專利名稱：一種控制植物體內ala合成、促進生長并提高抗逆性的轉基因方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種控制植物體內ALA合成、促進生長并提高抗逆性的轉基因方法， 屬于基因工程領域。是一種微生物基因在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應用，是一種運用生物基因工程技術培育高產(chǎn)、多抗植物新種質的方法。
背景技術：
5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevunilic acid, ALA)是所有生物體內普遍存在的一種類似于氨基酸的5碳化合物，是所有卟啉化合物(如葉綠素、亞鐵血紅素、維生素B12等) 生物合成的關鍵前體。在植物體內，它由谷氨酸通過三步酶催反應轉化而成；在動物及酵母體內，它由琥珀酰CoA和甘氨酸通過ALA合酶催化，一步反應即可生成。我們以及其它研究小組通過大量的外源處理試驗表明，ALA可以明顯提高甜瓜、西瓜、西葫蘆、番茄、蘿卜、黃瓜、菠菜、小白菜、生菜、油麥菜、草莓、水稻、小麥、棉花、煙草、棗、 梨、康乃馨、紅掌等多種草本和木本植物抵抗高溫、低溫、高光、弱光、鹽漬、干旱、貧瘠等環(huán)境脅迫能力，并顯著提高產(chǎn)量(汪良駒等，植物生理學通訊，2003，39 =185-192 ；Wanget al, Physiol Plant，2004，121 :258-264 ；汪良駒等，園藝學報，2004，31 =321-326 ；汪良駒等， 南京農(nóng)業(yè)大學學報，2004，27 O) 34-38 ；Wang et al, J Intergrative Plant Biol, 2005, 47 :1084-1091 ；汪良駒等，西北植物學報，2005，25 :488-496 ；劉暉等，果樹學報，2006，23 854-859 ；常蘇紅等，自然災害學報，2006，15 :312-317 ；尹璐璐等，西北農(nóng)業(yè)學報，2007， 16(4) :166-169 ；周賀芳等，干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2007，25 ) :212-215 ；程菊娥等，湖南農(nóng)業(yè)科學，2007⑷58-60 ；孫永平等，西北植物學報，2008，28 =1384-1390 ；康瑯等，南京農(nóng)業(yè)大學學報，2008，31(1) :31-36;王乃江等，西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)，2008， 36(9) :76-80;徐銘等，西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)，2008，36(9) =128-132 ； 劉芳等，中國水稻科學，2008，22 =411-415 ；徐曉潔等，干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，沈 131-135 ；祁向玲等，西北農(nóng)業(yè)學報，2008，17 =202-206 ；趙曉進等，西北農(nóng)業(yè)學報，2008，17 303-308 ；孫永平等，園藝學報，2009，36 :671-678 ；馮志威等，山西農(nóng)業(yè)科學，2009，37 (5) 42-43;康博文等，西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)，2009，37 (4) :97-102;童金株等，干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2009，27 ) =116-120 ；姚素梅等，植物營養(yǎng)與肥料學報，2010，16 242-246 ；郭珍等，西北林學院學報，2010,25(3) :93-96 ；劉玉梅等，園藝學報，2010，37 65-71 ；李文華等，西北林學院學報2010，25(1) :90-94)。然而，國際上迄今仍然沒有通過轉基因技術來提高植物內源ALA含量以至于提高作物抗逆性并提高產(chǎn)量的成功報道。德國學者(Hiifgenet al, PNAS, 1994,91 :1726-1730 ；Kumar et al, Plant Physiol, 2000,122 :49-56)曾經(jīng)將植物體內的ALA合成酶基因(包括tRNAGlu還原酶基因 HemA和谷氨酸-1，2-半醛氨基轉移酶基因(isa)轉入煙草和擬南芥體內，但是，沒有獲得 ALA過量合成型轉基因植物。這可能與植物ALA合成需要多個酶催化，從而導致的轉化難度增大有關。Zavgorodnyaya等(Plant J，1997，12 :169-178)最早選擇酵母菌ALA合酶基因(Hem)為目的基因，然后把它與CaMV35S啟動子重組在一起，轉入煙草后，獲得了 ALA過量合成的轉基因植物。