專利名稱：L-色氨酸基因工程菌,其構(gòu)建方法以及使用其發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-色氨酸發(fā)酵生產(chǎn)菌株、其構(gòu)建方法及使用其發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的 方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)L-色氨酸基因工程菌株，其構(gòu)建方法及使用其發(fā)酵 生產(chǎn)L-色氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要有四種蛋白水解提取法、化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法和 直接發(fā)酵法。前2種方法分別存在著材料來源有限、需多步合成工藝和光學(xué)拆分及得率低、 周期長等缺點(diǎn)，酶促轉(zhuǎn)化法具有終產(chǎn)物積累量高、反應(yīng)周期短、分離提純?nèi)菀椎葍?yōu)點(diǎn)，它是 生產(chǎn)L-色氨酸較為有效的方法。目前日本與我國許多企業(yè)采用酶法生產(chǎn)。我國中科院微 生物研究所余志華等采用重組DNA技術(shù)，成功地構(gòu)建了能夠高效表達(dá)用于酶法生產(chǎn)的色氨 酸合成酶基因工程菌E. coli，并進(jìn)行了規(guī)?；a(chǎn)。但由于酶法底物之一 L-絲氨酸價(jià)格昂 貴，另一底物吲哚難溶于水，且對色氨酸合成酶抑制強(qiáng)烈，影響轉(zhuǎn)化率提高。因此目前L-色 氨酸的市場價(jià)格仍居高不下。L-色氨酸發(fā)酵研究始于上世紀(jì)60年代初期。雖然對這種方法的研究進(jìn)行得比 較早，但在相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。主要原因是從葡萄糖到L-色 氨酸的生物合成途徑比較漫長，其代謝流也比較弱，另一方面，L-色氨酸生物合成途徑中 的調(diào)控機(jī)制也比較復(fù)雜。從葡萄糖被細(xì)菌吸收開始，需要經(jīng)過細(xì)胞膜上的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) (Phosphotransferase System, PTS)，糖酵解途徑(Embden Meyerhof Parnas, EMP)禾口磷 酸戊碳糖途徑(Hexose Monophosphate Pattiway，HMP)，分別合成前體磷酸烯醇式丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate, PEP)禾口赤Il糖 _4_ 舞酸(D_erythrose_4_phosphate，Ε4Ρ)，經(jīng)過共 有的莽草酸途徑到達(dá)分支酸，然后在分支合成三種芳香族氨基酸L-苯丙氨酸，L-色氨酸， L-酪氨酸。在大腸桿菌中，編碼莽草酸激酶的基因存在同工酶基因aroL和aroK。aroB、 ar0D、ar0E、ar0A、ar0C則只有一個(gè)。從分支酸開始進(jìn)入分支途徑分別合成三種芳香族氨基 酸，分別由tyrA和pheA基因的產(chǎn)物分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫氫酶(或脫水酶)(Chorimate mutase/Prephenate dehydrogenase, Chorimate mutase/Prephenate dehydratase, CM-PD)雙功能酶中的分支酸變位酶催化分支酸到預(yù)苯酸，接著由預(yù)苯酸脫氫酶催化預(yù)苯 酸合成L-酪氨酸前體對羥基苯丙酮酸，由預(yù)苯酸脫水酶催化預(yù)苯酸合成L-苯丙氨酸前 體苯丙酮酸，最后由tyrB基因產(chǎn)物芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化分別合成L-酪氨酸和L-苯 丙氨酸；而L-色氨酸是由色氨酸操縱子trpEDCBA催化合成，首先由鄰氨基苯甲酸合成酶 (Anthranilate synthase, ANS)催化分支酸合成鄰氨基苯甲酸，接著由磷氨基苯甲酸磷酸 核糖轉(zhuǎn)移酶(anthranilate phosphoribosyl transferase,PRT)催化合成磷酸核糖磷氨基 苯甲酸，再由N-(5’ -磷酸核糖)-氨基苯甲酸同分異構(gòu)酶和吲哚-3-甘油磷酸合酶雙功能 酶催化合成吲哚-3-甘油磷酸，再由色氨酸合成酶(Tryptophan synthase, TS)催化合成 L-色氨酸。
用傳統(tǒng)方法誘變黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌等出發(fā)菌株，解除菌體自身反饋調(diào)節(jié)， 切斷支路代謝，增加前體物的合成等，對芳香族氨基酸生物合成正常代謝機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)，取 得了一定成果，如1982年日本杉本慎一等利用黃色短桿菌酪氨酸、蛋氨酸雙重缺陷型兼 對-氟苯丙氨酸抗性株，誘導(dǎo)5-氟色氨酸抗性株積累8. Og/L L-色氨酸，進(jìn)一步賦予重氮 絲氨酸抗性，積累10.3g/L L-色氨酸。1987年他們又從該株誘變出磺酸胍抗性突變株，在 相同的培養(yǎng)條件下積累L-色氨酸18. 8g/L。1987年日本倉橋等發(fā)現(xiàn)高濃度的L-色氨酸 抑制枯草桿菌色氨酸生產(chǎn)菌生長，依次賦予該菌具有對以下各結(jié)構(gòu)類似物5-氟色氨酸、吲 哚霉素、重氮絲氨酸，6-重氮-5-氧基-L-正亮氨酸、肉桂酸的抗性，誘變得到了 AJ-11982 菌株，能從200g/L葡萄糖生產(chǎn)21. 5g/L色氨酸。已知的L-色氨酸生產(chǎn)方法是基于一個(gè)突變的trpE基因的表達(dá)，該基因編碼有對 色氨酸不敏感的鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合酶，以及基于在合適的可自動(dòng)復(fù)制的載 體上的L-色氨酸操縱子的其它基因的表達(dá)。由于這些基因的相對高拷貝數(shù)，trpE基因的 表達(dá)也多，對應(yīng)的L-色氨酸代謝中的每一種酶的量也增加了，即可實(shí)現(xiàn)L-色氨酸的過量生產(chǎn)。1979年Tribe和Pittard首次利用DNA重組技術(shù)將trpE引入E. coli中。1982 年Aiki等將帶有失調(diào)的trpE和trpD基因引入trpR和tnaA缺陷的E. coli中，在含有葡 萄糖和鄰氨基苯甲酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)他們還分離到一株抗6-氟色氨酸的突變株，以 此菌株為出發(fā)菌株，同時(shí)引入增強(qiáng)表達(dá)的L-色氨酸操縱子。1993年Chan等將三個(gè)拷貝的色氨酸操縱子基因整合到E. coli的基因組中，獲得 了穩(wěn)定生產(chǎn)L-色氨酸的生產(chǎn)菌株，在沒有選擇壓力的情況下也能穩(wěn)定表達(dá)，因此將基因整 合到基因組中獲得穩(wěn)定表達(dá)也是非常有用的策略。通過增強(qiáng)失調(diào)的L-色氨酸操縱子在宿 主菌中的表達(dá)來提高L-色氨酸的產(chǎn)量的在Berry (1996)和Camakaris等(1997)也有所描 述。隨著重組DNA技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用，在L-色氨酸生產(chǎn)菌株的篩選和產(chǎn)酸 水平的提高方面出現(xiàn)了突破。例如從大腸桿菌EMS4-C25中分離得到抗反饋調(diào)節(jié)的色氨酸 操縱子，并將其克隆到質(zhì)粒PUC19和pHSG576中分別得到重組質(zhì)粒pTC701和pTC576，將 PTC576轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中得到高產(chǎn)的L-色氨酸生產(chǎn)菌株。Ikeda等將帶有DAHP合成酶和 色氨酸合成酶的質(zhì)粒引入產(chǎn)L-色氨酸的谷氨酸棒桿菌KY10-894中，使L-色氨酸的產(chǎn)量提 高了 54%。基因工程育種在各種L-色氨酸生產(chǎn)菌中的成功實(shí)踐說明其發(fā)展勢頭，也必將成 為未來工業(yè)微生物育種的發(fā)展趨勢?；蚬こ虡?gòu)建L-色氨酸生產(chǎn)菌的專利報(bào)道有日本協(xié)和發(fā)酵公司申請的專利EP-A-O 401 735描述了以含有重組質(zhì)粒的棒狀桿 菌或短桿菌來生產(chǎn)L-色氨酸的方法。在這些質(zhì)粒中含有合成DAHP合酶，鄰氨基苯甲酸合 酶，吲哚-3-甘油-P合酶，色氨酸合酶和磷酸甘油脫氫酶的遺傳信息。使用了抗反饋鄰氨 基苯甲酸合酶的等位基因。Mauffer化學(xué)公司申請的專利EPO 149 539中揭示了通過在細(xì)胞中防止絲氨 酸降解來提高L-色氨酸產(chǎn)量的方法。使用了破壞絲氨酸降解酶(絲氨酸脫氨酶，Serine deaminase, sda)的大腸桿菌K_12突變體來生產(chǎn)氨基酸。
