專利名稱：一種可代謝木糖的釀酒酵母工程菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種可代謝木糖的釀酒酵母工程菌。
背景技術：
石油資源的日漸枯竭，使燃料乙醇的生產(chǎn)和應用在經(jīng)濟發(fā)展和戰(zhàn)略安全上顯示出 重大意義。同時，國際糧食價格的不斷飆升成為燃料乙醇大規(guī)模生產(chǎn)和推廣的瓶頸。自然 界豐富的植物纖維資源中，目前只有3-4%被有效利用。木糖在木質(zhì)纖維素水解物中含量高 達30%，是僅次于葡萄糖的一種單糖，充分利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，可以大大降低生產(chǎn)成本 (J. N. Nigam, 2001)。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為單細胞真核生物，易培養(yǎng)、生長 周期短，已廣泛應用于異源基因的表達。雖然釀酒酵母能夠高產(chǎn)乙醇并對木質(zhì)纖維素 水解液中的抑制物有較強抗性(Tang YQ et al.，2006)，但不能利用木糖，而只能利用 其異構體木酮糖，使釀酒酵母無法成為木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)的優(yōu)勢菌株。所以構建能 利用木糖產(chǎn)乙醇的釀酒酵母工程菌株的重要途徑之一是克隆天然利用木糖的酵母菌的 兩個關鍵酶基因，即木糖還原酶基因XYLl (xylose reductase)和木糖醇脫氫酶基因 XYL2 (xylitoldehydrogenase)，并使其在釀酒酵母細胞中表達。釀酒酵母以其高效的產(chǎn)乙醇能力和較強的乙醇耐受性成為乙醇和食品行業(yè)的重 要生產(chǎn)菌株。但其最適發(fā)酵溫度是25°C至30°C，在生產(chǎn)過程中往往需要向發(fā)酵罐噴灑大量 的冷凝水(Kiran Sree. et al.，2000a ；Sridhar etal.，2002)或使用其它手段加以降溫，這 無疑增加了生產(chǎn)成本和污染風險。乙醇發(fā)酵工業(yè)中，酵母發(fā)酵前將原料液降溫至30°C的成 本占總生產(chǎn)成本的30%左右，而若只降至37°C左右，則可降低10%的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可代謝木糖的釀酒酵母工程菌，該釀酒酵母工程菌可以木糖為 唯一碳源，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。一種釀酒酵母工程菌，包括宿主細胞和重組載體，其特征在于所述重組載體中包 含由第一啟動子、木糖還原酶基因、第二啟動子、木糖醇脫氫酶基因以及抗性標記基因依次 連接組成的基因表達盒。所述的第一啟動子為釀酒酵母磷酸丙糖異構酶啟動子(PTPI)，所述的第二啟動子 為釀酒酵母磷酸甘油激酶啟動子(PPGK)。該兩種啟動子均為組成型啟動子，不受葡萄糖抑 制，無需木糖誘導。所述的木糖還原酶基因的堿基序列如SEQ ID NO. 7所示，所述的木糖醇脫氫酶基 因的堿基序列如SEQ ID NO. 9所示。之所以采用P. stipitis作為基因來源，主要在于其 使用不同輔因子時的酶活比為0. 65(NADH/NADPH)，較其它酵母的這一比值更高，因此將其 木糖還原酶基因和木糖脫氫酶共表達于受體細胞中時，有助于減輕胞內(nèi)氧化還原不平衡情 況，從而減少副產(chǎn)物積累。
所述的抗性標記基因為G418抗性基因，便于釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。所述的宿主細胞為釀酒酵母CBS 1200，該細胞可耐高溫。所述的重組載體包含釀酒酵母的同源序列，重組載體能夠整合到宿主的染色體 中，提高遺傳穩(wěn)定性。所述的同源序列如SEQ ID NO. 13所示。能將基因以高拷貝數(shù)整合于 釀酒酵母rDNA重復序列上。本發(fā)明釀酒酵母工程菌可以同時表達木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，能夠以木糖為 唯一碳源生長，為后續(xù)構建木糖和葡萄糖共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工程菌株奠定了基礎，并可以該 工程菌株為基礎進一步篩選和改造，使其以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇，從而大大降低乙 醇的生產(chǎn)成本。


圖1為表達載體的P-R-K的物理圖譜；圖2為表達載體的pB-D的物理圖譜；圖3為表達載體P-RD-K的物理圖譜；圖4為表達載體H(-rDNA的物理圖譜；圖5為檢驗重組菌株為陽性菌株的電泳圖譜。