韓國學者 Jung 等(Plant Sci, 2004,167 :789-795 ；Photosynthetica 2008,46 3-9)則把大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的Hem基因與玉米泛素啟動子重組起來，轉入水稻后，也獲得了 ALA過量合成型轉基因植株。然而，無論是煙草還是水稻，所有的轉基因植株都只能生長在弱光條件下。一旦轉入到強光(1/6的自然光強)下，轉基因植株就會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，因而，這樣的轉基因植物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上沒有實用價值。我們也從釀酒酵母菌中克隆出ALA合酶基因(Wfem)，并把它與擬南芥中一種光敏型啟動子(擬南芥HemAl基因啟動子)重組起來，轉入到煙草、擬南芥、番茄、西瓜、油菜、水稻、草莓、梨等植物體內后，發(fā)現(xiàn)它不僅可以誘導植物體內源ALA過量合成，而且即使生長在自然光照條件下(約ΖΟΟΟμπιοΙ·!^2·^)也不會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。因而，轉基因植物不僅抗逆性明顯增強，而且產(chǎn)量明顯提高。這種轉基因技術在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有應用前景。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的是提供一種促進植物生長，提高植物抗逆性的轉基因方法。技術方案本發(fā)明所提供的促進植物生長，提高植物抗逆性的轉基因方法，是將擬南芥HemAl 基因光敏型啟動子(AtHemAlP)和釀酒酵母ALA合酶基因(YHeml)重組，通過植物表達載體轉入植物中，篩選得到光合能力明顯提高，生長發(fā)育受到促進，并且延緩衰老，單株產(chǎn)量也比野生型植株明顯提高，同時抗逆性也得到提高的轉基因植物。本發(fā)明所述方法中，AtHemAlP核苷酸序列是Genebank中ΑΜ95364的全長序列； YHeml基因的編碼序列是Genebank中YSCHEM1AA全長序列。AtHemAlP和YHeml基因可以通過植物表達載體YF8631或13840導入植物中的。其中釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pYF8631構建為將測序正確的pMD18-T載體上的Heml基因經(jīng)BamHI和^icI雙酶切后，插入植物雙元載體pYPXVhb，替換原先載體上的Vhb基因，構成載體pYF8630，隨后再將經(jīng)HindIII和 BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動子AtHemAlP插入pYF8630載體的相應酶切點間，經(jīng)酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體PYF8631 ；釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pI3840構建為將測序正確的Heml基因經(jīng)BamHI和^icI雙酶切后，回收1647bp的DNA片段，與相應酶切的PYF7716載體相連，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動子AtHemAlP插入上述載體的相應酶切點間，經(jīng)酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體PYK3840。本發(fā)明所述的促進植物生長包括煙草、擬南芥、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓、蘋果、梨等。本發(fā)明所述的提高抗逆性包括耐鹽性，抗寒性，耐高溫性、耐弱光性，耐強光性。有益效果本發(fā)明的方法既可以促進單子葉植物，也可以提高雙子葉植物的植株生長及并且提高植株的抗逆性。如水稻、煙草、番茄、擬南芥、油菜、西瓜、草莓、梨等。攜帶有光敏型啟動子AtHemAlP和^feml的編碼基因的表達載體，可以通過熱激法或電擊法導入農(nóng)桿菌EH105， LBA4404，GV3101等感受態(tài)細胞中。通過Ti質粒和農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法、愈傷組織法、 蘸花法，基因槍法等常規(guī)方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經(jīng)組織培養(yǎng)的方法，獲得植物生長得到促進，抗逆性提高的轉基因植株。