德國電化學(xué)公司申請的中國專利CN93117586. 0(授權(quán)公告CN1065909C)通過一個(gè) 去調(diào)控的色氨酸代謝和至少一個(gè)抗反饋serA等位基因而去調(diào)控的絲氨酸代謝的突變體， 在相同培養(yǎng)條件下產(chǎn)量提高2. 6倍。另外以重組大腸桿菌(E.coli)為宿主菌生產(chǎn)L-色氨酸的授權(quán)專利還有 CN1085950A,EP0293207,US4371614,US4588687等。各專利保護(hù)其新構(gòu)建的位點(diǎn)，也描述了 它們的不同發(fā)酵產(chǎn)酸能力。本發(fā)明首次提出利用基因工程的方法改造大腸桿菌的芳香族氨基酸代謝途徑的 共有途徑，通過增強(qiáng)相關(guān)基因的組合最終獲得高產(chǎn)L-色氨酸生產(chǎn)菌株，同時(shí)本發(fā)明在國內(nèi) 為首家用發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸，本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌株為大腸桿菌L-色氨酸高產(chǎn)菌 株，能有效積累L-色氨酸，為L-色氨酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過基因工程的方法對大腸桿菌的L-色氨酸相關(guān)代謝途徑進(jìn) 行改造，從而提供L-色氨酸的生產(chǎn)菌株，菌株構(gòu)建及L-色氨酸發(fā)酵法制備的方法。①L-色氨酸生產(chǎn)菌株的trpR、tyrR、tnaA、tyrA和pheA —個(gè)或幾個(gè)基因進(jìn)行敲 除或失活，通過對這些基因的改造有效解除L-色氨酸的負(fù)調(diào)控或切斷分支代謝從而有利 于L-色氨酸的積累；②構(gòu)建含有L-色氨酸代謝途徑被突變基因aroGfto、krA和trpEfeDCBA的重組質(zhì) 粒pTrp，其中基因aroGfto和通過引入突變位點(diǎn)，導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物對L-色氨酸不敏 感；③構(gòu)建含有L-色氨酸代謝途徑被過表達(dá)基因aroFfto、aroE、aroB、ppsA、tktA、 aroK, aroA和aroC的重組質(zhì)粒pSKKAC，對基因進(jìn)行過表達(dá)，目的是為了增強(qiáng)整個(gè)芳香族氨 基酸代謝途徑的前體供應(yīng)，最終增加L-色氨酸的產(chǎn)量。④將重組質(zhì)粒pTrp、pSKKAC分別或同時(shí)轉(zhuǎn)入基因敲除菌株中，獲得L-色氨酸生產(chǎn) 菌株。利用本發(fā)明獲得的L-色氨酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵，可以獲得L-色氨酸的有效積累， 為L-色氨酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。具體地，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種L-色氨酸生產(chǎn)菌，其特征在于所 述L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因被突變，并且/或者 一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因敲除或失活，并且/或者一個(gè)或多個(gè)與L-色 氨酸代謝途徑相關(guān)的基因被過表達(dá)；優(yōu)選地，其中所述突變基因?yàn)閍roF*和/或aroG^"、 trpE^,并且其中所述突變基因aroFfto和/或ar0Gfto、trpE*具有代謝終產(chǎn)物抗反饋抑制 脫敏的特性，更優(yōu)選地所述aroFfto的突變?yōu)?48位脯氨酸突變成亮氨酸；優(yōu)選地，其中所述 敲除或失活基因?yàn)閠yrR、trpR、tnaA、tyrA和pheA中的一個(gè)或幾個(gè)；優(yōu)選地，其中所述過 表達(dá)的基因?yàn)?aroFfbr、aroB、aroE、aroD、aroL 禾口 / 或 aroK、aroA、aroC、trpEftrDCBA、serA、 pp sA 禾口 tktA。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述基因是組合表達(dá)在合適拷貝的表達(dá)載體上或整合在 基因組上。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組載體pTrp，其特征在于在pSUN007的多克隆位點(diǎn)中插入以下基因aroGfto、SerA和trpEfeDCBA基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組載體pSKKAC，其特征在于在 PSU2718 的多克隆位點(diǎn)中插入以下基因 ^roFfbr, aroE、aroB、ppsA、tktA、aroK、aroA 和 aroC， 其中所述BroFfto是經(jīng)突變的，優(yōu)選地所述突變?yōu)锽roFfto的148位脯氨酸突變成亮氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述L-色氨酸生產(chǎn)菌的特征在于其PheA和/或tyrA 基因被敲除；優(yōu)選地，所述的L-色氨酸生產(chǎn)菌還被所述重組載體pTrp和/或所述重組載體 pSKKAC所轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，前述L-色氨酸生產(chǎn)菌屬于大腸桿菌種屬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了前述L-色氨酸生產(chǎn)菌在L-色氨酸生產(chǎn)中的 應(yīng)用。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了前述重組載體pTrp和pSKKAC在制備用 于生產(chǎn)L-色氨酸的L-色氨酸生產(chǎn)菌中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的生產(chǎn)方法，其中使 用前述L-色氨酸生產(chǎn)菌作為發(fā)酵生產(chǎn)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種L-色氨酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法，其特征在 于包括以下步驟中一步或多步A、L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因敲除或失活；B、L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因被突變；C、L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因被過表達(dá)。