專利名稱：一種李斯特菌噬菌體溶壁酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種李斯特菌噬菌體溶壁酶(Endolysin 或稱裂解酶)及其作為食品添加成分在食品中的應(yīng)用，尤其是能夠特異性裂解食品中污染的多種李斯特菌溶壁酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
李斯特菌(Listeria)是一種能夠引起動(dòng)物和人李斯特菌病的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，目前國(guó)際公認(rèn)的李斯特菌共有六個(gè)種，其中單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是最重要的食源性人獸共患病原菌。調(diào)查研究表明，96%的李斯特菌病例都是由Lm中l(wèi)/2a，l/2b和4b血清型引發(fā)的，主要表現(xiàn)為胃腸炎、敗血癥、腦膜腦炎和流產(chǎn)等，死亡率高達(dá)25-30%。在自然界中，Lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰場(chǎng)廢棄物及動(dòng)物源食品中(肉、奶及其制品、海產(chǎn)品等)，且與大多數(shù)人源病原菌不同的是Lm在低溫環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖(如2 8°C )，是冷藏食品以及即食(Ready-To-Eat，RTE)食品中威脅人類健康的重要病原菌之一。噬菌體是一類細(xì)菌依賴性的病毒，又稱細(xì)菌病毒。裂解性噬菌體感染細(xì)菌后，可在宿主菌內(nèi)快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。溶壁酶(^idolysin)是雙鏈DNA噬菌體所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌體表達(dá)的一類肽糖水解酶，該酶通過(guò)水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽糖上糖與肽間的酰胺鍵或肽內(nèi)氨基酸殘基間的連鍵最終使宿主細(xì)胞裂解。溶壁酶不僅特異性作用于宿主，且作用時(shí)間短，作用譜較噬菌體廣。溶壁酶具有高效、特異且不產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，目前在食品及醫(yī)藥行業(yè)已有成功應(yīng)用的報(bào)道。李斯特菌噬菌體endolysin能夠特異性裂解李斯特菌，因而具有殺菌作用。在食品中，李斯特菌溶壁酶能夠作為抗菌劑來(lái)控制細(xì)菌污染，具有潛在的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼李斯特菌噬菌體溶壁酶。技術(shù)方案一種李斯特菌噬菌體溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列為kq ID NO. 2。一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為kq ID NO. 1。一種表達(dá)李斯特菌噬菌體溶壁酶的制備方法，其特征在于步驟1)中采用引物 5，-A TATGGA TCC ATG GTA AAA TAT ACC-3，見 kq ID NO. 3 和引物 5，-A AGT AAG CTT TTA TTTCTT GAT AAC TGC TCC-3’ Ikq ID NO. 4從李斯特菌噬菌體基因組中擴(kuò)增李斯特菌噬菌體溶壁酶基因；具體步驟如下
1)從李斯特菌噬菌體基因組中擴(kuò)增李斯特菌噬菌體溶壁酶基因；2)構(gòu)建表達(dá)李斯特菌噬菌體溶壁酶的重組表達(dá)載體；3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到表達(dá)李斯特菌噬菌體溶壁酶的工程菌；4)異丙基1-1硫代- β呋哺半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因表達(dá)產(chǎn)物；5)將重組基因表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)鎳柱親和層析純化分離，得到重組的李斯特菌噬菌體溶壁酶lysZ5 ；6)將純化的溶壁酶lysZ5產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒進(jìn)行去毒處理(彡0. OlEU/ PgR 毒素)O所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于用于抑制李斯特菌污染和過(guò)度生長(zhǎng)的量。所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于將純化的溶壁酶產(chǎn)物制成稀釋液，用于對(duì)食品、生產(chǎn)環(huán)境或生產(chǎn)器具，防止食品加工過(guò)程中造成的李斯特菌污染。所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于所述的食品為由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于以重組表達(dá)的李斯特菌噬菌體溶壁酶產(chǎn)物制成殺菌劑。所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于將純化的溶壁酶產(chǎn)物與賦形劑復(fù)配后，用來(lái)抑制食品中李斯特菌的污染。所述原核細(xì)胞表達(dá)載體為pET_28a (+)。所述溶壁酶基因被插入pET48a(+)的EcoRI和Hind III酶切位點(diǎn)。所述的工程菌為大腸桿菌BL21 (DE3)，培養(yǎng)溫度為37°C。所述誘導(dǎo)表達(dá)所用的誘導(dǎo)劑為IPTG，誘導(dǎo)濃度為0. 1 1. 0 μ mol/L,誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為^ 30°C。所述的分離純化步驟包括鎳親和層析。有益效果利用生物工程技術(shù)開發(fā)能夠高效殺滅李斯特菌的酶制劑，該制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用，能夠特異性的滅活多種食源性李斯特菌，為目前防控食品中李斯特菌污染提供一種安全、無(wú)毒副作用的酶制劑來(lái)源。


