專利名稱：細(xì)胞載體生物反應(yīng)器大量繁殖禽流感病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別是一種以微載體培養(yǎng)細(xì)胞在生物反應(yīng)器中大量繁殖病
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背景技術(shù)：
我國(guó)富源遼闊，農(nóng)業(yè)占我國(guó)的總產(chǎn)值的70%，養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)來源的重 要部分。伴隨著禽流行性感冒的發(fā)生和造成禽類的大面積死亡，我國(guó)的預(yù)防疫苗的生產(chǎn)遠(yuǎn) 遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)有的養(yǎng)殖業(yè)的市場(chǎng)需要，而且有的些疫苗效果不好更加重了疫苗產(chǎn)業(yè)困境局 面。因此加大力度進(jìn)行疫苗的研制，是當(dāng)前疫情的需要，是發(fā)展我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的需要。目前禽流感疫苗的病毒來源均來自于雞胚培養(yǎng)，其方法為流感病毒接種于9-10 日齡雞胚尿囊腔中，l-2d后冷胚收獲尿囊液，用福爾馬林處理，滅活試驗(yàn)和無菌試驗(yàn)合格 后，得到病毒原液，用于制備疫苗。由于其來源于雞胚培養(yǎng)，受到疫苗的有效性和雞胚抗體 的影響，制備的疫苗病毒效價(jià)低，預(yù)防免疫效果不佳，甚至免疫失敗，導(dǎo)致大規(guī)模的禽流感 流行。傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)，選用蛋胚進(jìn)行流感疫苗的生產(chǎn)，蛋胚抗性干擾嚴(yán)重，產(chǎn)品質(zhì)量和 產(chǎn)量受到嚴(yán)重的制約。我國(guó)的生物制品工業(yè)生產(chǎn)各類疫苗采用原代動(dòng)物細(xì)胞較多，而傳代細(xì)胞應(yīng)用較 少，到目前為止仍未見禽流感病毒采用細(xì)胞載體進(jìn)行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的報(bào)道和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞載體生物反應(yīng)器大量繁殖禽流感 病毒的方法，其提高了疫苗的純度和安全性。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種細(xì)胞載體生物反應(yīng)器制備禽流感病毒的方法， 其特征在于所述的禽流感病毒在置于生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體吸附生長(zhǎng)的傳代細(xì)胞中復(fù)制繁殖。所述的禽流感病毒是H9N2型禽流感病毒。所述的傳代細(xì)胞為MDCK細(xì)胞。所述的微載體采用Cytodexl。由上述工藝方法得到的禽流感病毒，其病毒血凝效價(jià)達(dá)到212。由上述禽流感病毒制得的禽流感疫苗。本發(fā)明建立以細(xì)胞為載體的在生物反應(yīng)器培養(yǎng)繁殖病毒的方法，所得的禽流感病 毒以及禽流感疫苗產(chǎn)品質(zhì)量均一，毒力穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)疫苗生產(chǎn)的自動(dòng)化控制，解決大規(guī)模生 產(chǎn)應(yīng)用的重大難題，徹底改變我國(guó)現(xiàn)行的流感疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，改變傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)病毒的 工藝，減少了由于雞胚造成的外源因子污染，病毒污染的問題，因雞胚等異源蛋白而造成的 干擾，提高疫苗的純度和安全性。


圖1是應(yīng)用本發(fā)明的方法，于光學(xué)顯微鏡下微載體上生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞感染馴化禽 流感病毒48小時(shí)后的情況；圖2是應(yīng)用本發(fā)明的方法，生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的禽流感疫苗抗原與抗禽流感 疫苗抗體免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果中心孔為抗體，倍比稀釋的濃縮純化禽流感疫苗加入周圍孔， 置于濕盒25°C保溫M小時(shí)，觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線結(jié)果可見，純化疫苗1 2倍， 1 4倍，1 8倍稀釋免疫擴(kuò)散呈陽性反應(yīng)；圖3是應(yīng)用本發(fā)明的方法所得禽流感疫苗的血凝效價(jià)滴度結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是一種細(xì)胞載體生物反應(yīng)器制備禽流感病毒的方法，所述的禽流感病毒在 傳代細(xì)胞中復(fù)制繁殖，該傳代細(xì)胞置于生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體吸附生長(zhǎng)。其中，禽流感病毒 采用的是H9N2型禽流感病毒，傳代細(xì)胞采用的是MDCK細(xì)胞，微載體采用Cytodexl。由上述工藝方法得到的禽流感病毒，其病毒血凝效價(jià)達(dá)到212。符合制備疫苗的要 求標(biāo)準(zhǔn)，可按常規(guī)工藝制備的禽流感疫苗?？蓱?yīng)用于生物反應(yīng)器大規(guī)模，自動(dòng)化，穩(wěn)定生產(chǎn) 病毒，從而制備禽流感疫苗。本發(fā)明中采用傳代細(xì)胞復(fù)制繁殖禽流感病毒，進(jìn)行細(xì)胞載體的自動(dòng)化生產(chǎn)，對(duì)疫 苗生產(chǎn)的發(fā)展、產(chǎn)業(yè)化、提高產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)品批量均質(zhì)穩(wěn)定有效等具有重要意義。以下通過具體的實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明并不限于此特定例 子。實(shí)施例使用試劑MDCK細(xì)胞購自ATCC庫，微載體Cytodexl購自Pharmacia Biotech AB Uppsala Sweden 公司(批號(hào)223429)。每克Cytodexl (干粉)溶脹后，表面積為4400cm2，微載體用量為5_10g/L。