D、將含有L-色氨酸代謝途徑中被突變和被過表達(dá)關(guān)鍵基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因 敲除菌株中，獲得了 L-色氨酸的生產(chǎn)菌株。優(yōu)選地，其中所述步驟A包括敲除或失活基因?yàn)閠yrR、trpR、tnaA、tyrA和pheA中 的一個(gè)或幾個(gè)；并且/或者，其中所述步驟B包括突變基因?yàn)锽roFfto和/或MoGfl^trpEfto, 并且其中所述突變基因aroFfto和/或aroGfto和具有代謝終產(chǎn)物抗反饋抑制脫敏的 特性；并且/或者，其中所述步驟C包括過表達(dá)的基因?yàn)閍roF "、aroB、aroE、aroD、aroL 和 / 或 aroK、aroA、aroC、trpEfbrDCBA, serA、ppsA 和 tktA ；并且 / 或者，其中所述步驟 D 包 括權(quán)利要求4的重組質(zhì)粒和/或權(quán)利要求5的重組質(zhì)粒。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，前述方法還包括，將所述重組質(zhì)粒pTrp和pSKKAC轉(zhuǎn)入 基因敲除菌株中，從而獲得了 L-色氨酸生產(chǎn)菌株。


圖1 為重組質(zhì)粒pTrp的示意圖，過表達(dá)L-色氨酸操縱子^pEftoDCBA以及MoGfto 和serA基因。圖2 為重組質(zhì)粒pSK的示意圖，過表達(dá)aroE、aroB、tktA、ppsA和aroP1"。圖3 為重組質(zhì)粒pSKKAC的示意圖，在pSK的基礎(chǔ)上，將aroK、aroA和aroC進(jìn)行 過表達(dá)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而并非用于限定本發(fā)明的范圍。根據(jù)大腸桿菌中L-色氨酸的代謝途徑，本發(fā)明是在菌株CGSC7692的基礎(chǔ)上構(gòu)建 了一系列突變體，如trpR、tyrA.tnaA和pheA等的敲除或失活，其中trpR的敲除去除了基 因組上色氨酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵酶受到的反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控，PheA, tyrA的敲除切斷了分支代謝 從而有利于L-色氨酸的積累，tnaA的敲除阻斷了色氨酸的分解代謝。在這些突變體中在 合適的載體上組合表達(dá) aroFfb7aroGfto、aroB、aroE、aroD、aroK/L、aroA、aroC、ppsA、tktA、 serA和L-色氨酸操縱子IrpEftoDBCA等，構(gòu)建了一系列的L-色氨酸基因工程菌。CGSC7692( Ε. coli Genetic Stock Center, YaleUniversity, New Haven, Connecticut, USA)突變菌株的構(gòu)建，參考 Gust. B.等的文獻(xiàn)(PCR-targeting system in Streptomycescoelicolor,Gust. B. ,Kieser Τ. et al, 2002),利用 PCR-Targeting方法進(jìn)行 大腸桿菌基因組中PheA、trpR、tyrA和tnaA基因的敲除，具體如下實(shí)施例1 敲除pheA基因的菌株CGSC7692 ( Δ pheA)的制備1.突變菌株 CGSC7692(ApheA: :Kan)的制備以 CGSC10048(ApheA: :Kan)基因組為模板，利用引物 pheA-V-F 和 pheA_V_R，PCR 擴(kuò)增phe A突變基因片段，引物序列如下正向引物pheA-V-F :5' -GGAGGCGTTTCGTCGTGTGA-3 ‘ (SEQ ID NO 1)反向引物pheA-V-R 5 ‘ -GCAAGGTGGAGCACTGGTTC-3 ‘ (SEQ ID NO 2)擴(kuò)增反應(yīng)體系10X KOD 緩沖液(不含 MgSO4) 5 μ 1，MgS04(25mM) 3 μ 1, dNTP (2. 5πιΜ)4μ 1，KOD聚合酶1μ 1，模板1μ 1，正向引物(10 μ Μ) 2 μ 1，反向引物 (10 μ Μ) 2 μ 1，加ddH20至50 μ 1 (本發(fā)明所用PCR反應(yīng)試劑均購于Τ0Υ0Β0公司)。擴(kuò)增條件為94°C，2min,94°C，45sec, 55°C，45sec,68°C，90sec, 30 個(gè)循環(huán)。膠回收pheA突變基因片段的PCR產(chǎn)物1. 51Λ (膠回收參照杭州愛思進(jìn)試劑盒回 收方法)，借助電擊轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV, 200 Ω，25 μ F)將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入100 μ 1 B^W PKD46 (pKD46 Ε. coli Genetic Stock Center, Yale University, NewHaven, Connecticut, USA)質(zhì)粒的CGSC7692大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(即大腸桿菌CGSC7692/pKD46感 受態(tài)細(xì)胞)中(轉(zhuǎn)化方法及感受態(tài)制備方法均參照《分子克隆III》第1章96頁)，于37°C 下LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 2小時(shí)，將菌液涂布在含有卡那霉素(100yg/ml)的固體LB平板上， 37°C過夜靜置培養(yǎng)，對長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，PCR片段大小為1.51Λ表明對應(yīng)的 轉(zhuǎn)化子就是PheA基因的突變菌株CGSC7692(ApheA: :Kan)。將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子以引物正向引物pheA-V-F 5 ‘ -GGAGGCGTTTCGTCGTGTGA-3 ‘反向引物pheA-V-R 5 ‘ -GCAAGGTGGAGCACTGGTTC-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性片段大小應(yīng)為1. 51Λ。PCR 鑒定體系10 X Taq 緩沖液(不含 MgCl2) 2 μ 1，MgCl2 (25mM) 1. 2 μ 1, dNTP(2. 5mM) 1· 6μ 1，Taq 聚合醇 1 μ 1，Primer-F(IOyM) 1 μ 1，Primer-R(IOyM) 1 μ 1，力口 ddH20至20 μ 1 (本發(fā)明PCR驗(yàn)證鑒定所用試劑均購于TAKARA公司)。PCR 鑒定條件94°C，2min, 94°C，45sec, 55°C，45sec, 72°C，90sec, 30 個(gè)循環(huán)。2.抗性基因環(huán)出將攜帶有高溫誘導(dǎo)的能識別FLP識別位點(diǎn)(FRT)的重組酶FLP的BT340質(zhì)粒(購于 E. coli Genetic Stock Center)，借助電擊(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV，200 Ω，25 μ F)轉(zhuǎn)化 入突變菌株CGSC7692(ApheA::Kan)，菌液涂布于含有氯霉素(25 μ g/ml)固體LB平板上 30°C下靜置培養(yǎng)對小時(shí)，將得到的單菌落轉(zhuǎn)接到不含抗生素的LB平板上，42°C靜置培養(yǎng)12 小時(shí)，利用高溫誘導(dǎo)的重組酶FLP將FRT位點(diǎn)間基因盒去除掉，得到敲除PheA基因的菌株 CGSC7692(ΔpheA)。
