評(píng)價(jià)厚樸藥材品質(zhì)優(yōu)劣主要利用這二種酚的含量。厚樸具有抗病毒、抗腫 瘤、防齲、抗菌、抗?jié)?、肌肉松弛、抗痙攣、鎮(zhèn)痛、抗炎及毒性等藥理作用(王承南和夏傳格， 2003)。它天然分布于湖北、四川、甘肅、陜西、湖南、安徽、浙江、江西、福建、廣西等省區(qū)海拔 200 3000m的丘陵、山地，但作為藥材的生產(chǎn)基地，主要在浙江、湖北、江西、湖南和四川等 省。厚樸因其特殊的分類地位和資源的日益枯竭而先后被列為國(guó)家珍稀瀕危植物和二級(jí)保 護(hù)中藥材(傅立國(guó)，1991)。過去，厚樸藥材主要利用野生資源。70年代以來，隨著厚樸藥材臨床應(yīng)用范圍擴(kuò)大 和對(duì)外貿(mào)易的發(fā)展，需求量逐年增加，過度的采伐使天然資源瀕臨枯竭?，F(xiàn)在已很難能找到 野生厚樸。而生產(chǎn)上所采的厚樸均屬70年代至90年代初營(yíng)造的人工林，因當(dāng)時(shí)造林未考 慮種源、單株在藥材有效成份上的差異、栽培基地選擇不當(dāng)以及采伐樹齡偏小等原因，造成 了藥材質(zhì)量參差不齊，甚至有一大部分還達(dá)不到藥典所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(中國(guó)藥典，2000)。據(jù)研究，厚樸的人工栽培受種源、栽培氣候等諸多因素的影響，而且不同樹齡厚樸 酚含量差異很大，這直接影響厚樸藥材的產(chǎn)品質(zhì)量、采收次數(shù)及厚樸酚的產(chǎn)量(趙中振等， 1992;曾燕如等，1999;)。另外，我國(guó)的可耕地面積有限，這也制約了其大面積栽培。因此， 唯有利用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來獲得更多的厚樸酚才是解決這一問題的根本途徑。而 且組織培養(yǎng)具有用才少，繁殖速度快，遺傳穩(wěn)定之特點(diǎn)，優(yōu)良種源中選出的優(yōu)良單株采用組 織細(xì)胞培養(yǎng)法來實(shí)現(xiàn)厚樸次生代謝產(chǎn)物工廠化生產(chǎn)是最有效途徑。另外，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān) 厚樸組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方法，以厚樸子葉培養(yǎng)所獲 得的愈傷組織為材料，通過愈傷組織狀態(tài)調(diào)控，探究愈傷組織懸浮培養(yǎng)生物量增加與厚樸 酚類物質(zhì)積累機(jī)理，為厚樸酚規(guī)?；a(chǎn)及其資源的開發(fā)利用提供新的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施
步驟一，將接種量為2g/L的厚樸愈傷組織顆粒接種于液體MS (Murashige-Skoog)基本培養(yǎng)基 附力口 NAA(a_naphthalene acetic acid)0·5 1. Omg/L、 6-BA (6-benzylaminopurine)0. 1 0.3mg/L>2,4-D(2, 4-dichlorophenoxy acetic acid)0. 1 0. 3mg/L、蔗糖 20 40g/L、pH5. 6 7. O、攪拌速度為 80 120rpm/min 生長(zhǎng) 培養(yǎng)條件下250ml的三角瓶中培養(yǎng)22天；
步驟二，步驟一所述的培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)接到液體MS培養(yǎng)基附加NAA (a-naphthalene acetic acid)0. 3 0. 7mg/L、6_BA(6-benzylaminopurine)0·05 0. 15mg/L> 2，4-D (2，4-dichlorophenoxy acetic acid) 0. 1 0. 3mg/L、蔗糖 10 30g/L、pH5. 5 5. 7、 攪拌速度為80 120rpm/min生長(zhǎng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12天，收集愈傷組織顆粒，提取厚樸酚 類物質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1、針對(duì)該厚樸懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)和厚樸酚類物質(zhì)積累規(guī)律，本培養(yǎng)方法有效的提高了厚 樸愈傷組織顆粒生物量。2、本發(fā)明建立的懸浮培養(yǎng)體系可用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)。3、有關(guān)本發(fā)明的效果請(qǐng)見下表
權(quán)利要求
1.一種厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方法，其特征是，它包括A、選取厚樸種子萌發(fā)出的子葉為組織培養(yǎng)的外植體；B、對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理；C、將消毒好的外植體放入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織；D、將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)成適合懸浮培養(yǎng)的狀態(tài)；E、將適合懸浮培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方法，其特征在于所述的愈 傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件為MS (Murashige-Skoog)培養(yǎng)基和附加成份，附加成2.4~D(2, 4-dichlorophenoxy acetic acid) 0. 75mg/L> NAA (a-naphthalene acetic acid) 0.2mg/L、PVP (Polyvinylpyrrolidone) 2. Og/L、瓊脂 7. 4g/L、蔗糖 30 g/L，暗培養(yǎng) M天，培養(yǎng)溫度為M 26°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方法，其特征在于所述的 愈傷組織狀態(tài)調(diào)控培養(yǎng)基組分為MS (Murashige-Skoog)培養(yǎng)基和附加成份，附加成份為 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxy acetic acid) 0. 75mg/L>NAA(a-naphthalene acetic acid) 0. 2mg/L、PVP (Polyvinylpyrrolidone) 2. Og/L、谷氨酰胺 0. 15 0. 35g/L、水解硌蛋白 0. 1 0. 3mg/L、瓊脂 7. 4g/L、蔗糖 30 g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方法，其特征在于所 述的液體培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件為液體MS (Murashige-Skoog)基本培養(yǎng)基附加 NAA (a-naphthalene acetic acid)0. 75mg/L、6_BA (6_benzylaminopurine)0. 2mg/L、 2，4-D (2，4-dichlorophenoxy acetic acid) 0. 2mg/L、蔗糖 30g/L、pH 為 5. 8、接種密度 45g/ L、攪拌速度為lOOrpm/min生長(zhǎng)培養(yǎng)條件下200ml的三角瓶中暗培養(yǎng)M天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種厚樸懸浮培養(yǎng)體系建立的方法，包括A、選取厚樸種子萌發(fā)出的子葉為組織培養(yǎng)的外植體；B、對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理；C、將消毒好的外植體放入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織；D、將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)成適合懸浮培養(yǎng)的狀態(tài)；E、將適合懸浮培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于減輕愈傷組織褐化，提高愈傷組織生物量增加以及厚樸酚類物質(zhì)產(chǎn)量，可用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102102089SQ20101059397
公開日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者崔永一, 徐步青, 童再康 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)