本發(fā)明方法重組的擬南芥光敏型啟動子AtHemAlP控制釀酒酵母Wfeml基因不需要設計葉綠體蛋白信號肽序列，因而，在轉基因植物中翻譯成的ALA合酶主要分布于植物線粒體中，而不是一般綠色植物的葉綠體中。本發(fā)明方法利用擬南芥光敏型啟動子AtHemAlP控制釀酒酵母Wfeml基因在轉基因植物中的表達隨著光照條件的變化而變化。YHeml基因在光照條件下的表達量明顯高于黑暗下。因而，在光照下，Wfeml基因編碼的ALA合酶可以在植物線粒體中將琥珀酰CoA和甘氨酸縮合為ALA，提高植物體內源ALA含量，從而促進植物的生長，提高植物對低溫、鹽脅迫、弱光、強光的抗性，同時又避免了黑暗中YHeml基因的表達和ALA及其代謝中產(chǎn)物的積累，因而，轉基因植株不會表現(xiàn)出光漂白現(xiàn)象。不僅生長發(fā)育正常，而且生物學產(chǎn)量和經(jīng)濟學產(chǎn)量均會明顯提高。 實驗證明，本發(fā)明的方法獲得的含有光敏型啟動子AtHemAlP和^feml基因的轉基因煙草、擬南芥、油菜、水稻、番茄、西瓜在正常條件下的生長勢、單株產(chǎn)量均優(yōu)于野生型植株。在逆境條件下，轉基因植株比野生型具有較強的抗逆性，具體表現(xiàn)為耐鹽、抗寒、耐弱光和耐強光等。


圖1為YF8631植物表達載體構建示意2為13840植物表達載體構建示意3為轉光敏型啟動子AtHemAlP和^feml基因T3代株系煙草Wfeml基因表達隨著光照時間的變化4為轉YF8631-YHeml煙草結果期延緩植株衰老情況圖5為轉YF3840-YHeml擬南芥鹽脅迫兩周的生長情況和萌發(fā)率比較圖6為正常光照條件下轉YF3840-YHeml擬南芥生長和結莢情況圖7為正常環(huán)境條件下盆栽轉YF8631-YHeml油菜越冬期抗凍性和返青期生長情況圖8為轉YF8631-YHeml油菜耐鹽性研究圖9為轉YF8631-YHeml油菜與野生型油菜角果長度和飽滿度的研究
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、轉光敏型啟動子AtHemAlP和^feml植物的獲得一、轉基因所采用的重組表達載體的構建1、擬南芥HemAl光敏型啟動子(AtHemAlP)的獲得根據(jù)Genbank中登錄的擬南芥HemAl基因啟動子的核苷酸序列(GenebankNo :AF295364)，以抽提的擬南芥的總DNA為模板，通過加入HindiII酶切位點的引物 (AtHemAlPZl :5，-CCCAAGCTTACCGAAATGTAGGAATCCCACTTC-3，和加入 BamHI 酶切位點的引物(AtHemAlPFl :5，-AGGATCCCAAAATCTCAATCTCCTCTCTGTC-3，)進行 PCR 擴增。擴增體系為 50 μ 1，含 IOmmol/L Tri-HCl pH 8. 3,50mmol · L-1KCl，2m mol · L-1Mg2Cl^SOymol · L-1 的各種dNTP，每種引物25pmol，200-500ng的DNA，以及IU的Taq聚合酶，擴增條件是 940C /IOmin預變性后，94°C /40s變性，72°C退火和延伸2min，共30個循環(huán)；72°C后延伸 IOmin0 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收1800bp左右的DNA片段，PCR產(chǎn)物進行日本TAKARA公司的pMDIS-T載體克隆，酶切鑒定后，對重組子中插入基因進行核苷酸全序列測定。結果表明，該片段與Genebank號為AM95364的核苷酸序列相同，為擬南芥 HemAl基因啟動子(AtHemAlP)的序列。2、釀酒酵母ALA合酶編碼基因(^feml)的獲得根據(jù)Genbank中登錄的釀酒酵母Heml基因的核苷酸序列(Genebank No AF295364, YSCHEM1AA)，鑒于Heml基因內部沒有內含子，以抽提的釀酒酵母的總DNA為模板，以引物(YHemlZl 5‘-AGGATCCATGCAACGCTCCATTTTTGCGAGGTTC-3‘)和(YHemlFl 5'-AAG AGCTCTTACTGCTTGATACCACTAGAAACCTC-3，)為引物進行PCR擴增。為了便于產(chǎn)物的克隆，分別在啟動子的5 ’和3 ’端加了 BamHI和McI限制性內切酶切點。擴增體系為50 μ 1，含10 X PCR buffer 5 μ L，10 X dNTP (2. 5mmol 'L^each) 5· O μ L，引物 YHemlZl 和 YHemlFl (IOOpmol .171) 各 0. 5 μ L，DNA 1 μ L，Taq 聚合酶(1U · μ Γ1) 2 μ L，DNA 模板 5 μ L，加雙蒸水至 50 μ L。擴增條件是94°C /IOmin預變性后，94°C /40s變性，72°C退火和延伸2min，共30個循環(huán)；72°C 后延伸lOmin。