專利名稱：一種人肺細(xì)胞beas-2b/cyp2a13及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人重組基因肺上皮細(xì)胞，特別涉及一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
選擇一個(gè)理想的模型是做好科研工作的必備條件，細(xì)胞無疑是科研中比較理想、 也很常用的研究模型。一方面單一的細(xì)胞可減少實(shí)驗(yàn)間的誤差，保證研究結(jié)果的可控性和可重復(fù)性；另一方面細(xì)胞試驗(yàn)周期短、成本低、實(shí)驗(yàn)條件要求不高。因此備受廣大科研工作者的青睞。隨著研究的不斷深入，人類已進(jìn)入后基因組研究時(shí)代，其核心內(nèi)容就是研究基因的功能。由于大部分細(xì)胞系中特定蛋白低表達(dá)或不表達(dá)，因此亟需構(gòu)建高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞模型。目前一般采用腺病毒的方法構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞，但往往效果不盡人意。主要是由于瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞，目的蛋白的表達(dá)不穩(wěn)定，且不同實(shí)驗(yàn)間的差異有時(shí)非常大。此外，用腺病毒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的效率低、成果率小，往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，亟需使用穩(wěn)定可靠的載體系統(tǒng)通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和單克隆篩選，以獲得穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白的特定細(xì)胞。鑒于上述因素，本發(fā)明利用新型慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人細(xì)胞色素P450 2A13 (CYP2A13)的肺支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)，簡稱為BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞，以期為研究藥物代謝活化作用以及呼吸系統(tǒng)腫瘤及分子機(jī)制提供理想的細(xì)胞模型。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明采用新型慢病毒系統(tǒng)來構(gòu)建細(xì)胞模型，具體來說提供一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/ CYP2A13及其應(yīng)用。一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，該細(xì)胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO C2010127 ；保藏時(shí)間為2010年12月7日。保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13的制備方法，其特征在于具體制備步驟如下
A. pLJMl-GFP-CYP2A13質(zhì)粒構(gòu)建及驗(yàn)證
通過內(nèi)切酶雙酶切以及酶連的方法構(gòu)建含有目的CYP基因的慢病毒質(zhì)粒 pLJMl-GFP-CYPs,即對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的pFastBac 1-CYP2A13質(zhì)粒與慢病毒專用空載質(zhì)粒 pLJMl-GFP同時(shí)進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物后分別進(jìn)行酶連，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素篩選，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒使用各基因特異引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證；B.慢病毒載體包裝以及感染BEAS-2B細(xì)胞
傳細(xì)胞至60mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)到80-90%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物=DMEM無血清，無雙抗，轉(zhuǎn)染每皿的復(fù)合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs質(zhì)粒、3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast轉(zhuǎn)染試劑，將復(fù)合物加至培養(yǎng)皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混勻，將此細(xì)胞放至37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6- 后更換新鮮完全培養(yǎng)基； 轉(zhuǎn)染24h后，通過觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況確定轉(zhuǎn)染效率；收集病毒上清，此即為含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用該完整慢病毒上清過濾后感染BEAS-2B細(xì)胞，同時(shí)加入10ug/mL的polybrene和HEPES ；感染24h后重復(fù)感染一次。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) CYP2A13 的 BEAS-2B 細(xì)胞 BEAS-2B/CYP2A13 ；
C.BEAS-2B/CYP2A13 細(xì)胞的驗(yàn)證
分別收取慢病毒感染成功后一周和兩周的各BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞總蛋白，使用 CYP2A13的特異性抗體，采用免疫印跡方法驗(yàn)證BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞中的蛋白表達(dá)；