獲得的基因敲除菌株以引物正向引物 pheA-V-F2 5 ‘ -GGAAACAAACATGAAACACATACCG-3 ‘ (SEQ ID NO 3)反向引物pheA-V-R 5 ‘ -GCAAGGTGGAGCACTGGTTC-3進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性片段應(yīng)為同源臂大小400bp左右，PCR條件同實(shí)施例1中 第1步所述的鑒定方法。實(shí)施例2敲除tyrA基因的菌株CGSC7692 ( Δ tyrA)制備1.突變菌株 CGSC7692 ( Δ tyrA: :Kan)的制備以 CGSC10049(AtyrA: :Kan)基因組為模板，利用引物 tyrA-V-F 和 tyrA-V-R,PCR 擴(kuò)增tyrA突變基因片段，引物序列如下(PCR所用試劑及反應(yīng)體系同實(shí)施例1中所述的基 因擴(kuò)增方法)正向引物tyrA-V-F :5' -TATCCGTAACCGATGCCTGC-3‘ (SEQ ID NO 4)反向引物tyrA-V-R 5‘ -GGGAAATCACCCGTTCAATG-3‘ (SEQ ID NO 5)膠回收tyrA突變基因的PCR產(chǎn)物1. 51Λ (膠回收參照杭州愛思進(jìn)試劑盒回收 方法)，借助電擊轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV,200Q,25yF)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 CGSC7692/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中(方法同實(shí)施例1中所述)，于37°C下LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 2 小時(shí)，將菌液涂布在含有卡那霉素(100yg/ml)的固體LB平板上，37°C過夜靜置培養(yǎng)，對長 出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，PCR片段大小為1. 5kb表明對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子就是tyrA基因的 突變菌株 CGSC7692 ( Δ tyrA: :Kan)。獲得的陽性轉(zhuǎn)化子以引物正向引物tyrA-V-F 5 ‘ -TATCCGTAACCGATGCCTGC-3 ‘反向引物tyrA-V-R 5 ‘ -GGGAAATCACCCGTTCAATG-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，菌落PCR鑒定體系及條件同實(shí)施例1所述的菌落PCR鑒定方 法，陽性片段大小應(yīng)為1. 5kb左右。2.抗性基因環(huán)出將攜帶有高溫誘導(dǎo)的能識別FRT的重組酶FLP基因的BT340質(zhì)粒(購于E. coli Genetic Stock Center)，借助電擊(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV, 200 Ω，25 μ F)轉(zhuǎn)化入突變菌株 CGSC7692( AtyrrA: :Kan)，抗性基因環(huán)出方法同實(shí)施例1中所述，得到敲除tyrA基因的菌 株 CGSC7692 ( ΔtyrA)。獲得的基因敲除菌株以引物正向引物tyrA-V-F2 :5' -TCGCTCAATTATTGGTCTGATGATC-3‘ (SEQ ID NO 6)反向引物tyrA-V-R 5 ‘ -GGGAAATCACCCGTTCAATG-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性片段應(yīng)為同源臂大小300bp左右，PCR條件同實(shí)施例1中 第1步所述的菌落PCR鑒定方法。實(shí)施例3敲除trpR基因的菌株CGSC7692 ( Δ trpR)的制備
1.突變菌株 CGSC7692(AtrpR: :Kan)的制備以 CGSC11110( AtrpR: :Kan)基因組為模板，利用引物 trpR-V-F 和 trpR_V_R，PCR 擴(kuò)增trpR突變基因片段，引物序列如下(PCR所用試劑及反應(yīng)體系同實(shí)施例1的基因擴(kuò)增 方法)正向引物trpR-V-F 5‘ -ATGGGGGATAAACCGACGTT-3‘ (SEQ ID NO 7)反向引物trpR-V-R :5' -ATGCCGTGTATTAAGCGCCT-3‘ (SEQ ID NO 8)膠回收trpR突變基因的PCR產(chǎn)物1. 51Λ (膠回收參照杭州愛思進(jìn)試劑盒回收 方法)，借助電擊轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV,200Q,25yF)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 CGSC7692/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中(方法同實(shí)施例1)，于37°C下LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 2小時(shí)，將 菌液涂布在含有卡那霉素(100yg/ml)的固體LB平板上，37°C過夜靜置培養(yǎng)，對長出的轉(zhuǎn) 化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，PCR片段大小為1. 5kb表明對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子就是trpR基因的突變菌 株 CGSC7692(ΔtrpRKan)。獲得的陽性轉(zhuǎn)化子以引物正向引物trpR-V-F 5 ‘ -ATGGGGGATAAACCGACGTT-3 ‘反向引物trpR-V-R 5 ‘ -ATGCCGTGTATTAAGCGCCT-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，菌落PCR鑒定體系及條件同實(shí)施例1中所述的菌落PCR鑒定 方法，陽性片段大小應(yīng)為1. 5kb左右。2.抗性基因環(huán)出 將攜帶有高溫誘導(dǎo)的能識別FRT的重組酶FLP的BT340質(zhì)粒(購于E. coli Genetic Stock Center)，借助電擊(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV，200 Ω，25 μ F)轉(zhuǎn)化入突變菌 株CGSC7692 ( Δ trpR Kan)，抗性基因環(huán)出方法同實(shí)施例1，得到敲除trpR基因的菌株 CGSC7692(ΔtrpR)。獲得的基因敲除菌株以引物正向引物trpR-V-F2 :5' -AGACGCGCGGTTATGTGAAG-3‘ (SEQ ID NO 9)反向引物trpR-V-R 5 ‘ -ATGCCGTGTATTAAGCGCCT-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性片段應(yīng)為同源臂大小400bp左右，PCR條件同實(shí)施例1中 第1步所述的菌落PCR鑒定方法。實(shí)施例4敲除tnaA基因的菌株CGSC7692 ( Δ tnaA)的制備1.突變菌株 CGSC7692 ( Δ tnaA: :Kan)的制備以 CGSC8309 ( Δ tnaA: :Kan)基因組為模板，利用引物 tnaA-V-F 和 tnaA-V-R，PCR 擴(kuò)增tnaA突變基因片段，引物序列如下(PCR所用試劑及反應(yīng)體系同實(shí)施例1中所述的基 因擴(kuò)增方法)正向引物tnaA-V-F :5' -CCTTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3 ‘ (SEQ ID NO: 10)反向引物tnaA-V-R :5' -CTTGATCAGTCATGATGCCACC-3‘ (SEQ ID NO 11)膠回收tnaA突變基因的PCR產(chǎn)物1. 