專利名稱：利用口蹄疫病毒2a序列構(gòu)建植物三價融合表達載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程育種領(lǐng)域，涉及利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建植物三價融合 基因表達載體的方法，具體涉及利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建湖北海棠三價融合基因表達 載體的方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)有效地將優(yōu)良的基因?qū)?栽培品種，培育優(yōu)良新品種，對于提升植物育種水平和培育新品種具有重大意義。目前主要 是通過單基因轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因植物，但是一個優(yōu)良的性狀往往是由多個基因共同參與才 能完成，所以通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法培育新品種就需要通過多基因轉(zhuǎn)化法。目前多基因轉(zhuǎn)化 法主要有雜交方法；重復(fù)轉(zhuǎn)化方法；多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的方法等，這些方法不僅耗時，而且得 不到很好的效果。目前主要通過重復(fù)轉(zhuǎn)化法實現(xiàn)多基因的轉(zhuǎn)化，但是絕大多數(shù)物種的遺傳轉(zhuǎn)化體系 還不完善，轉(zhuǎn)化效率極低。在一個基因轉(zhuǎn)化成功的基礎(chǔ)上，再繼續(xù)轉(zhuǎn)化第二個、第三個基因 的效率就更低。通過構(gòu)建三價和多價植物融合表達載體，可以一次性的將多個目的基因?qū)?入受體系統(tǒng)中。但是植物表達載體由于含有篩選標(biāo)記基因和抗性基因，其載體本身很大，把 三個目的基因依次連接在植物表達載體上，難度很大。研究三價融合表達載體的構(gòu)建，為從 事多價基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)培育新種質(zhì)提供強有力的技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu) 建植物三價融合基因表達載體的方法，利用該方法可以有效、穩(wěn)定的構(gòu)建植物三價融合表 達載體。一種利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建植物三價融合基因表達載體的方法，包含如下 步驟(1)序列分析引物合成根據(jù)湖北海棠MhTGA2、MhNPRl、MhChitl基因的序列，利用 Bioxm2. 6進行酶切位點分析，并設(shè)計含有酶切位點的引物序列，見表1 ；表1引物序列
權(quán)利要求
1. 一種利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建植物三價融合基因表達載體的方法，其特征在于 包含如下步驟(1)序列分析引物合成根據(jù)湖北海棠MhTGA2、MhNPRU MhChitl基因的序列，利用 Bioxm2. 6進行酶切位點分析，并設(shè)計含有酶切位點的引物序列，見表1 ； 表1引物序列
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建植物三價融合基因表達載體 的方法，其特征在于步驟(2)所述的MhTGA2、MhNPRU MhChitl基因的擴增及其酶切是以 湖北海棠全長cDNA文庫為模板，利用步驟(1)設(shè)計的引物，分別進行MhTGA2、MhNPRl、 MhChitl三個目的基因的PCR擴增，將擴增結(jié)果進行回收、分別連接pMD18 simple T載體、 轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞、測序，將測序正確的菌株提質(zhì)粒，分別得到重組質(zhì)粒pTGA2、pNPRl、 pChitlο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建植物三價融合基因表達載體的 方法，其特征在于步驟(4)所述的植物雙元表達載體的改造是利用內(nèi)切酶)(ba I和Mc I 對植物表達載體PCAMBIA-S1300+和步驟(3)合成的序列b分別進行雙酶切，分別回收長度 為的序列b目的片段和植物表達載體pCAMBIA-S1300+線性大片段，利用T4DNA連接 酶進行連接，得到改造后的植物雙元表達載體PCAMBIA-S1300+1 ；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建植物三價融合基因表達載體的 方法，其特征在于步驟(5)所述的中間載體的構(gòu)建具體方法為a.將合成的序列b、序列c和pMD19-T分別進行)(baI和Mc I雙酶切，回收目的片段， 將經(jīng)雙酶切后的長度為128bp的序列b目的片段和長度為128bp的序列c目的片段分別與 經(jīng)雙酶切后的PMD19-T線性大片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，隨機篩選白 色菌落，進行搖菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定，命名為P2Ab和P2Ac ；b.將質(zhì)粒P2Ab和質(zhì)粒pTGA2分別進行SpeI和BamH III雙酶切，回收pTGA2酶切產(chǎn) 物中長度為1012bp的MhTGA2基因目的片段和P2Ab線性大片段，連接兩片段得重組質(zhì)粒， 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，進行菌液PCR鑒定和酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì) 粒命名為TP2Ab ；c.將質(zhì)粒TP2Ab和pNPRl分別進行MluI和ApaI雙酶切，回收pNPRl酶切產(chǎn)物中長度 為1770bp的MhNPRl基因目的片段和TP2Ab線性大片段，連接兩片段得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，進行菌液PCR鑒定和酶切鑒定，將酶切鑒定結(jié)果正確 的質(zhì)粒進行測序，命名為ΤΡ2ΑΝ ；d.將質(zhì)粒P2Ac和pchitl分別進行BssHII和KpnI雙酶切，回收目的片段，回收pchitl 酶切產(chǎn)物中長度為963bp的Mhchitl基因目的片段和P2Ac線性大片段，連接兩片段得重組 質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，進行菌液PCR鑒定和酶切鑒定，將酶切鑒 定正確的質(zhì)粒命名為P2AcC ；e.將質(zhì)粒P2AcC和TP2AN分別進行ApaI和KpnI雙酶切，回收質(zhì)粒P2AcC酶切產(chǎn)物中 長度為1023bp的目的片段和質(zhì)粒TP2AN酶切產(chǎn)物中的線性大片段，連接兩片段得重組質(zhì) 粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，利用第一個基因MhTGA2的上游引物MhTGFl 和最后一個基因Mhchitl基因的下游引物MhCHRl進行菌液PCR鑒定和測序，酶切和測序正 確的質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的中間載體TP2AN2AC。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程育種領(lǐng)域，公開了利用口蹄疫病毒2A序列構(gòu)建植物三價融合基因表達載體的方法。該方法包含如下步驟(1)序列分析引物合成，(2)MhTGA2、MhNPR1、MhChit1基因的擴增及其酶切，(3)合成含有口蹄疫病毒2A序列的兩條序列，(4)植物雙元表達載體的改造，(5)中間載體的構(gòu)建，(6)植物三價雙元表達載體的構(gòu)建。通過本發(fā)明構(gòu)建方法進行三價或者多價融合表達載體構(gòu)建，大大提高了載體構(gòu)建成功的概率，可以很大程度上縮小工作量，節(jié)約構(gòu)建載體的時間，對今后通過多基因遺傳轉(zhuǎn)化改良品種具有重要意義。
文檔編號C12N15/82GK102121031SQ201010598338
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者喬玉山, 張計育, 徐長寶, 渠慎春, 王三紅, 章鎮(zhèn), 蔡斌華, 陶建敏, 高志紅 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)