D.流式細(xì)胞儀分選BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞株
為保證轉(zhuǎn)染細(xì)胞的純度，使用流式細(xì)胞儀對(duì)BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞株進(jìn)行了 GFP陽性細(xì)胞分選；未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞無熒光，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，通過分選，將熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的細(xì)胞分選出來，以保證細(xì)胞為100%轉(zhuǎn)染細(xì)胞；
E.BEAS-2B/CYP2A13單克隆細(xì)胞的挑選及驗(yàn)證
將GFP陽性的BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞，以每孔1個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 結(jié)果7-10天后，對(duì)形成單克隆的細(xì)胞進(jìn)行放大培養(yǎng)，直到細(xì)胞滿足實(shí)驗(yàn)和保存要求為止； 對(duì)篩選出的單克隆細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，選取CYP2A13蛋白表達(dá)高且穩(wěn)定的細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)和保存之用。一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13的應(yīng)用，其特征在于該細(xì)胞對(duì)于CYP2A13的特征性底物AFBl反應(yīng)的高效敏感性，可運(yùn)用于任何研究CYP2A13的功能及其在環(huán)境化學(xué)物致呼吸系統(tǒng)腫瘤的效應(yīng)及機(jī)制上，也可用于相關(guān)藥物的活性篩選及研發(fā)。
有益效果
1.本發(fā)明采用新型慢病毒系統(tǒng)來構(gòu)建細(xì)胞模型。該體系具有如下優(yōu)勢高效轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到95%以上，且片段不已丟失；包裝的病毒系統(tǒng)可侵染多種細(xì)胞類型，包括非分化細(xì)胞和難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(如原代細(xì)胞、血細(xì)胞、干細(xì)胞等)；包裝基因整合到基因組 DNA上，表達(dá)水平高，變異率低，不干擾細(xì)胞的正常功能；表達(dá)穩(wěn)定、可遺傳。2、本發(fā)明以細(xì)胞色素P450 2A13 (CYP2A13)為目的基因，以永生化的人正常肺細(xì)胞(BEAS-2B)作為載體細(xì)胞，利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的BEAS-2B細(xì)胞 (BEAS-2B/CYP2A13)并獲得成功。通過基因、蛋白及功能研究，結(jié)果顯示該細(xì)胞具有表達(dá)穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏等特點(diǎn)，是研究藥物代謝活化作用以及呼吸系統(tǒng)腫瘤及分子機(jī)制的理想模型， 值得推廣應(yīng)用。3、在國內(nèi)外率先利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的BEAS-2B細(xì)胞，這是本發(fā)明最重要的關(guān)鍵技術(shù)。該技術(shù)相比其它病毒載體系統(tǒng)而言，具有轉(zhuǎn)染效率高、表達(dá)穩(wěn)定、易于篩選等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于轉(zhuǎn)染永生化的原代細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu)勢。4、利用該技術(shù)，可以構(gòu)建任何穩(wěn)定表達(dá)目的基因的原代細(xì)胞或細(xì)胞株，為基因的功能研究及
疾病的機(jī)制研究提供了重要的載體，一旦推廣，必將產(chǎn)生顯著的社會(huì)效益和可觀的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1 PLJM1-GFP-CYP2A13重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證。隨機(jī)選擇3個(gè)克隆載體，利用CYP2A13 引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)質(zhì)粒都在預(yù)期大小(1500bp)的位置出現(xiàn)了明亮的條帶， 提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖中M為DNA Maker。圖2感染后不同時(shí)間細(xì)胞中GFP蛋白的表達(dá)情況。分別在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后4 天和1周，運(yùn)用熒光顯微鏡通過觀察熒光蛋白GFP的強(qiáng)度評(píng)價(jià)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。圖中所示， 不管是BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞還是空載細(xì)胞(BEAS-2B/VeCtor)，轉(zhuǎn)染后1周明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)然后4天，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無熒光。圖3 BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞的蛋白表達(dá)驗(yàn)證。采用免疫印跡法檢測細(xì)胞中 CYP2A13的表達(dá)情況，并以Tubulin作為內(nèi)參，其中1和2分別為轉(zhuǎn)染后1周和2周的細(xì)胞； P為陽性對(duì)照，是體外表達(dá)的CYP2A13微粒體蛋白；V為空載細(xì)胞BEAS-2B/VeCtor ；N為未轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細(xì)胞。