51Λ (膠回收參照杭州愛思進(jìn)試劑盒回收 方法)，借助電擊轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV,200Q,25yF)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 CGSC7692/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中(方法同實(shí)施例1)，于37°C LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 2小時(shí)，將菌 液涂布在含有卡那霉素(100yg/ml)的固體LB平板上，37°C過夜靜置培養(yǎng)，對長出的轉(zhuǎn)化 子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，PCR片段大小為1. 5kb表明對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子就是tnaA基因的突變菌株CGSC7692( AtnaA: :Kan)。獲得的陽性轉(zhuǎn)化子以引物正向引物tnaA-V-F 5 ‘ -CCTTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3 ‘反向引物tnaA-V-R 5 ‘ -CTTGATCAGTCATGATGCCACC-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，菌落PCR鑒定體系及條件同實(shí)施例1中所述的菌落PCR鑒定 方法，陽性片段大小應(yīng)為1. 5kb左右。2.抗性基因環(huán)出將攜帶有高溫誘導(dǎo)的能識別FRT的重組酶FLP的BT340質(zhì)粒(購于E. coli Genetic Stock Center)，借助電擊(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV，200 Ω，25 μ F)轉(zhuǎn)化入突變菌 株CGSC7692 ( Δ tnaA Kan)，抗性基因環(huán)出方法同實(shí)施例1，得到敲除tnaA基因的菌株 CGSC7692(ΔtnaA)。獲得的基因敲除菌株以引物正向引物tnaA-V-F2 :5' -AGTTGATGACTCATGATGAACCC-3‘ (SEQ ID NO 12)反向引物tnaA-V-R 5 ‘ -CTTGATCAGTCATGATGCCACC-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性片段應(yīng)為同源臂大小400bp左右，PCR條件同實(shí)施例1中 第1步所述的菌落PCR鑒定方法。實(shí)施例5 雙敲或多敲除菌株的獲得1.突變菌株 CGSC7692( Δ pheAAtyrA Kan)的制備以 CGSC10049(AtyrA: :Kan)(購于 Ε· coli Genetic StockCenter, Yale University, New Haven, Connecticut, USA)基因組為模板，利用引物 tyrA-V-F 和 tyrA-V-R，PCR擴(kuò)增tyrA突變基因片段，引物序列如下(PCR所用試劑及反應(yīng)體系同實(shí)施例 1中所述的基因擴(kuò)增方法)正向引物tyrA-V-F 5 ‘ -TATCCGTAACCGATGCCTGC-3 ‘反向引物tyrA-V-R 5 ‘ -GGGAAATCACCCGTTCAATG-3 ‘?dāng)U增條件為94°C，2min,94°C，45sec, 55°C，45sec, 72°C，90sec, 30 循環(huán)。膠回收tyrA突變基因的PCR產(chǎn)物1. 51Λ (膠回收參照杭州愛思進(jìn)試劑盒回收 方法)，借助電擊轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化條件2. 5kV,200Q,25yF)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 CGSC7692 ( Δ pheA) /pKD46感受態(tài)細(xì)胞中(方法同實(shí)施例1)，于37°C LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)1 2小時(shí)，將菌液涂布在含有卡那霉素(100yg/ml)的固體LB平板上，能夠長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn) 行菌落PCR鑒定，陽性片段大小應(yīng)為1. 51Λ，對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子就是在CGSC7692 (ApheA)基礎(chǔ)上 tyrA 基因的突變菌株 CGSC7692( ApheA AtyrA: :Kan)。2.抗性基因環(huán)出所用方法同實(shí)施例1，得到的基因敲除菌株為CGSC7692 (ApheA Δ tyrA)，獲得的 陽性轉(zhuǎn)化子以引物正向引物tyrA-V-F2 5 ‘ -TCGCTCAATTATTGGTCTGATGATC-3 ‘反向引物tyrA-V-R 5 ‘ -GGGAAATCACCCGTTCAATG-3 ‘進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR片段大小應(yīng)為400bp左右，PCR條件、體系及所用試劑同實(shí) 施例1。其它不同突變株的組合方法同上，可以獲得多突變菌株。質(zhì)粒pTrp的構(gòu)建1. pSUNtrp 的構(gòu)建以CGSC7692的基因組為模板，用引物Trp-Op-F和1Trp-Op-R擴(kuò)增6. 58kb的片斷 trpoperon (即色氨酸操縱子trpEDCBA基因)，兩端利用引物引入EcoR I、BamH I酶切位 點(diǎn)，TA克隆到pMD18-T，得重組質(zhì)粒pMDtrpoperon，測序，驗(yàn)證后，EcoR I、BamH I雙酶切， 回收6. 58kb片段trpoperon (膠回收參照杭州愛思進(jìn)試劑盒回收方法)；pSUN006(在pTrc99a質(zhì)粒基礎(chǔ)上，將pTrc99a質(zhì)粒的NcoI酶切位點(diǎn)定點(diǎn)突變， ATG 突變?yōu)?TTG，從而得到 pSUN006 ；所用引物為 pTrc99aK0_F、pTrc99aK0-R, pTrc99a 購于 Pharmacia公司)用EcoR I、BamH I雙酶切回收4. 17kb片段，與trpoperon連接，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5 α (感受態(tài)制備方法參照《分子克隆III》第1章96頁)，挑取轉(zhuǎn)化子，抽提轉(zhuǎn)化 子質(zhì)粒(質(zhì)粒抽提參照杭州愛思進(jìn)質(zhì)粒抽提試劑盒方法)，用EcoR I.BamH I雙酶切驗(yàn)證， 所得陽性重組質(zhì)粒PTrctrpO應(yīng)為10. 75k ；以 pTrctrpO 為模版，用引物 iTrc-Op-F 和 iTrc-Op-R 從 p^TrctrpO 擴(kuò)增帶 Ptrc 片 段的trpoperon (約71Λ)，分別用引物加Kpn I酶切位點(diǎn)，TA克隆，測序，酶切回收目的片段 (7kb)，克隆入pSUN007 (在pBR322基礎(chǔ)上，以pBR322為模板，利用引物pBR322_F、pBR322-R 擴(kuò)增約3. 3kb條帶，擴(kuò)增條帶膠回收后，利用KpnI酶切，再利用連接酶連接，得到PSUN007 ； 其中pBR322購于!Iomega)重組質(zhì)粒pSUNtrp (12. 3kb)。