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 0% Agrose電泳，DNA回收試劑盒回收1647bp左右的DNA 片段，PCR產(chǎn)物進行日本TAKARA公司的pMD18_T載體克隆，酶切鑒定后，對重組子中的插入基因進行核苷酸全序列測定。結果表明，該片段與Genebank中YSCHEM1AA的核苷酸序列相同，證明確為釀酒酵母Heml基因的全長核苷酸序列。3、釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pYF8631構建如圖1所示，將測序正確的pMD18-T載體上的Heml基因經(jīng)BamHI和&icl雙酶切后，插入植物雙元載體 pYPXVhb(Li 等，Plant Cell Reports, 2005, 23 :710-715)，替換原先載體上的Vtib基因，構成載體pYF8630，隨后再將經(jīng)Hindi11和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl 基因啟動子AtHemAlP插入pYF8630載體的相應酶切點間。經(jīng)酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體PYF8631。4、釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pI3840構建如圖1所示，將測序正確的Heml基因經(jīng)BamHI和&icl雙酶切后，回收1647bp 的DNA片段，與相應酶切的pYF7716載體(郭兆奎等，西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)2008，36 58-64)相連，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動子AtHemAlP插入上述載體的相應酶切點間。經(jīng)酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體 PYK3840。二、轉光敏型啟動子AtHemAlP和^feml植物的獲得1、光敏型啟動子AtHemAlP控制的過量合成YHeml煙草、番茄和油菜的獲得將 pYF8631 載體通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 的介導轉入煙草、番茄和油菜中。具體方法如下所述
(1)煙草無菌苗的制備煙草品種‘K326，種子(美國Northup King Seed Company 生產(chǎn))用70%乙醇浸泡lmin，然后用5%的漂白粉(加兩滴Tween-20)消毒15分鐘，其間不斷搖動，然后用無菌水洗3遍，接種在MS培養(yǎng)基上。置于培養(yǎng)室中發(fā)芽(溫度22士2°C， 光照強度為150μπιΟ1 !^ 8_1，光/暗周期16h/ !)。待種子發(fā)芽后，培養(yǎng)30天后，用于轉化。(2)番茄無菌苗的制備挑選飽滿的番茄品種‘合作903’種子(浙江勿忘農(nóng)集團生產(chǎn))用流動的自來水浸泡1 后，用70%乙醇浸泡Imin和20%次氯酸鈉(加兩滴 Tween-20)消毒20分鐘，無菌水沖洗3_5次，并用無菌吸水紙略微吸干后，按30粒/瓶播種于MS培養(yǎng)基上。常溫暗培養(yǎng)出芽后，在溫度(25士 1)°C，光照強度36μπι01 ·πΓ2 · s、光周期16h/ !條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，用于轉化。(3)油菜無菌苗的制備挑選飽滿的油菜品種‘滬油-15’種子(浙江勿忘農(nóng)集團生產(chǎn))用70%乙醇浸泡Imin和25%次氯酸鈉(加兩滴Tween-20)消毒10分鐘，無菌水沖洗3-5次，并用無菌吸水紙略微吸干后，按30粒/皿播于MS培養(yǎng)基上。常溫暗培養(yǎng)出芽后， 在溫度(25 士 1)°C，光照強度βθμπιο ·!!!-2·^，光周期16h/ !條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，用于轉化。(4)農(nóng)桿菌菌株培養(yǎng)將PYF8631載體通過電擊方法導入根癌農(nóng)桿菌菌株 LBA4404(徐增富和李寶健，生物化學與生物物理進展，1996，23 =286-287)，構成新的農(nóng)桿菌工程菌AG200。-70°C保存的菌種AG200在含利福平Rf 50mg/L+Cm 10mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，于27°C下培養(yǎng)2 3d后，挑取直徑為Imm左右的1個單菌落接種于50ml 含利福平Rf 50mg/L+Cml0mg/L的YEB培養(yǎng)液中，27°C、200rpm下震蕩培養(yǎng)過夜。