圖4各轉(zhuǎn)染細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。其中左圖為未轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度很弱，右圖為BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞明顯右移。以BEAS-2B細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為分界線，將分界線右側(cè)的細(xì)胞分選出來，已獲得100%轉(zhuǎn)染效率的目的細(xì)胞。圖5 BEAS-2B/CYP2A13單克隆細(xì)胞的基因和蛋白表達(dá)驗(yàn)證。其中圖A為CYP2A13 的蛋白表達(dá)驗(yàn)證，1-7分別為各細(xì)胞株挑選的單隆隆細(xì)胞蛋白；圖B為6號(hào)和7號(hào)單克隆細(xì)胞的基因表達(dá)驗(yàn)證；圖C為6號(hào)和7號(hào)單克隆細(xì)胞的蛋白驗(yàn)證。GADPH為內(nèi)參，V為空載細(xì)胞，N為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；P為陽性對(duì)照，M為DNA Marker。圖6 AFBl對(duì)BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞的毒性效應(yīng)。其中圖A為不同濃度AFBl處理M小時(shí)后細(xì)胞的活性變化，圖B為利用IOOnM的AFBl處理不同時(shí)間后細(xì)胞的活性變化， Vector表示空載細(xì)胞，是BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞的對(duì)照細(xì)胞。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1
1. PLJM1-GFP-CYP2A13質(zhì)粒構(gòu)建及驗(yàn)證
通過內(nèi)切酶雙酶切以及酶連的方法構(gòu)建含有目的CYP基因的慢病毒質(zhì)粒 pLJMl-GFP-CYPs,即對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的pFastBac 1-CYP2A13質(zhì)粒與慢病毒專用空載質(zhì)粒 pLJMl-GFP同時(shí)進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物后分別進(jìn)行酶連，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素篩選，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒使用各基因特異引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。 2.慢病毒載體包裝以及感染BEAS-2B細(xì)胞傳細(xì)胞至60mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)到80-90 %融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物=DMEM (無血清，無雙抗)，轉(zhuǎn)染每皿的復(fù)合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs質(zhì)粒、 3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast轉(zhuǎn)染試劑，將復(fù)合物加至培養(yǎng)皿中的DMEM 液面下，吹打3-4次混勻，將此細(xì)胞放至37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6- 后更換新鮮完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24h后，通過觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況確定轉(zhuǎn)染效率。收集病毒上清，此即為含有^ ^基因的完整慢病毒上清。使用該完整慢病毒上清過濾后感染BEAS-2B細(xì)胞，同時(shí)加入10ug/mL的polybrene和HEPES。感染24h后重復(fù)感染一次。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) CYP2A13 的 BEAS-2B 細(xì)胞(BEAS-2B/CYP2A13)。3. BEAS-2B/CYP2A13 細(xì)胞的驗(yàn)證
分別收取慢病毒感染成功后一周和兩周的各BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞總蛋白，使用 CYP2A13的特異性抗體，采用免疫印跡方法驗(yàn)證BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。4.流式細(xì)胞儀分選BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞株
為保證轉(zhuǎn)染細(xì)胞的純度，使用流式細(xì)胞儀對(duì)BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞株進(jìn)行了 GFP陽性細(xì)胞分選。未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞無熒光，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，通過分選，將熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的細(xì)胞分選出來，以保證細(xì)胞為100%轉(zhuǎn)染細(xì)胞。5. BEAS-2B/CYP2A13單克隆細(xì)胞的挑選及驗(yàn)證
將GFP陽性的BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞，以每孔1個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 結(jié)果7-10天后，對(duì)形成單克隆的細(xì)胞進(jìn)行放大培養(yǎng)，直到細(xì)胞滿足實(shí)驗(yàn)和保存要求為止。 對(duì)篩選出的單克隆細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，選取CYP2A13蛋白表達(dá)高且穩(wěn)定的細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)和保存之用。該細(xì)胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO C2010127。 保藏時(shí)間為2010年12月7日。保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。結(jié)果人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13的構(gòu)建