連接反應(yīng)體系10X連接緩沖液 μ ，待連接的樣品(膠回收產(chǎn)物，載體與片段的mol比為1 3_5)，連接酶0. 5_1 μ 1，加 水補(bǔ)足10 μ 1，16°C過夜連接。(連接反應(yīng)所用試劑及酶均購于TAKARA)。引物序列如下Trp-Op-F 5' -GAGAATTCCAATGCAAACACAAAAAC-3‘ (SEQ ID NO 13)Trp-Op-R 5' -TGGATCCAGAAAGTTAAAATGCCG-3‘ (SEQ ID NO 14)pTrc99aK0-F 5' -CACAGGAAACAGACCTTGGAATTCGAGCTC-3‘ (SEQ ID NO 15)pTrc99aK0-R 5' -GAGCTCGAATTCCAAGGTCTGTTTCCTGTG-3‘ (SEQ ID NO 16)Trc-Op-F 5' -GGTACCCCATTTACGTTGACACCATC-3，(SEQ ID NO 17)Trc-Op-R 5' -GGTACCCGGGGATCCTCGACACTC-3，(SEQ ID NO 18)pBR322-F 5 ‘ -CGGGGTACCACTAGTCCATGGAGATCTCCCGGGCAAGAATTCTCATGTTTGAC-3 ‘(SEQ ID N0:19)pBR322-R 5 ‘ -CGGGGTACCGAGCTCTCTAGACTCGAGAGTACTTTAGATTGATTTAAAACTTC-3 ‘(SEQ ID NO 20)2. pSUNaroG-serA 的構(gòu)建以W3110基因組(GenBank登錄號AP009048)為模板，用引物aroG_F和 aroG-R擴(kuò)增aroG基因，兩端分別添加EcoR I和Hind III位點(diǎn)，克隆入pSUN006中，獲得 PSUNaroG (連接反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1步)。以W3110基因組為模板，用引物serA-F和serA_R擴(kuò)增serA基因，兩端分別添加 Hind III位點(diǎn)，克隆入pSUNaroG的Hind III位點(diǎn)，獲得pSUNaroG-serA(連接反應(yīng)條件及 體系同實(shí)施例6第1步)。引物序列如下aroG-F 5' -CGAATTCATGAATTATCAGAACGACG-3‘ (SEQ ID NO 21)
aroG-R 5' -AAGCTTACCCGCGACGCGCTTTTAC-3‘ (SEQ ID NO 22)serA-F 5' -AAGCTTCGCCAGTCGGGATATTAAG-3‘ (SEQ ID NO 23)serA-R 5' -AAGCTTGCAGCAACGCGGCAACGG-3‘ (SEQ ID NO 24)3. pTrp 的構(gòu)建以pSUNaroG-serA為模板，用引物GA-F和GA-R擴(kuò)增PtrcaroG_serA片段，兩端分 別添加)(ba I位點(diǎn)，克隆入pSUNtrp的)(ba I位點(diǎn)獲得質(zhì)粒pTrp (連接反應(yīng)條件及體系同 實(shí)施例6第1步)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。引物序列如下GA-F 5' -TCTAGAGTCAATTCTCATGTTTGAC-3‘ (SEQ ID NO 25)GA-R 5' -TCTAGAGGATCCCCGGGTACCCGG-3‘ (SEQ ID NO 26)實(shí)施例6中PCR擴(kuò)增所用試劑及酶均購于TAKARA，pMD18_T購于TAKARA，TA克隆 及酶切方法參照TAKARA說明書，酶切反應(yīng)參照TAKARA說明書進(jìn)行，膠回收試劑盒購于杭州
愛思進(jìn)。實(shí)施例7 重組質(zhì)粒pSKKAC的構(gòu)建1.重組質(zhì)粒pSU-F的克隆以E. coli DH5 α (Amersham公司)的基因組為模板，禾丨』用引物P148L(+)、 P148L(-)、aroFSac I (+)和 aroFSacI (-)進(jìn)行重疊 PCR，擴(kuò)增 E. coli DH5 α 的 aroF 基因， 引物序列如下P148L(+) 5' -TTAGATCTGAATAGCCCGCAATACCTGGGC-3‘ ； (SEQ IDNO 27)P148L(-) 5' -GCTATTCAGATCTAACGCTTCCGTCGCCAGTGG-3‘ ；(SEQ ID NO 28)aroFSac1(+) 5' -AACGAGCTCACCGGAAAGTCCTCGGGCATAAG—3‘ ；(SEQ ID NO 29)aroFSacK-) 5' -AACGAGCTCCGACTTCATCAATTTGATCGCGTAA-3‘ ； (SEQ ID NO 30)首先用引物對aroF&icK+)和P148L(+)擴(kuò)增出一個(gè)0. 91Λ長的片段，擴(kuò)增條件 為94 °C，2min, 94 "C，45sec, 56 "C，45sec, 72 "C，Imin，30 循環(huán)；再用引物對 aroFSacI (-) 和 P148L (-)擴(kuò)增出另一個(gè)片段 0. 7kb，擴(kuò)增條件為:94°C, 2min, 94°C，45sec，56 "C，Imin， 72°C，lmin，30循環(huán)；膠回收上述兩個(gè)PCR片段，再用引物對aroF&icI (+)和aroF&icI(-)擴(kuò) 增出 aroF 全長基因擴(kuò)增條件為-MV，2min, 94°C，45sec, 56°C，1. 5min, 72°C，Imin, 30 循 環(huán)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示已經(jīng)將E. coli DH5a中的aroF基因148位脯氨酸突變成 亮氨酸，克隆得到突變的aroF基因，然后將PCR片斷用McI酶切后克隆至pSU2718質(zhì)粒 (Martinez,E. ,B. Bartolome,and F. de la Cruz. 1988. pACYC184-derived cloningvectors containing the multiple cloning site and IacZ α reportergene of pUC8/9 and PUC18/19 plasmids. Gene 68 :159-162)，得到重組質(zhì)粒 pSU_F。2.重組質(zhì)粒pSU-FE的克隆以Ε. coli DH5a的基因組為模板，利用引物aroE (NcoI)和aroE (BamI)，PCR擴(kuò)增 E.coli DH5a的aroE基因，引物序列如下aroE(NcoI) 5' -CATGCCATGGAAACCTATGCTGTTTTTG-3‘ ；(SEQ ID NO 31)aroE(BamI) 5' -CGGGATCCTCACGCGGACAATTCCTCCTG-3‘ ； (SEQ IDNO 32)擴(kuò)增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，lmin，30循環(huán)。
