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一種豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及應(yīng)用的制作方法

文檔序號:588135閱讀:693來源:國知局
專利名稱:一種豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種適合豬鏈球菌2型大規(guī)模培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)
豬鏈球菌2型(Str印tococcus suis)作為危害豬的主要細菌病原(Lun ZR, 2007),它有33個血清型,其中豬鏈球菌2型(簡稱S. Suis 2)最為普遍,會導(dǎo)致豬一系列疾病,如髓膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、漿膜炎、流產(chǎn)、膿腫,嚴重致死。另外S. Suis 2 還會感染人,引起腦膜炎(WertheimHF,2009)。豬鏈球菌2型已成為養(yǎng)豬國家的主要問題, 給養(yǎng)豬業(yè)造成極為嚴重的經(jīng)濟損失。雖然關(guān)于豬鏈球菌2型的研究比較多,并取得一定成果,但是其培養(yǎng)方面的相關(guān)報道很少,尤其對于豬鏈球菌2型的培養(yǎng)沒有固定的培養(yǎng)基。目前國內(nèi)外較多應(yīng)用一種商業(yè)培養(yǎng)基為TSB來培養(yǎng)豬鏈球菌2型。這種培養(yǎng)基雖然使用方便,但在培養(yǎng)過程中,具有菌體生長緩慢,成本高等缺點,其發(fā)酵終點的活菌數(shù)為10 20億,不適合大規(guī)模增菌使用。豬鏈球菌2型的生長繁殖所需條件較高,其培養(yǎng)基中需要含有多種物質(zhì),特別是氮源要豐富?,F(xiàn)今常用的TSB培養(yǎng)基,其主要成分為胰蛋白胨,另外其含有0. 25%的葡萄糖,0. 25%的K2HPO4和0. 5%的NaCl,并不完全適合豬鏈球菌2型的生長代謝的需要。因此, 完全有必要研制并開發(fā)適合工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn),且原料來源廣泛,價格低廉,能大幅度提高活菌數(shù)的培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對豬鏈球菌2型所設(shè)計的培養(yǎng)基。通過單因素方法、Plackett-Burman 設(shè)計、最陡爬坡試驗、響應(yīng)面方法優(yōu)化的豬鏈球菌2型培養(yǎng)基既能保證豬鏈球菌2型生長旺盛,進行正常代謝,又能提高生長速度,縮短生產(chǎn)時間,完全能適應(yīng)于疫苗生產(chǎn)。本發(fā)明的培養(yǎng)基發(fā)酵終點活菌數(shù)為80-90億,較常用商業(yè)培養(yǎng)基TSB培養(yǎng)基提高5倍以上。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成—種適用于豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基,按重量體積比計的組分及配比如下胰蛋白胨0. 5. 0%、酵母粉0. 5. 0%、醋酸銨0. 01% 2. 0%、MgSO4 · 7H20 0. 01% 2%,K2HPO4 ·3Η20 0. 4. 0%,KH2PO4 0. 01% 和葡萄糖 0. 01% 2. 0%; 按體積比的牛血清 15%,余量是水,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的PH至7. 4 7. 8。作為優(yōu)選方案之一,按重量體積比計的組分及配比如下胰蛋白胨0.5% 4. 0%、酵母粉 0. 5% 4. 0%、醋酸銨 0. 05% 1. 0%、MgSO4 · 7Η20 0. 03 % 1. 5 %、 K2HPO4 ·3Η20 0. 05% 3. 0%,KH2PO4 0. 05% 0. 8%、葡萄糖 0. 05% 1. 5%;按體積比的牛血清為2% 12%,余量是水,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的ρΗ為7. 4 7. 8。作為優(yōu)選方案之二,按重量體積比計的組分及配比如下胰蛋白胨1.0% 3. 0 %、酵母粉 1. 0 % 3. 0 %、醋酸銨 0. 1 % 0. 5 %、MgSO4 · 7Η20 0. 1 % 1. 0 %、CN 102533577 A