通過對(duì)重組質(zhì)粒使用CYP2A13的特異引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，可見各PCR產(chǎn)物片段與基因長短一致，證實(shí)pLJMl-GFP-CYPs各質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)；利用該質(zhì)粒感染細(xì)胞4天和1 周，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無熒光，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功并具有較高的感染效率(圖2)；采用CYP2A13的特異性抗體對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CYP2A13蛋白進(jìn)行免疫印跡法驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所挑選的細(xì)胞都高表達(dá)CYP2A13細(xì)胞，而空載細(xì)胞核未轉(zhuǎn)染細(xì)胞則不表達(dá)CYP2A13，結(jié)果提示細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)成功(圖3)；為了獲得單克隆的BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照，將熒光強(qiáng)度陽性的細(xì)胞分選出來(圖4);隨后對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選，并分別運(yùn)用免疫印跡法和RT-PCR法對(duì)單克隆細(xì)胞的CYP2A13蛋白和mRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞都較好地表達(dá)了 CYP2A13蛋白(圖5A)，所挑選的單克隆細(xì)胞都穩(wěn)定高表達(dá) CYP2A13 mRNA (圖5B)和CYP2A13蛋白(圖5C)，結(jié)果提示單克隆的BEAS-2B/CYP2A13構(gòu)建成功。實(shí)施例2
1.細(xì)胞對(duì)AFBl作用的劑量依賴性運(yùn)用研究
利用實(shí)施例1獲得的BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞，以空載細(xì)胞BEAS_2B/Vector為對(duì)照，分別給予細(xì)胞0、10、100、1000和10,000 nM的AFBl，處理24小時(shí)，然后采用MTT法檢測各劑量處理下的細(xì)胞活性，評(píng)價(jià)細(xì)胞不同劑量AFBl處理下的毒性效應(yīng)，構(gòu)建劑量-效應(yīng)關(guān)系。
2.細(xì)胞對(duì)AFBl作用的時(shí)間依賴性運(yùn)用研究
利用實(shí)施例1獲得的BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞，以空載細(xì)胞BEAS_2B/Vector為對(duì)照，運(yùn)用100 nM AFBl分別處理細(xì)胞M、48和72小時(shí)，然后采用MTT法檢測各時(shí)間點(diǎn)處理下的細(xì)胞活性，評(píng)價(jià)細(xì)胞在AFBl處理不同時(shí)間下的毒性效應(yīng)，構(gòu)建時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13的運(yùn)用研究
由圖6A可見，相對(duì)于空載細(xì)胞BEAS-2B/Vector而言，BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞對(duì)AFBl 十分敏感，從最低濃度起，其細(xì)胞活性均顯著低于BEAS-2B/VeCtor細(xì)胞(P<0.01)，半數(shù)抑制濃度(IC5tl)為350nM，而BEAS_2B/Vector細(xì)胞在IOOOOnM的AFBl時(shí)仍然保持95%以上的細(xì)胞活性。如圖5B所示，隨著時(shí)間的延長，BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞的活性逐漸下降，而 BEAS-2B/VeCtor細(xì)胞則無明顯改變；在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，BEAS-2B/CYP2A13的細(xì)胞活性均顯著低于BEAS-2B/Vector細(xì)胞(P<0. 01)。結(jié)果證明，該BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞對(duì)AFBl的反應(yīng)是靈敏的，是理想的細(xì)胞模型，可適用于CYP2A13的功能研究以及藥物篩選和活性研究。
權(quán)利要求
1.一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，該細(xì)胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: C2010127。