反應(yīng) 器中的細(xì)胞密度=4400X10X166666/1000 = 7. 3X 106個(gè)/ml。接種MDCK細(xì)胞密度就是 6. 6X106個(gè)/ml。H9N2型禽流感病毒用含有0. 025濃度胰酶DMEN培養(yǎng)基進(jìn)行1 1000 倍稀釋后接種到細(xì)胞中，吸附1小時(shí)后，加入無血清DMEN培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞接種病毒后分別 于M小時(shí)，36小時(shí)收毒，以50%換液量收獲病毒液，48小時(shí)全部收獲病毒液，停止生物反 應(yīng)器培養(yǎng)。培養(yǎng)參數(shù)攪拌速度40轉(zhuǎn)/min 細(xì)胞生長(zhǎng)期溶氧達(dá)到士50%，細(xì)胞表達(dá)期溶氧 士 40%。通氣量5L反應(yīng)器的通氣量可以達(dá)到lL/min并且無氣泡產(chǎn)生。pH控制在7.2。收取病毒感染細(xì)胞放置-20°C冰箱凍融三次，收取上清放置-20°C保存，檢測(cè)血凝 效價(jià)，光學(xué)顯微鏡下微載體上生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞感染禽流感病毒48小時(shí)，細(xì)胞有明顯的病變 產(chǎn)生，細(xì)胞開始融合，細(xì)胞膜界限不清，有病毒感染復(fù)制出現(xiàn)，如圖1所示。按常規(guī)方法檢 測(cè)血凝效價(jià)和病毒毒力測(cè)定，將病毒液加入1/1000甲醛滅活，濃縮純化采用瓊脂擴(kuò)散方法 檢測(cè)抗原性。單向瓊脂擴(kuò)散方法檢測(cè)抗原方法，溶化瓊脂糖，在水平桌上將溶化的瓊脂糖倒 在預(yù)復(fù)瓊脂玻板上，制成厚度約3 4mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后打園型孔，將抗體加 入中心孔，倍比稀釋的濃縮純化病毒加入周圍孔，置于濕盒25°C保溫M小時(shí)，觀察抗原抗 體產(chǎn)生的白色沉淀線，以此鑒定培養(yǎng)的禽流感病毒的抗原特異性。結(jié)果見圖2 中心孔為抗 體，倍比稀釋的濃縮純化病毒加入周圍孔，置于濕盒25°C保溫M小時(shí)，觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線結(jié)果可見，病毒1 2倍，1 4倍，1 8倍稀釋免疫擴(kuò)散呈陽性反應(yīng)。從抗 原性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)獲得的病毒具有非常好的病毒抗原性，對(duì)于制備疫苗具有明確的物質(zhì) ■石出。經(jīng)過鑒定后，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)繁殖的病毒為禽流感病毒的專署性和抗原的正確性后， 用于制備禽流感疫苗。應(yīng)用上述病毒制得疫苗的血凝效價(jià)滴度結(jié)果如圖3所示，圖中1-5 號(hào)為培養(yǎng)病毒血凝效價(jià)，6號(hào)為陰性對(duì)照，7號(hào)為病毒陽性對(duì)照，培養(yǎng)病毒血凝效價(jià)為212。在本發(fā)明中，禽流感病毒可以進(jìn)行MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)，并在生物反應(yīng)器中以微載體 為貼壁物生產(chǎn)穩(wěn)定毒力的病毒。使用本病毒，按常規(guī)制備工藝可有效的生產(chǎn)禽流感疫苗。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞載體生物反應(yīng)器制備禽流感病毒的方法，其特征在于所述的禽流感病毒 在置于生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體吸附生長(zhǎng)的傳代細(xì)胞中復(fù)制繁殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞載體生物反應(yīng)器制備禽流感病毒的方法，其特征在于 所述的禽流感病毒是H9N2型禽流感病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞載體生物反應(yīng)器制備禽流感病毒的方法，其特征在于 所述的傳代細(xì)胞為MDCK細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞載體生物反應(yīng)器制備禽流感病毒的方法，其特征在于 所述的微載體采用Cytodexl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞載體生物反應(yīng)器制備禽流感病毒 的方法，其特征在于繁殖所得的禽流感病毒，可在MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)其病毒血凝效價(jià)達(dá)到 212。
6.一種禽流感疫苗，其特征在于由權(quán)利要求5所述方法制得的禽流感病毒制備而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了了一種在置于生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體吸附生長(zhǎng)的傳代細(xì)胞中復(fù)制繁殖禽流感病毒的方法。本發(fā)明建立以細(xì)胞為載體的在生物反應(yīng)器培養(yǎng)繁殖病毒的方法，所得的禽流感病毒以及禽流感疫苗產(chǎn)品質(zhì)量均一，毒力穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)疫苗生產(chǎn)的自動(dòng)化控制，解決大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的重大難題，徹底改變我國(guó)現(xiàn)行的流感疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，改變傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)病毒的工藝，減少了由于雞胚造成的外源因子污染，病毒污染的問題，因雞胚等異源蛋白而造成的干擾，提高制得疫苗的純度、安全性和免疫效果，在預(yù)防禽流感發(fā)生中可起到重要的作用。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102127524SQ201010596058
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者任政華, 元少春, 馮宇超, 吳赟, 周亮, 周茂軍, 張仁偉, 強(qiáng)媛媛, 徐安龍, 潘武廣, 王磊, 王菲菲, 覃夢(mèng)穎, 陳枚花 申請(qǐng)人:中山大學(xué)