K2HPO4 ·3Η20 2. 0%,KH2PO4O. 0. 5%、葡萄糖0. 1. 0%;按體積比的牛血清為3% 10%,余量是水,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的ρΗ至7. 4 7. 8。本發(fā)明的培養(yǎng)基的制備方法,其步驟包括Α、按上述所示的配方量,將胰蛋白胨,酵母粉,醋酸銨,MgSO4 · 7Η20,用蒸餾水溶解后,定容至1000ml,滅菌調(diào)培養(yǎng)基的ρΗ至7. 4 7. 8,在115 121°C下高壓蒸汽下滅菌 15 25min ;B、稱取葡萄糖100g,定容至1000ml,在110 115°C高壓蒸汽下滅菌15 25min ;C、稱取22. 8g的三水磷酸氫二鉀,加蒸餾水定容至100ml,配制成磷酸氫二鉀溶液;稱取13. 6g無水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至IOOml,配制成磷酸二氫鉀溶液;取8細1磷酸氫二鉀溶液和16ml磷酸二氫鉀溶液,使二者混合,配成磷酸鹽緩沖溶液,在121°C高壓蒸汽下滅菌15 25min ;D、將步驟B的葡萄糖和步驟C的磷酸鹽緩沖溶液滅菌后連同過濾除菌的牛血清一起加入滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基中,即得到所述的豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基;其中步驟B中的葡萄糖添加量按體積比為1 % 3 %,步驟C中的磷酸緩沖溶液添加量按體積比為3% 9 %,牛血清按體積比的添加量為5% 15%。本發(fā)明設(shè)計的培養(yǎng)基具有如下特點含有豬鏈球菌2型生長代謝所需的營養(yǎng)要求,其中選用葡萄糖作為碳源,但由于豬鏈球菌2型自身的特點,選用葡萄糖濃度較低,原因是葡萄糖過多會加快菌體的呼吸,使一些中間代謝產(chǎn)物如乙酸積累在菌體或培養(yǎng)基中, 導(dǎo)致PH值下降,影響酶的活性,進而抑制微生物生長和產(chǎn)物的合成;復(fù)合氮源胰蛋白胨和酵母粉,營養(yǎng)豐富,除可提供菌體生長繁殖所需營養(yǎng)外,有的還是產(chǎn)物的前體,特別是酵母粉中含有很多生長因子能有效促進豬鏈球菌2型的生長繁殖;無機氮源醋酸銨,能迅速為豬鏈球菌2型所吸收,并可調(diào)節(jié)ρΗ值;硫酸鎂中的鎂離子能縮短延滯期;緩沖鹽體系的磷不僅是核酸、磷酸、ATP、和輔酶的前體成分,而且緩沖體系可以起到一個很好的調(diào)節(jié)ρΗ作用;牛血清中含有一些生長因子,能促進菌體的代謝。本發(fā)明提供一種可以用于疫苗生產(chǎn)的大規(guī)模增殖培養(yǎng)基,所用材料和工藝均以疫苗生產(chǎn)為最終目的。采用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)豬鏈球菌2型,有利于細菌的生長代謝,與其他培養(yǎng)基相比能獲得較高的菌量,而且材料來源廣泛且價格低廉,在疫苗生產(chǎn)過程中能得到高純度的細菌。使用本發(fā)明提供的液體培養(yǎng)基進行大規(guī)模培養(yǎng),可有效擴增豬鏈球菌2型,獲得純化的豬鏈球菌2型菌,以供疫苗生產(chǎn)。


圖1 是豬鏈球菌2型發(fā)酵罐生長曲線圖。
具體實施例方式實施例1培養(yǎng)基組分及配比胰蛋白胨^g;醋酸銨0. 4g ;
4
酵母粉27g ; MgSO4 · 7H20 0. 25g ;
K2HPO4 · 3H20 15g ; KH2PO4 1. 5g ;葡萄糖2. 9g ;牛血清 5% 15% (V/V);經(jīng)下列方法制得A、將胰蛋白胨、酵母粉、醋酸銨、MgSO4 · 7H20、用蒸餾水溶解后,定容至1000ml,調(diào)整PH到7. 7,在117°C高壓蒸汽下滅菌20min ;B、稱取葡萄糖100g,加蒸餾水定容至1000ml,在113°C高壓蒸汽下滅菌20min ;C、稱取22. Sg的三水磷酸氫二鉀,加蒸餾水定容至100ml,配制成磷酸氫二鉀溶液。稱取13. 6g無水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至IOOml,配制成磷酸二氫鉀溶液;取8細1磷酸氫二鉀溶液和16ml磷酸二氫鉀溶液,二者混合,配成磷酸鹽緩沖溶液,在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。