2.一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13的制備方法，其特征在于具體制備步驟如下A.pLJMl-GFP-CYP2A13質(zhì)粒構(gòu)建及驗(yàn)證通過內(nèi)切酶雙酶切以及酶連的方法構(gòu)建含有目的CYP基因的慢病毒質(zhì)粒 pLJMl-GFP-CYPs,即對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的pFastBac 1-CYP2A13質(zhì)粒與慢病毒專用空載質(zhì)粒 pLJMl-GFP同時(shí)進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物后分別進(jìn)行酶連，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素篩選，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒使用各基因特異引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證；B.慢病毒載體包裝以及感染BEAS-2B細(xì)胞傳細(xì)胞至60mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)到80-90 %融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物=DMEM無血清，無雙抗，轉(zhuǎn)染每皿的復(fù)合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs質(zhì)粒、3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast轉(zhuǎn)染試劑，將復(fù)合物加至培養(yǎng)皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混勻，將此細(xì)胞放至37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6- 后更換新鮮完全培養(yǎng)基； 轉(zhuǎn)染24h后，通過觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況確定轉(zhuǎn)染效率；收集病毒上清，此即為含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用該完整慢病毒上清過濾后感染BEAS-2B細(xì)胞，同時(shí)加入10ug/mL的polybrene和HEPES ；感染24h后重復(fù)感染一次；構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) CYP2A13 的 BEAS-2B 細(xì)胞 BEAS-2B/CYP2A13 ；C.BEAS-2B/CYP2A13 細(xì)胞的驗(yàn)證分別收取慢病毒感染成功后一周和兩周的各BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞總蛋白，使用 CYP2A13的特異性抗體，采用免疫印跡方法驗(yàn)證BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞中的蛋白表達(dá)；D.流式細(xì)胞儀分選BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞株為保證轉(zhuǎn)染細(xì)胞的純度，使用流式細(xì)胞儀對(duì)BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞株進(jìn)行了 GFP陽性細(xì)胞分選；未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞無熒光，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，通過分選，將熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的細(xì)胞分選出來，以保證細(xì)胞為100%轉(zhuǎn)染細(xì)胞；E.BEAS-2B/CYP2A13單克隆細(xì)胞的挑選及驗(yàn)證將GFP陽性的BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞，以每孔1個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 結(jié)果7-10天后，對(duì)形成單克隆的細(xì)胞進(jìn)行放大培養(yǎng)，直到細(xì)胞滿足實(shí)驗(yàn)和保存要求為止； 對(duì)篩選出的單克隆細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，選取CYP2A13蛋白表達(dá)高且穩(wěn)定的細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)和保存之用。
3.一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13的應(yīng)用，其特征在于利用CYP2A13的特征性底物黃曲霉毒素Bl對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測試；使用0-10,000 nM的AFB1，處理細(xì)胞對(duì)h，采用MTT法評(píng)價(jià)劑量-效應(yīng)關(guān)系；使用100 nM處理細(xì)胞M-72小時(shí)，采用MTT法評(píng)價(jià)時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；通過與空載細(xì)胞BEAS-2B/Vector進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)BEAS-2B/CYP2A13細(xì)胞對(duì)AFBl的敏感性。
全文摘要
本發(fā)明涉及人重組基因肺上皮細(xì)胞，特別涉及一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13及其應(yīng)用。一種人肺細(xì)胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，該細(xì)胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOC2010127。在國內(nèi)外率先利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的BEAS-2B細(xì)胞，這是本發(fā)明最重要的關(guān)鍵技術(shù)。該技術(shù)相比其它病毒載體系統(tǒng)而言，具有轉(zhuǎn)染效率高、表達(dá)穩(wěn)定、易于篩選等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于轉(zhuǎn)染永生化的原代細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu)勢。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102168061SQ201010596659
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者李孜音, 李建民, 楊雪嬌, 王守林, 陸慧媛 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)