在27°C、 5000rpm離心8min收集菌體，棄上清夜后用MS液體培養(yǎng)液洗滌菌體兩次，備用。(5)農(nóng)桿菌遺傳轉化分別取煙草無菌葉片、番茄和油菜無菌子葉作為轉化的外植體，置于上述農(nóng)桿菌工程菌AG200菌液中，侵染8-lOmin。取出外植體用無菌濾紙吸干，再轉入覆有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基(MS+0. Img L^NAA+lmg Ll-BA)上暗培養(yǎng)48h_72h，培養(yǎng)溫度為22-25°C。將外植體轉接到篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每20d更換新的培養(yǎng)基，直至經(jīng)第二次篩選培養(yǎng)后分化出抗性芽。形成的抗性芽經(jīng)過GUS染色檢測，將GUS陽性芽切下，插入生根培養(yǎng)基中。生根完成后，置于自然光溫下練苗3-5d，再連同對照移栽到試驗田中。共得到轉基因煙草36株Ttl代植株，轉基因番茄17株Ttl代植株，轉基因油菜13株Ttl代植株。 Ttl代植株自花授粉，單株拷種。將Ttl代種子經(jīng)過Km抗性篩選，抗性苗經(jīng)過GUS染色，PCR, Southern雜交，RT-PCT檢測，選出陽性植株(T1)培養(yǎng)至開花結實，收集T1植株上所結種子， 依Ttl種子篩選方法繼續(xù)進行T1代種子篩選、種植和獲得T2代種子，最終得到獨立的純合的轉基因煙草，番茄，油菜種子。煙草轉化與篩選培養(yǎng)基共培養(yǎng)基MS+!3mgLl-BA第一次選擇培養(yǎng)基:MS+3mgL_16-BA+50mg L^1Km+IOOmg L-1Cb第二次選擇培養(yǎng)基:MS+3mgL_16-BA+IOOmg L^1Km+IOOmg L-1Cb生根培養(yǎng)基l/2MS+0.5mg Γ1 NAA番茄轉化與篩選培養(yǎng)基共培養(yǎng)基MS+0.Img L-1 NAA+Img L_16-BA
第一次選擇培養(yǎng)基:MS+0.5mg L_1ZT+0. 5mg L_1IAA+200mg r1Km+400mg L-1Cb第二次選擇培養(yǎng)基:MS+0.5mg L_1ZT+0. 5mg L_1IAA+400mg r1Km+200mg L-1Cb生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA0.Img Γ1油菜轉化與篩選培養(yǎng)基共培養(yǎng)基MS+0.Img L^1NAA+Img L_16-BA+5mg L-1AgNO3第一次選擇培養(yǎng)基:MS+0.Img L_1NAA+3mg L^e-BA+lOmg r1Km+400mg L-1Cb+5mg L-1AgNO3第二次選擇培養(yǎng)基:MS+0.Img L_1NAA+3mg L_16-BA+20mg r1Km+200mg L-1Cb+5mg L-1AgNO3生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA0.Img Γ1以上MS培養(yǎng)基均加瓊脂6. 5g/L，蔗糖30g/L，并用IN NaOH調節(jié)pH至5. 8。2、光敏型啟動子AtHemAlP控制的過量合成Wfeml擬南芥的獲得將pYK3840 載體通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 (馬立安和張忠明，長江大學學報(自科版)農(nóng)學卷2007,4 ) :41-44)介導的蘸花法轉入擬南芥中。具體方法如下所述擬南芥的培養(yǎng)擬南芥‘Columbia’型種子(美國俄亥俄州立大學的生物資源中心 ABRC生產(chǎn))用70%乙醇浸泡lmin，然后用5%的漂白粉(加兩滴Tween-20)消毒20分鐘。 其間，不斷搖動，然后用無菌水洗3編，接種在MS培養(yǎng)基上，置于4°C冰箱，進行2-3天的春化處理，然后至于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)兩周。將蛭石、黑土、珍珠巖按18 6 1的比例拌勻，裝于IOcm的塑料小盆，以營養(yǎng)液PNS浸濕待用。用鑷子將擬南芥幼苗按4 X 3cm移栽于濕潤的基質上，保鮮膜封口，培養(yǎng)2-3天，揭去保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)至抽薹開花，中途可視情況適當澆PNS營養(yǎng)液。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當次生苔長至2-lOcm(少數(shù)已經(jīng)開花)可用于遺傳轉化。