圖1溶壁酶LysZ5基因的構(gòu)建和鑒定泳道1 :pET28a (+)載體EcoRI酶切鑒定泳道2 重組質(zhì)粒pET_lysZ5 EcoR Ι/HindIII雙酶切鑒定M=IKb DNA ladder圖2重組溶壁酶LysZ5表達(dá)產(chǎn)物的鑒定分析泳道1 誘導(dǎo)表達(dá) DE3 (pET-IysZ5) 0. 5mM IPTG泳道2 誘導(dǎo)表達(dá) DE3 (pET_lysZ5) 1. OmM IPTGM 蛋白分子質(zhì)量Maker
圖3重組溶壁酶LysZ5對(duì)李斯特菌的殺菌能力分析圖4重組溶壁酶LysZ5在食品的中殺菌效果分析
具體實(shí)施例方式本發(fā)明試驗(yàn)用噬菌體宿主菌單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,保藏號(hào)GIM1. 228)、威爾氏李其jf 特菌(Listeria welshimeri,保藏號(hào) GIM 1. 231)及英諾克李斯特菌(Listeria innocua，保藏號(hào)GIM 1. 230)購(gòu)自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。副傷寒沙門菌(ATCC 50073)、腸炎沙門菌(ATCC 13073) 以及大腸桿菌(ATCC 2592 均購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心(ATCC)。綿羊李斯特菌 Lv-31 (Listeria ivanovii)本室分離鑒定并保存。實(shí)施例1 溶壁酶LysZ5基因(lysZ5)的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建a、首先通過(guò)PGE/NaCl方法沉淀并獲得高純度的李斯特菌噬菌體(保藏號(hào)=CCTCC M2010003)，再用λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑盒(BIOMED)提取其基因組DNA (具體按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)；設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物Ζ5-1 :5，-A TAT GGA TCC ATG GTA AAA TAT ACC-3’Z5-2 :5’ -A AGT AAG CTT TTA TTT CTT GAT AAC TGC TCC-3’ ；用上述特異性引物擴(kuò)增全長(zhǎng)序列，瓊脂糖電泳，鑒定擴(kuò)增片段的大??；b、切膠回收(11Λ片段)擴(kuò)增正確的目的片段，膠回收試劑盒將片段純化回收，并將該片段與PUM-T載體于16°C連接過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素(100yg/ml)的平板，并將轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，將其命名為溶壁酶 LysZ5基因，其核苷酸序列為Seq ID NO. 1 ；C、將測(cè)序列正確的片段用限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindIII進(jìn)行雙酶切，37°C，水浴孵育池，瓊脂糖電泳，膠回收試劑盒將片段純化回收，并將該片段與pET28a(+)載體于16°C連接過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含有卡納青霉素(100 μ g/ml)的LB平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；d、陽(yáng)性克隆的鑒定挑取陽(yáng)性克隆接種于含卡納青霉素(100μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后，堿裂法提取質(zhì)粒，用EcoR I和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)用 EcoR I單酶切的pET48a(+)空質(zhì)粒作為對(duì)照。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET_lysZ5，重組菌命名為 DE3 (pET-lysZ5)。結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒pET_lysZ5用EcoR I和HindIII進(jìn)行雙酶切后，分別在 5. 4kb和Ikb處出現(xiàn)pET28a(+)載體帶和lysZ5基因帶，大小與預(yù)期相符，表明構(gòu)建正確。實(shí)施例2 溶壁酶LysZ5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將重組菌DE3(pET-lysZ5)接種到含卡納青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)液中， 37°C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；次日，按1 100比例轉(zhuǎn)接至IOOmL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_ 值約為0. 5時(shí)，加入IPTG至終濃度0. 5mm0l/LJ8°C誘導(dǎo)證。收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞， 40C，10, 000rpm/min離心lOmin，收集上清，并將上清經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表達(dá)情況。將過(guò)濾的裂解上清用His親和層析鎳柱(GE Healthcare, Sweden)純化，具體按試劑盒說(shuō)明步聚進(jìn)行。獲得蛋白命名為溶壁酶lysZ5，將純化的溶壁酶lysZ5產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒(Novagen公司)進(jìn)行去毒處理((0. OlEU/μ g內(nèi)毒素)。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2所示，重組菌DE3 (pET_lysZ5)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其上清中在約42kD的位置有較粗的誘導(dǎo)蛋白條帶，與預(yù)期大小相符，從而表明，重組菌 DE3(pET-lysZ5)構(gòu)建正確，且表達(dá)的溶壁酶蛋白產(chǎn)物L(fēng)ysZ5為可溶性蛋白。