擴(kuò)增得到的aroE基因膠回收，用NcoI和BamHI酶切后，克隆至質(zhì)粒 pTrc99a (Pharmacia 公司)，得到重組質(zhì)粒 pTrc_aroE。酶切體系10 X Buffer 1 μ 1，待切 樣品2 μ 1，酶0. 5-1 μ 1，加水補(bǔ)足10 μ 1，37°C溫育1-2小時(shí)。(酶切所用試劑及酶均購于 TAKARA，連接反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1步)；以質(zhì)粒p^Trc-aroE為模板，利用引物aroE (BglII)和aroE (BamI)，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒 pTrc-aroE中的aroE基因，引物序列如下aroE(BglII) 5' -GAAGATCTCGACATCATAACGGTTCTGGC-3‘ ；(SEQ IDNO 33)aroE(BamI) 5' -CGGGATCCTCACGCGGACAATTCCTCCTG-3‘ ；(SEQ IDNO 34)擴(kuò)增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，lmin，30循環(huán)。擴(kuò)增得到的aroE基因再以BglII和BamHI酶切克隆至載體質(zhì)粒pSU_F，得到重組 質(zhì)粒pSU-FE (酶切反應(yīng)條件及體系同上，連接反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1步)。3.重組質(zhì)粒pSU-FEB的構(gòu)建以E. coli DH5a的基因組為模板，利用引物aroB (NcoI)和aroB (SacI)，PCR擴(kuò)增 E.coli DH5a的aroB基因，引物序列如下aroB(NcoI) 5' -CATGCCATGGATGGAGAGGATTGTCG-3‘ ；(SEQ ID NO 35)aroB(Sall) 5' -GCGTCGACTTACGCTGATTGACAATC-3‘ ； (SEQ ID NO 36)擴(kuò)增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，lmin，30循環(huán)。擴(kuò)增得到的aroB基因以NcoI和Mil酶切后克隆至質(zhì)粒pET28 (b) (Novagen公 司)，得到重組質(zhì)粒pET-aroB，再使用)(ball和Mil酶切重組質(zhì)粒ρΕΤ-aroB，將切下的aroB 基因克隆至pSU-FE，得到重組質(zhì)粒pSU-FEB (酶切反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例7第2步，連接 反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1步)。4.重組質(zhì)粒pSU-FEBP的構(gòu)建以E.coli DH5a的基因組為模板，利用引物ppsA-3和ppsA-4，PCR擴(kuò)增Ε. coli DH5 α的ppsA基因，引物序列如下ppsA-3 5' -CGGAATTCAAACGCACAGAAGCGTAGAACG-3‘ ； (SEQID NO 37)ppsA-4 5' -CGGGATCCCATAACCCCGGCGACTAAACGC-3‘ ； (SEQID NO 38)擴(kuò)增條件為:94°C，2min，94°C，45sec，57°C，45sec，72°C，2.5min，30 循環(huán)。將重組質(zhì)粒pSU-FEB用HindiII酶切后補(bǔ)平(參照TAKARA說明書Klenow酶 補(bǔ)平方法進(jìn)行)，然后將擴(kuò)增得到的PPsA基因的平端連接至pSU-FEB，得到重組質(zhì)粒 pSU-FEBP (酶切反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例7第2步，連接反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1 步)O5.重組質(zhì)粒pSK的構(gòu)建以大腸桿菌K-12 (GenBank登錄號U00096)的基因組為模板，利用引物 tktAF (NdeI)和tktAR(BamHI)，PCR擴(kuò)增大腸桿菌K-12的tktA基因，引物序列如下tktAF(NdeI) 5' -GGAATTCCATATGTCCTCACGTAAAGAGCTTG-3‘ ； (SEQID NO 39)tktAR(BamHI) 5' -CGGGATCCTTACAGCAGTTCTTTTGCTTTCG-3‘ ； (SEQID NO 40)擴(kuò)增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，2min，30循環(huán)。擴(kuò)增得到的tktA基因以NdeI和BamHI酶切后克隆至pET_M (a) (Novagen公司) 中，得到質(zhì)粒pET-tktA(連接反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1步)。
以質(zhì)粒pET-tktA為模板，使用引物tktA(I)和tktA(II)，PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒 pET-tktA中的tktA基因連同pET24 (a)中的RBS位點(diǎn)，引物序列如下tktA(I) 5' -CATGCATGCTCTCAGTGGTGGTGGTGGTG-3' ；(SEQ IDNO 41)tktA(II) 5' -CATGCATGCTTACAGCAGTTCTTTTGCTTTCG-3' ； (SEQID NO 42)擴(kuò)增條件為94°C，2min，94°C，45sec，60°C，45sec，72°C，2min，30循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物以SphI酶切后克隆至質(zhì)粒pSU-FEBP，得到重組質(zhì)粒pSK，其結(jié)構(gòu)如圖2 所示。(酶切反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例7第2步，連接反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1步)6.重組質(zhì)粒pSKKAC的構(gòu)建以W3110基因組為模板，分別PCR擴(kuò)增aroK，兩端加NcoI、BamHI位點(diǎn)，TA克隆(同 實(shí)施例6，參照TAKARA說明書)，得到重組質(zhì)粒pMD-K ；擴(kuò)增aroA，兩端加BamHIJstI位點(diǎn)， 得到重組質(zhì)粒PMD-A ；擴(kuò)增aroC，兩端加I3StIdindIII位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pMD_C。引物序 列如下，其中下劃線部分為RBS，來源于pETM (a)pFarok 5，-GCCATGGCAGAGAAACGCAATATC-3，(SEQ ID NO 43)pRarok 5' -GGGATCCTTAGTTGCTTTCCAGCATG-3，(SEQ ID NO 44)pFaroA 5' -CGGATCCAAGMGGAGATATACATGGAATCCCTGACGTTAC-3' (SEQ ID NO 45)pRaroA 5' -CCTGCAGTCAGGCTGCCTGGCTAATCC-3，(SEQ ID NO 46)pFaroC 5' -CCTGCAGAAGMGGAGATATAGATGGCTGGAAACACAATTG-3' (SEQ ID NO 47)pRaroC 5' -CAAGCTTTTACCAGCGTGGAATATCAG-3，(SEQ ID NO 48)擴(kuò)增條件為:94°C，2min，94°C，45sec，55°C，45sec，72°C，1.5min，30 循環(huán)。以NcoI、BamHI酶切pMD-Κ，回收aroK片段(600bp)，克隆至質(zhì)粒 pTrc99a (Pharmacia 公司)，得到重組質(zhì)粒 pTrc-K ；以 BamHUstI 酶切 pMD-Α，回收 aroA 片 段(1. 3kb)，克隆至質(zhì)粒pTrc-K，得到重組質(zhì)粒pTrc-KA ；以I3StLHindIII酶切pMD_C，回收 片段(1. Ikb)，克隆至質(zhì)粒pTrc-KA，得到重組質(zhì)粒pTrc_KAC。(連接反應(yīng)條件及體系同實(shí) 施例6第1步)以質(zhì)粒 PiTrc-KAC 為模板，利用引物 iTrc-KAC-F (NheI)和 iTrc-KAC-R(NheI)擴(kuò)增帶 Ptrc的trc-KAC片段(2. 9kb)，克隆至質(zhì)粒pSK，得到重組質(zhì)粒pSKKAC (如圖3所示)。連 接反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例6第1步，所用引物序列如下Trc-KAC-F(NheI) :5，-CGCTAGCGTAAATCACTGCATAATTC-3，(SEQ ID NO 49)Trc-KAC-R(NheI) :5，-GGCTAGCATGAGCGGATACATATTTG-3，(SEQ ID NO 50)擴(kuò)增條件為94°C，2min，94°C，45sec，55°C，45sec，72°C，3min，30循環(huán)。