培養(yǎng)條件為溫度22 士 2°C，光照強度為150μπιΟ1 ·πΓ2 · s"1, 光/暗周期16h/8h0農(nóng)桿菌的準備-70°C保存的轉入pI3840載體菌種工程菌株GV3101在含利福平 Rf50mg/L+Km 50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，于27°C下培養(yǎng)2 3d后，挑取直徑為Imm 左右的1個單菌落接種于50ml含利福平Rf 50mg/L+Km 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，27 °C、 200rpm下震蕩培養(yǎng)過夜。8000rpm，4°C，IOmin離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉化滲透液 (5%蔗糖，0. 05% Silwet L-77)，備用。擬南芥蘸花法轉化將擬南芥的花序浸入滲透液中，輕輕攪動約3 5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環(huán)境，置于 22°C培養(yǎng)室低光強度下生長M小時，即可正常培養(yǎng)。初次轉化四天后，可再進行一次轉化， 重復兩次。生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。共得到轉基因擬南芥30株Ttl代植株，自花授粉得到Ttl代的種子。將Ttl代種子經(jīng)過潮霉素抗性篩選，將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進行GUS活性檢測，PCR，RT-PCR檢測，選出陽性植株(Ttl)培養(yǎng)至開花結實，收集Ttl植株上所結T1種子，依Ttl種子篩選方法繼續(xù)進行T1代種子篩選、種植和獲得T2 代種子。3、光敏型啟動子AtHemAlP控制的過量合成Wfeml水稻的獲得將 pYK3840 載體通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EH105 (曹自力等，遺傳學報，2001J8 :352-358)的介導的愈傷組織法轉入水稻中。具體方法如下所述水稻愈傷組織的培養(yǎng)取水稻品種‘中花11’(上海市種子公司生產(chǎn))12-15天的未成熟種子，直接用75%的酒精浸泡Imin進行表面消毒，然后用5% NaClO溶液(加1_3 滴Tween 20)浸泡60min以上(最長可至2h)，并不時搖動，然后用無菌水沖洗4_5次。在超靜工作臺上用解剖刀和鑷子從滅菌后的未成熟種子中挑出未成熟胚，接種于誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。培養(yǎng)4-5天后，取培養(yǎng)4-5d的未成熟胚來源的初生愈傷組織立即浸入準備好的農(nóng)桿菌懸浮液中，侵染30min后，然后將愈傷組織在無菌濾紙上吸除多余的菌液，直接轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基于23°C黑暗條件下培養(yǎng)3-4d。將共培養(yǎng)的愈傷組織轉出，無菌水漂洗 3-4次，然后用無菌濾紙吸干多余水分，將愈傷組織轉入選擇培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)，兩周繼代一次。經(jīng)2-3代篩選后，選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到預分化培養(yǎng)基上進行預分化處理；暗培養(yǎng)5-7天后再將抗性愈傷組織轉移到分化培養(yǎng)基每天1 光照、他黑暗、28°C 條件下進行分化，再生的小苗剪去原有的根，在生根培養(yǎng)基(Rooting medium)上生根壯苗， 隨后移入人工氣候室盆栽，最初幾天保持濕度。轉基因水稻的栽培管理按照常規(guī)方法進行。 共得到轉基因水稻7株Ttl代植株，自花授粉得到Ttl代的種子。將Ttl代種子經(jīng)過潮霉素抗性篩選，將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進行GUS活性檢測，PCR，RT-PCR檢測，選出陽性植株(Ttl)培養(yǎng)至開花結實，收集Ttl植株上所結T1種子，依Ttl種子篩選方法繼續(xù)進行T1 代種子篩選、種植和獲得T2代種子。三、轉光敏型啟動子AtHemAlP和^feml植物的功能鑒定實例1、光敏型啟動子AtHemAlP控制^feml基因煙草的功能鑒定1、轉基因煙草YHeml基因表達隨著光照時間的變化圖為了檢測光敏型啟動子AtHemAlP控制^feml基因在光照下表達情況，對轉YF8631 的T3代煙草植株，隨著光照時間變化，YHeml基因表達情況進行半定量和實時熒光定量PCR 檢測。結果如圖2所示，無論是用半定量PCR檢測還是實時熒光定量PCR檢測，轉基因煙草有黑暗條件轉入光照條件下，YHeml基因的表達量迅速增加，光照證后達到最大值，隨后逐漸下降，當轉基因煙草轉入黑暗下2. 5h，YHeml基因的的表現(xiàn)出很低的轉錄水平，表明 YHeml基因在煙草中的表達受到光敏型啟動子AtHemAlP控制。2、轉基因煙草ALA合酶活性和ALA含量測定ALA 合酶活性和 ALA 含量測定用 Zavgorodnyaya 等(Plant J, 1997，12 :169-178) 方法，ALA合酶活性以每小時每毫克蛋白質催化生成Inmol的ALA(nmol mg—1 -h"1)為單位。表1轉基因煙草ALA-S活性和ALA含量測定