實(shí)施例3 重組溶壁酶LysZ5特異性裂解李斯特菌將單核細(xì)胞增生性李斯特菌ATCC 19114培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 8，用PBS洗滌后重懸， 取900 μ 1，加入100 μ 1(50 μ g)純化的溶壁酶產(chǎn)物，混勻，室溫下作用lh，用分光光度計(jì)動(dòng)態(tài)測(cè)定菌液的OD6tltl值，OD600的下降表明細(xì)菌被裂解。結(jié)果如圖3所示，純化的溶壁酶LysZ5產(chǎn)物對(duì)單核細(xì)胞增生性李斯特菌具有良好的裂解活性。實(shí)施例4 溶壁酶LysZ5的酶譜分析將TSA-YE(含0. 6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂)平板分為若干個(gè)區(qū)域，吸取不同宿主菌過(guò)夜培養(yǎng)物單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,ATCC 19114)、威爾氏李斯特菌(Listeria welshimeri, GIM 1. 231)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua, GIM 1. 230)、綿羊李斯特菌Lv-31 (Listeria ivanovii，本室分離鑒定并保存)0. ImL滴于 TSA-YE平板正中央，將菌液均勻地涂開，30°C培養(yǎng)Ih ；同時(shí)將副傷寒沙門菌(ATCC 50073)、 腸炎沙門菌(ATCC13073)以及大腸桿菌(ATCC 25922)0. ImL滴于TSA-YE平板并涂布均勻； 取溶壁酶產(chǎn)物10 μ L，分別滴加于涂有不同宿主菌的平板中，正放待自然晾干后，分別置于 30°C和37°C溫箱培養(yǎng)IOh后，觀察溶壁酶產(chǎn)物對(duì)不同宿主菌的裂解作用。結(jié)果表明，溶壁酶產(chǎn)物僅對(duì)單核細(xì)胞增生性李斯特菌、威爾氏李斯特菌、英諾克李斯特菌和綿羊李斯特菌有特異性裂解活性，而對(duì)其他種屬菌株無(wú)反應(yīng)。實(shí)施例5 溶壁酶LysZ5在食品中的滅菌作用將巴氏殺菌牛奶分裝為兩組，A組接種宿主菌104cfu/mL，加入100 μ g的溶壁酶 LysZ5蛋白；B組中僅加入IO4CfuAiL宿主菌作為對(duì)照，將制備好的樣品分別置于25°C，分別于30min和60min檢測(cè)宿主菌數(shù)量。結(jié)果如圖4所示，25°C作用30min后，宿主菌數(shù)量有所下降；至60min后，宿主菌數(shù)量下降約31og1(l，與對(duì)照組呈顯著性差異，從而表明溶壁酶LysZ5在食品中有良好的殺菌作用。
權(quán)利要求
1.一種李斯特菌噬菌體溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列Skq ID NO. 2。
2.一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為kq ID NO. 1。
3.—種表達(dá)李斯特菌噬菌體溶壁酶的制備方法，其特征在于步驟1)中采用引物5’ -A TATGGA TCC ATG GTA AM TAT 八0>3，和引物5，-六 AGT AAG CTT TTA TTT CTT GATAAC TGC TCC-3’從李斯特菌噬菌體基因組中擴(kuò)增李斯特菌噬菌體溶壁酶基因；具體步驟如下1)從李斯特菌噬菌體基因組中擴(kuò)增李斯特菌噬菌體溶壁酶基因；2)構(gòu)建表達(dá)李斯特菌噬菌體溶壁酶的重組表達(dá)載體；3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到表達(dá)李斯特菌噬菌體溶壁酶的工程菌；4)異丙基1-1硫代呋哺半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因表達(dá)產(chǎn)物；5)將重組基因表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)鎳柱親和層析純化分離，得到重組的李斯特菌噬菌體溶壁酶；6)將純化的溶壁酶產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒進(jìn)行去毒處理即<0. OlEU/μ g內(nèi)毒素。
4.權(quán)利要求1所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于用于抑制李斯特菌污染和過(guò)度生長(zhǎng)的量。
5.權(quán)利要求1所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于將純化的溶壁酶產(chǎn)物制成稀釋液，用于對(duì)食品、生產(chǎn)環(huán)境或生產(chǎn)器具，防止食品加工過(guò)程中造成的李斯特菌污染。
6.權(quán)利要求5所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于所述的食品為由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。
7.權(quán)利要求5所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于以重組表達(dá)的李斯特菌噬菌體溶壁酶產(chǎn)物制成殺菌劑。
8.權(quán)利要求5所述的一種李斯特菌噬菌體溶壁酶的應(yīng)用，其特征在于將純化的溶壁酶產(chǎn)物與賦形劑復(fù)配后，用來(lái)抑制食品中李斯特菌的污染。
全文摘要
本發(fā)明涉及屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種李斯特菌噬菌體溶壁酶(Endolysin或稱裂解酶)及其作為食品添加成分在食品中的應(yīng)用；一種李斯特菌噬菌體溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列為Seq ID NO.2。利用生物工程技術(shù)開發(fā)能夠高效殺滅李斯特菌的酶制劑，該制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用，能夠特異性的滅活多種食源性李斯特菌，為目前防控食品中李斯特菌污染提供一種安全、無(wú)毒副作用的酶制劑來(lái)源。
文檔編號(hào)C12N15/55GK102174487SQ20101059782
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者張輝, 王冉 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院