實(shí)施例7中PCR擴(kuò)增所用試劑及酶均購于TAKARA，pMD18_T購于TAKARA，TA克隆、 酶切及補(bǔ)平方法參照TAKARA說明書，膠回收試劑盒購于杭州愛思進(jìn)。實(shí)施例8 =L-色氨酸重組表達(dá)菌株的獲得將實(shí)施例1-5獲得的多種敲除基因的大腸桿菌宿主菌CGSC7692突變體制成感受 態(tài)細(xì)胞，然后用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法或電擊轉(zhuǎn)化方法將實(shí)施例6和7獲得的多種組合重組表達(dá)質(zhì) 粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化具體方法參考《分子克隆III》第1章96頁)。即將pTrp、pTrp/pSKKAC重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入宿主菌CGSC7692、 CGSC7692 ( Δ pheA Δ tyrA)和CGSC7692 ( Δ trpR)中，獲得了 L-色氨酸發(fā)酵生產(chǎn)基因工程菌 如表1所示
表1.獲得的基因工程菌
權(quán)利要求
1.一種L-色氨酸生產(chǎn)菌，其特征在于所述L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸 代謝途徑相關(guān)的基因被突變，并且/或者一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因敲除 或失活，并且/或者一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因被過表達(dá)；優(yōu)選地，其中所 述突變基因?yàn)閍roFfto和/或aroGfto、trpEfe，并且其中所述突變基因aroFfto和/或aroG^"、 trpE*具有代謝終產(chǎn)物抗反饋抑制脫敏的特性，更優(yōu)選地所述MoFfto的突變?yōu)?48位脯氨 酸突變成亮氨酸；優(yōu)選地，其中所述敲除或失活基因?yàn)閠yrR、trpR、tnaA、tyrA和pheA中的 一個(gè)或幾個(gè)；優(yōu)選地，其中所述過表達(dá)的基因?yàn)閍roF "、aroB、aroE、aroD、aroL和/或aroK、 aroA、aroC、trpEfbrDCBA、serA、ppsA 禾口 tktA。
2.權(quán)利要求1所述的L-色氨酸生產(chǎn)菌，其中所述基因是組合表達(dá)在合適拷貝的表達(dá)載 體上或整合在基因組上。
3.權(quán)利要求1所述的L-色氨酸生產(chǎn)菌，其特征在于其中所述敲除或失活基因?yàn)閠yrR、 trpR、tnaA、tyrA和pheA中的一個(gè)或幾個(gè)同時(shí)被敲除或失活。
4.一種重組載體pTrp，其特征在于在pSUN007的多克隆位點(diǎn)中插入以下基因虹⑷*、 SerA 和 trpE—DCBA 基因。
5.一種重組載體pSKKAC，其特征在于在pSU2718的多克隆位點(diǎn)中插入以下基因 BroFfbr, aroE、aroB、ppsA、tktA, aroK、aroA 和 aroC，其中所述 BroFfbr 是經(jīng)突變的，優(yōu)選地 所述突變?yōu)閍roFfto的148位脯氨酸突變成亮氨酸。
6.權(quán)利要求3所述的L-色氨酸生產(chǎn)菌，其特征在于其還被權(quán)利要求4所述的重組載體 pTrp和/或權(quán)利要求5所述的重組載體pSKKAC所轉(zhuǎn)化。
7.權(quán)利要求1-6中所述的L-色氨酸生產(chǎn)菌屬于大腸桿菌種屬。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述菌株在L-色氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求4或5所述的重組載體在制備用于生產(chǎn)L-色氨酸的L-色氨酸生產(chǎn)菌中的 用途。
10.一種發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的生產(chǎn)方法，其中使用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述菌株作為 發(fā)酵生產(chǎn)菌。
11.一種L-色氨酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟中一步或多步A、L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因敲除或失活；B、L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因被突變；C、L-色氨酸生產(chǎn)菌中一個(gè)或多個(gè)與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因被過表達(dá)。D、將含有L-色氨酸代謝途徑中被突變和被過表達(dá)關(guān)鍵基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因敲除 菌株中，獲得了 L-色氨酸的生產(chǎn)菌株。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟A包括敲除或失活基因?yàn)閠yrR、 trpR、tnaA、tyrA禾口 pheA中的一個(gè)或幾個(gè)。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟B包括突變基因?yàn)閍roFfto和/ 或MoGfl^trpEfto,并且其中所述突變基因aroFfto和/或MoGfto和具有代謝終產(chǎn)物 抗反饋抑制脫敏的特性。
14.如權(quán)利要求11中所述的方法，其特征在于，所述步驟C包括過表達(dá)的基因?yàn)?aroFftr、aroB、aroE、aroD、aroL 禾口 / 或 aroK、aroA、aroC、trpEfbrDCBA、serA、ppsA 禾口 tktA。
15.如權(quán)利要求11中所述的方法，其特征在于，所述步驟D包括權(quán)利要求4的重組質(zhì)粒和/或權(quán)利要求5的重組質(zhì)粒。
16.如權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將權(quán)利要求15中的重組質(zhì)粒 pTrp、pSKKAC轉(zhuǎn)入基因敲除菌株中，從而獲得了 L-色氨酸生產(chǎn)菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L-色氨酸生產(chǎn)菌株，其基因工程構(gòu)建方法及發(fā)酵法生產(chǎn)制備L-色氨酸的方法，通過基因工程的手段將L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的基因進(jìn)行突變，缺失，促使L-色氨酸代謝失調(diào)，造成L-色氨酸高產(chǎn)，同時(shí)通過基因整合，或通過適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體過表達(dá)L-色氨酸代謝途徑相關(guān)基因，造成L-色氨酸代謝流的增強(qiáng)，最終通過發(fā)酵生產(chǎn)造成發(fā)酵液中大量積累L-色氨酸。
文檔編號C12N1/21GK102140431SQ201010598350
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者于麗, 劉映淼, 吳輝, 孫兵兵, 孫周通, 李成玉, 楊俊杰, 楊晟, 王德輝, 王祎, 黃鶴 申請人:大成生化科技(松原)有限公司