具體實施例方式實施例1啟動子、木糖還原酶基因和G418抗性基因表達盒的構建1、樹干畢赤酵母基因組DNA的提取將樹干畢赤酵母(Pichia stipitis CBS 5774)接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30°C、 180r/min培養(yǎng)16h，富集細胞。收集過夜培養(yǎng)的酵母細胞，STES緩沖液懸浮、洗滌后，重懸細胞；向酵母懸濁液中 加入一定比例酸洗玻璃珠及苯酚/氯仿，充分混合震蕩、離心后上層水相用乙醇沉淀；離心 后收集核酸沉淀，即為基因組DNA。2、PCR擴增木糖還原酶基因(XYLl)根據(jù)GeneBank上發(fā)布的XYLl序列(X59465. 1)，以上述提取的樹干畢赤酵母基因 組DNA為模板，利用上游引物Al和下游引物A2進行PCR擴增。上游引物Al，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中含有BamH I酶切位點；下游引物A2，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其中含有Apa I酶切位點。PCR 反應條件為94 "C 5min ；94 V 30s, 50 V 30s, 72 V lmin30s, 30 個循環(huán)； 72°C IOmin0測序結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物的堿基序列與GeneBank上發(fā)布的樹干畢赤酵母(CBS 5774)木糖還原酶基因XYL1(X59465. 1)序列具有100%的同源性。3、PCR 擴增 G418 基因(KanMX)根據(jù)GeneBank上發(fā)布的KanMX序列(S78175. 1)，以質(zhì)粒pUG6為模板，利用上游引 物Kl和下游引物K2進行PCR擴增。上游引物Kl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其中含有Mc I酶切位點；下游引物K2，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，其中含有Nhe I酶切位點。PCR 反應條件為94 "C 5min ；94 V 30s, 50 V 30s, 72 V lmin20s，30 個循環(huán)；72 "C IOmin。測序結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物的堿基序列與GeneBank上發(fā)布的KanMX序列 (S78175. 1)具有100%的同源性。4、啟動子、木糖還原酶基因和G418抗性基因表達盒的構建釀酒酵母磷酸丙糖異構酶啟動子(pTPI)為載體ρ (212上已有的。用限制性內(nèi)切酶BamH I, Apa I酶切XYLl片段和ρ (212質(zhì)粒，經(jīng)過"Γ4連接酶連 接后得到P-R質(zhì)粒；再用限制性內(nèi)切酶Me I，Nhe I酶切KanMX和P-R質(zhì)粒，經(jīng)過Τ4連接 酶連接后得到P-R-K。上述的酶切體系為DNA 50 μ 1dd 7jC 35 μ 1bufferlOy 1酶I 2· 5 μ 1酶ΙΙ2·5μ137°C 3h連接體系為DNA 片段4μ1載體片段4μ1 16°C連接過夜T4 連接酶0·4μ1Buffer :2μ 1dd 7jC 9. 6 μ 1實施例2含啟動子和木糖醇脫氫酶基因表達盒的構建1、釀酒酵母基因組DNA的提取將釀酒酵母CBS 1200接種于YPD液體培養(yǎng)基中，40°C、180r/min培養(yǎng)16h，富集細 胞。提取步驟參考實例12、磷酸甘油激酶啟動子(pPGK)的克隆根據(jù)GeneBank發(fā)布的磷酸甘油激酶啟動子(pPGK)序列(FJ415226. 1)，設計pPGK 的上下游引物PI、P2，以釀酒酵母基因組DNA為模板進行PCR擴增。上游引物Pl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，其中含有Apa I酶切位點；下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，其中含有EcoRV酶切位點。PCR 反應條件為 94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 70°C lmin, 30 個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR擴增得到的產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，該PCR產(chǎn)物與GeneBank中的序列比較，有一個堿基的突 變，該基因序列如SEQ ID NO. 7所示。3、樹干畢赤酵母木糖還原酶基因(XYL2)的克隆根據(jù)GeneBank上發(fā)布的XYL2序列(X55392. 1)，以上述提取的樹干畢赤酵母基因 組DNA為模板，利用上游引物Dl和下游引物D2進行PCR擴增。上游引物Dl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，其中含有EcoRV酶切位點；下游引物D2，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示，其中含有Mc I酶切位點。PCR 反應條件為94 "C 5min ；94 V 30s, 52 V 30s, 72 V 2minl0s, 30 個循環(huán)； 72°C IOmin0測序結(jié)果顯示，該PCR產(chǎn)物與GeneBank中的序列比較，有一個堿基的突變，該基因序列如SEQ ID NO. 10所示。4、含啟動子和木糖醇脫氫酶基因表達盒的構建首先用限制性內(nèi)切酶Apa I，EcoRV酶切pPGK片段和pBlueScript IISK (-)克隆 載體，經(jīng)過T4連接酶連接后得到p-P質(zhì)粒，再用限制性內(nèi)切酶EcoRV，Sac I酶切木糖還原 酶基因(XYU)和p-P質(zhì)粒，經(jīng)過T4連接酶連接后得到pB-D (酶切體系和連接體系同實施 例1)。