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權利要求
1.一種控制植物體內ALA合成，促進生長并提高抗逆性的轉基因方法，其特征在于，將擬南芥HemAl基因光敏型啟動子AtHemAlP和釀酒酵母ALA合酶基因Wfeml重組，通過植物表達載體轉入植物中，獲得到光合能力明顯提高，生長發(fā)育受到促進，并且延緩衰老，單株產(chǎn)量也比野生型植株明顯提高，同時抗逆性也得到提高的轉基因植物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中AtHemAlP核苷酸序列是Genebank中AM95364的全長序列；YHeml基因的編碼序列是Genebank中YSCHEM1AA全長序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中AtHemAlP和YHeml基因是通過植物表達載體 PYF8631或ρ (3840導入植物中的，其中釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體PYF8631構建為將測序正確的PMD18-T載體上的Heml基因經(jīng)BamHI和McI雙酶切后，插入植物雙元載體pYPXVhb，替換原先載體上的Vhb基因，構成載體pYF8630，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI 雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動子AtHemAlP插入pYF8630載體的相應酶切點間，經(jīng)酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體PYF8631 ；釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pI3840構建為將測序正確的Heml基因經(jīng)BamHI和McI雙酶切后，回收1647bp的DNA片段，與相應酶切的PYF7716載體相連，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動子AtHemAlP插入上述載體的相應酶切點間，經(jīng)酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體 PYK3840。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，所述的促進植物生長包括煙草、擬南芥、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓、蘋果和梨。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的方法所述的提高抗逆性包括耐鹽性，抗寒性，耐高溫性， 耐弱光性和耐強光性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制植物體內ALA生物合成、促進生長并提高植物抗逆性的轉基因方法，屬于基因工程領域。是將擬南芥HemA1基因光敏型啟動子和釀酒酵母菌5-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶基因(YHem1)通過植物表達載體轉入植物中。本發(fā)明通過提高光照下植物內源ALA合成量，促進葉綠素、亞鐵血紅素合成，避免黑暗中ALA以及其它卟啉中間物積累，從而避免植物光漂白現(xiàn)象，并且提高了植物對低溫、高溫、高光、弱光以及鹽脅迫耐受力。因而，不僅不影響轉基因植物的正常發(fā)育，而且提高了植物生物產(chǎn)量和經(jīng)濟學產(chǎn)量增加?？梢赃\用于擬南芥、煙草、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓等草本植物，也可以運用于蘋果、梨等木本植物。
文檔編號C12N15/82GK102168106SQ201010596008
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權日2010年12月20日
發(fā)明者姚泉洪, 張治平, 汪良駒 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學