D、將步驟B的葡萄糖和步驟C的緩沖溶液滅菌后連同過濾除菌的牛血清一起加入滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基中,得到豬鏈球菌2型液體培養(yǎng)基;其中 步驟B中的葡萄糖添加量為2. 2 % (V/V),步驟C中的磷酸緩沖溶液添加量為7 % (V/V),牛血清的添加量為12% (V/V)。實施例2培養(yǎng)基組分及配比胰蛋白胨35g;醋酸銨0. 5g ;K2HPO4 · 3H20 20g ;葡萄糖5g ;經(jīng)下列方法制得A、將胰蛋白胨、酵母粉、醋酸銨、MgSO4 · 7H20、用蒸餾水溶解后,定容至1000ml,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的PH至7. 8,在121°C高壓蒸汽下滅菌25min ;B、稱取葡萄糖100g,加蒸餾水定容至1000ml,在115°C高壓蒸汽下滅菌25min ;C、稱取22. 8g的三水磷酸氫二鉀,加蒸餾水定容至100ml,配制成磷酸氫二鉀溶液;稱取13. 6g無水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至IOOml,配制成磷酸二氫鉀溶液;取8細1磷酸氫二鉀溶液和16ml磷酸二氫鉀溶液,將二者混合配成磷酸鹽緩沖溶液,在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ;D、將步驟B的葡萄糖和步驟C的緩沖溶液滅菌后連同過濾除菌的牛血清一起加入滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基中,即得到豬鏈球菌2型液體培養(yǎng)基。其中步驟B中的葡萄糖添加量為3 % (V/V),步驟C中的磷酸緩沖溶液添加量為9 % (V/ V),牛血清的添加量為15% (V/V)。實施例3培養(yǎng)基組分及配比胰蛋白胨15g;酵母粉15g;醋酸銨0. Ig ;MgSO4 · 7H20 0. Ig ;K2HPO4 · 3H20 IOg ; KH2PO4 Ig ;葡萄糖Ig ;牛血清5% (V/V);
酵母粉Wg ; MgSO4 · 7H20 0. 5g ; KH2PO4 5g ; 牛血清15% (V/V);
經(jīng)下列方法制得A、將胰蛋白胨、酵母粉、醋酸銨、MgSO4 · 7H20、用蒸餾水溶解后,定容至1000ml,調(diào)整PH到7. 4,在115°C高壓蒸汽下滅菌15min ;B、稱取葡萄糖100g,加蒸餾水定容至1000ml,在110°C高壓蒸汽下滅菌15min ;C、稱取22. 8g的三水磷酸氫二鉀,加蒸餾水定容至100ml,配制成磷酸氫二鉀溶液。稱取13. 6g無水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至IOOml,配制成磷酸二氫鉀溶液;取8細1磷酸氫二鉀溶液和16ml磷酸二氫鉀溶液,將二者混合配成磷酸鹽緩沖溶液,在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ;D、將步驟B的葡萄糖和步驟C的緩沖溶液滅菌后連同過濾除菌的牛血清一起加入滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基中,即得到豬鏈球菌2型液體培養(yǎng)基。其中步驟B中的葡萄糖添加量為1 % (V/V),步驟C中的磷酸緩沖溶液人添加量為3 % (V/V),牛血清的添加量為5% (V/V)。應(yīng)用本發(fā)明制備的培養(yǎng)基進行了 3L和60L發(fā)酵發(fā)酵罐發(fā)酵,試驗效果見表1和表2.表1 豬鏈球菌2型3L罐體實驗
權(quán)利要求
1.一種適用于豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于按重量體積比計的組分及配比如下胰蛋白胨0. 5.0%、酵母粉0. 5.0%、醋酸銨0.01% 2.0%、 MgSO4 · 7Η20 0. 01 % 2%、K2HPO4 · 3H20 0. 1 % 4. 0%、KH2PO4 0. 01% 和葡萄糖 0.01% 2.0% ;按體積比的牛血清為 15%,余量是水,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至 7. 4 7. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于按重量體積比計的組分及配比如下 胰蛋白胨0. 5% 4. 0%、酵母粉0. 5% 4. 0%、醋酸銨0. 05% 1. 0%、MgSO4 · 7H200.03% 1. 5%、K2HPO4 · 3H20 0. 05% 3. 0%、KH2PO4 0. 05% 0. 8%、葡萄糖 0. 05% 1.5% ;按體積比的牛血清為2% 12%,余量是水,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 4 7. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基,其特征在于按重量體積比計的組分及配比如下胰蛋白胨1. 0 % 3. 0 %、酵母粉1. 0 % 3. 0 %、醋酸銨0. 1 % 0. 5 %、MgSO4 · 7H20 0. 1. 0%, K2HPO4 · 3H20 2. 0%, KH2PO4 0. 0. 5%、葡萄糖 0. 1. 0% ; 按體積比的牛血清為3% 10%,余量是水,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 4 7. 8。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的培養(yǎng)基的制備方法,其特征在于下列步驟A、按配方量,將胰蛋白胨,酵母粉,醋酸銨,MgSO4· 7H20,用蒸餾水溶解后,定容至 1000ml,滅菌調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 4 7. 8,在115 121°C下高壓蒸汽下滅菌15 25min ;B、稱取葡萄糖100g,定容至1000ml,在110 115°C高壓蒸汽下滅菌15 25min;C、稱取22.Sg的三水磷酸氫二鉀,加蒸餾水定容至100ml,配制成磷酸氫二鉀溶液;稱取13. 6g無水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至IOOml,配制成磷酸二氫鉀溶液;稱取8細1磷酸氫二鉀溶液和16ml磷酸二氫鉀溶液,使二者混合,配成磷酸鹽緩沖溶液,在121°C高壓蒸汽下滅菌15 25min ;D、將步驟B的葡萄糖和步驟C的磷酸鹽緩沖溶液滅菌后連同過濾除菌的牛血清一起加入滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基中,即得到所述的豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基;其中步驟B中的葡萄糖添加量按體積比為 3 %,步驟C中的磷酸緩沖溶液添加量按體積比為3% 9%,牛血清按體積比的添加量為5% 15%。
5.權(quán)利要求1-3任一項所述的培養(yǎng)基在豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種豬鏈球菌2型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及應(yīng)用。其特征在于,按重量體積比計的組分及配比如下胰蛋白胨0.1%~5.0%,酵母粉0.1%~5.0%,醋酸銨0.01%~2.0%,MgSO4·7H2O 0.01%~2%、K2HPO4·3H2O 0.1%~4.0%、KH2PO4 0.01%~1%、葡萄糖0.01%~2.0%;按體積比的牛血清為1%~15%,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.4~7.8。本發(fā)明有利于豬鏈球菌2型生長代謝,菌體生長速度快,能獲得較高菌量,培養(yǎng)豬鏈球菌2型活菌數(shù)可達到85億。本發(fā)明的培養(yǎng)基原材料來源廣泛,成本低廉,可有效擴增豬鏈球菌2型,能滿足大規(guī)模生產(chǎn)豬鏈球菌2型疫苗的需要。
文檔編號C12N1/20GK102533577SQ201010595828
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者何偉, 冀志霞, 尹爭艷, 康超, 徐高原, 曹毅, 金梅林, 陳關(guān)平, 陳守文, 陳波, 陳煥春, 韓進, 顧偉 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司
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