實施例3釀酒酵母高效整合型表達載體的構建(P K-rDNA)1、釀酒酵母附加型表達載體的構建(P-RD-K)用限制性內(nèi)切酶Apa I，Sac I酶切質(zhì)粒P-R-K和pB_D片段，得到大片段 P-R-K(A-S)和小片段pPGK-XYL2(A-S)。經(jīng)過T4連接酶連接后得到釀酒酵母附加型表達載 體P-RD-K (酶切體系和連接體系同實施例1)。2、釀酒酵母rDNA序列的克隆根據(jù)GeneBank上發(fā)布的序列(Z73326. 1)中的18s4s位點，以釀酒酵母CBS 1200 基因組為模板，利用上游引物Rl和下游引物R2進行PCR擴增。上游引物Rl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示，其中含有Not I酶切位點；下游引物R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，其中含有Not I酶切位點。PCR 反應條件為94 "C 5min ；94 V 30s, 50 V 30s, 72 V lmin40s, 30 個循環(huán)； 72°C IOmin0將PCR片段連入pMD18_T載體(Takara公司)，得到TA-rDNA測序。測序結(jié)果 顯示，PCR產(chǎn)物的堿基序列與GeneBank上發(fā)布的序列(Z73326. 1)中18s4s位點序列具有 100%的同源性，該基因序列如SEQ ID N0. 13所示。3、釀酒酵母高效整合型表達載體的構建(P K-rDNA)用限制性內(nèi)切酶Not I酶切質(zhì)粒P-RD-K和TA-rDNA，得到大片段P-RD-K(NotI)和 小片段rDNA (NotI)。經(jīng)過T4連接酶連接后得到釀酒酵母整合型表達載體P K-rDNA (酶切 體系和連接體系同實施例1)。實施例4高效表達木糖還原酶基因(XYLl)和木糖醇脫氫酶基因(XYL2)基因的耐 熱釀酒酵母重組菌株的獲得1、釀酒酵母細胞的制備接種20mL液體YEPD培養(yǎng)基40°C培養(yǎng)16-1 ；接種過夜培養(yǎng)菌體50 μ 1至50mL新 鮮的液體YEPD培養(yǎng)基中40°C培養(yǎng)7- ，使菌體生長到對數(shù)生長中后期(0D· = 0. 8-1. 0)；2、釀酒酵母整合型表達載體H(-rDNA的線性化使用HpaI (Takara)內(nèi)切酶，將質(zhì)粒P KtDNA線性化處理，并回收和純化線性片 段。3、釀酒酵母的轉(zhuǎn)化使用電轉(zhuǎn)化的方法進行實驗，步驟如下將上述對數(shù)生長中后期的菌體3，OOOr/ min離心IOmin ；收集菌體倒掉上清，菌體用20mL冰冷的無菌水懸浮，洗滌一次；離心收 集菌體，用20mL冰冷的無菌水再洗滌一次；離心收集菌體，用ImL lmol/L冰冷的山梨醇 重新懸浮菌體，洗滌一次，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中；離心收集菌體，移液器吸凈上清，加入 0. 2mLlmol/L冰冷的山梨醇混勻菌體，使菌液呈濃漿狀；取0. 2 0. 4mL濃稠的菌懸液分 裝1.5mL的離心管(每管60 μ 1)，然后向每管中加入10 μ L(彡Iyg)質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴IOmin ；將轉(zhuǎn)化菌懸液全部轉(zhuǎn)入預冷的轉(zhuǎn)化池中，1. 5KV,25yF,200Q,5ms條件下電擊 ’馬 上向轉(zhuǎn)化菌懸液中加入ImL YPD液體，40°C孵育Ih ；離心后用500 μ L生理鹽水重懸菌體， 取100 μ L菌液涂布YEPX-G418平板。40°C培養(yǎng)3_5d，挑選G418抗性轉(zhuǎn)化子。同時對于沒 有加入質(zhì)粒的釀酒酵母細胞按同樣的方法進行電擊，按相同的量涂布在不含G418和含有 G418的YEPX平板上分別作為原始菌株再生情況以及陰性對照的觀察。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過5d的再 生，最終可以得到約6個轉(zhuǎn)化子/微克DNA，共30個轉(zhuǎn)化子。4、轉(zhuǎn)化子的表型鑒定挑選生長情況良好，個體大的轉(zhuǎn)化子至新鮮YEPX-G418液體培養(yǎng)基，180rpm/min, Mh，提取基因組DNA，以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，通過引物Al和A2、D1和D2、P1和D2進 行PCR，并以未轉(zhuǎn)化的原始釀酒酵母CBS 1200基因組DNA為模板做對照，結(jié)果顯示，如圖2 所示(取一個陽性轉(zhuǎn)化子為例)，陽性轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳得到大小約為 1. 2kb (XYLl)、1. 8kb (XYL2)、2· 6kb (pPGK_XYL2)的目的片段(第 3、5、7 道)，而陰性對照無 PCR產(chǎn)物(第2、4、6道)，證實目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入釀酒酵母CBS 1200的染色體中。實施例5重組菌株CBS 1200-P KtDNA穩(wěn)定性檢測將重組菌株在YEPX-G418平板上連續(xù)傳代7次以上后，提取單菌落基因組DNA進 行PCR驗證。結(jié)果顯示，PCR驗證結(jié)果并無變化，說明得到的轉(zhuǎn)化子可以穩(wěn)定遺傳。實施例6該工程菌在木糖為唯一碳源培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物檢測UCBS 1200-P K-rDNA 種子的制備挑取轉(zhuǎn)化子單菌落接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，置于 40°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng)36h。培養(yǎng)后的種子液于4000r/min下離心5min，收 集到的細胞沉淀用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基。2、代謝產(chǎn)物檢測代謝產(chǎn)物檢測試驗在裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行，發(fā)酵液接種 后初始細胞濃度為1. 2g/L(細胞干重計)，接種后將三角瓶置40°C，120r/min恒溫振蕩器內(nèi) 振蕩培養(yǎng)，瓶口塞上橡皮塞(插有7號針頭，以排出生成的CO2)以控制厭氧條件，培養(yǎng)過程 中取樣測定。發(fā)酵產(chǎn)物(乙醇、木糖醇等)及發(fā)酵液中殘?zhí)蔷筛咝б合嗌V法(HPLC)測 定。待測發(fā)酵液先經(jīng)lOOOOr/min條件下高速離心5min，上清液經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后 進樣測定，外標法定量。色譜條件為柱溫60°C，稀硫酸作流動相，流速0.4mL/min，進樣量 20 μ Lo經(jīng)檢測，時發(fā)酵液中，木糖利用率約為25%，乙醇產(chǎn)率為9. 594%，得率約為 20. 86%，木糖醇和甘油是發(fā)酵的副產(chǎn)物，且有較多木糖醇積累。
權利要求
1.一種釀酒酵母工程菌，包括宿主細胞和導入該宿主細胞的重組載體，其特征在于 所述重組載體中包含由第一啟動子、木糖還原酶基因、第二啟動子、木糖醇脫氫酶基因以及 抗性標記基因依次連接組成的基因表達盒。
2.根據(jù)權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述的第一啟動子為釀酒酵 母磷酸丙糖異構酶啟動子。
3.根據(jù)權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于第二啟動子為釀酒酵母磷酸 甘油激酶啟動子。
4.根據(jù)權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述的抗性標記基因為G418 抗性基因。
5.根據(jù)權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述的木糖還原酶基因的堿 基序列如SEQ ID NO. 7所示。
6.根據(jù)權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述的木糖醇脫氫酶基因的 堿基序列如SEQ ID NO. 9所示。
7.根據(jù)權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述的宿主細胞為釀酒酵母 CBS 1200。
8.根據(jù)權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述的重組載體包含釀酒酵 母的同源序列。
9.根據(jù)權利要求8所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述的同源序列如SEQID NO. 13所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可代謝木糖的釀酒酵母工程菌，包括宿主細胞和重組載體，其特征在于所述重組載體中包含由第一啟動子、木糖還原酶基因、第二啟動子、木糖醇脫氫酶基因以及抗性標記基因依次連接組成的基因表達盒。本發(fā)明釀酒酵母工程菌可以同時表達木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，能夠以木糖為唯一碳源生長，為后續(xù)構建木糖和葡萄糖共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工程菌株奠定了基礎，并可以該工程菌株為基礎進一步篩選和改造，使其以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇，從而大大降低乙醇的生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N1/19GK102127512SQ20101059602
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權日2010年12月20日
發(fā)明者夏黎明, 張曉陽, 杜風光, 高嵐 申請人:上海天之冠可再生能源有限公司, 浙江大學