專利名稱：一種基因、重組質(zhì)粒及在提高番茄果實(shí)色素積累中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種調(diào)控番茄果實(shí)色素積累的基因、真 核重組質(zhì)粒及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番茄紅素是重要的抗氧化劑之一，具有清除活性氧自由基、促進(jìn)細(xì)胞間隙連接通 訊、防癌抗癌等多種生理功能。近年來(lái)基因工程從對(duì)結(jié)構(gòu)基因的遺傳操作已拓展到對(duì)調(diào)節(jié)基因的遺傳操作 (Gantet P et al.，2002，Trends Pharmacol Sci，23 :563-9 ；Wagoner W et al. 2003， Activation tagging in tomato identifies a transcriptional regulator of anthocyanin biosynthesis, modification, and transport. Plant Cell，15 :1689-703)0 通過(guò)RNA干擾技術(shù)(RNAi)獲得目標(biāo)基因表達(dá)水平降低的轉(zhuǎn)基因植株，再觀察轉(zhuǎn)基因植 株的表現(xiàn)型來(lái)研究基因的功能，也就是功能基因組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的反向遺傳學(xué)方 法。如，利用CaMV35S啟動(dòng)子在番茄中過(guò)量表達(dá)燕麥的紅光和遠(yuǎn)紅光受體光敏素(PHYA) 可以引起番茄果實(shí)高色素表現(xiàn)型，葉片和果實(shí)顏色加深，但植株矮化(Boylan MT, Quail PH. 1989，Oat phytochrome is biologically active in transgenic tomatoes. Plant Cell，1 :765-7 。過(guò)量表達(dá)藍(lán)光受體隱花色素(CRY》基因也可以提高果實(shí)中類黃酮和 番茄紅素的含量，葉片中葉綠素和花青素含量提高，植株矮化(Leonardo G，et al. ,2005, Manipulation of the Blue Light Photoreceptor Cryptochrome 2 in Tomato Affects Vegetative Development, Flowering Time, and Fruit Antioxidant Content. Plant Physiology, 137 :199-208)。利用RNAi技術(shù)組成型地干涉光形態(tài)建成的正調(diào)控基因LeHY5 的表達(dá)，使番茄果實(shí)的類胡蘿卜素含量和葉片中的葉綠素的含量下降，而光形態(tài)建成的負(fù) 調(diào)控基因LeCOPlLIKE的RNAi轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的總含量明顯提高，葉片呈現(xiàn) 深綠色。(Liu YS, et al. , 2004,Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato. Proc Natl Acad Sci USA,101 9897-902)。番茄中存在一類單基因的高色素突變體hpl (high pigment-1)和hp2(high pigment-幻，這類突變體的成熟果實(shí)積累的類胡蘿卜素總量可以達(dá)到野生型的三倍，同時(shí) 葉片和未成熟的綠果實(shí)中葉綠素的含量也比野生型的高，但這類突變體的幼苗對(duì)光存在超 敏反應(yīng)(hyper-responsiveness to light)下胚軸伸長(zhǎng)被抑制和花青素大量積累。研究發(fā) 現(xiàn)這類突變體可能影響光敏受體(phytochrome)和藍(lán)光受體(crytochrome)下游的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)(Songhu Wang, et al. ,2008, Altered plastid levels and potential for improved fruit nutrient content by downregulation of the tomato DDB1-interacting protein CUL4, The PlantJournal,55,89-103)。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中雖然公開了一些用于調(diào)控番茄果實(shí)色素積累的基因，但通 過(guò)基因工程技術(shù)克隆和篩選出更多的調(diào)節(jié)基因，對(duì)提高番茄果實(shí)色素積累，培育品質(zhì)優(yōu)良 的番茄仍然有著重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的基因、真核重組質(zhì)粒及其制備方法，本發(fā)明的 目的之二是將所述基因和真核重組質(zhì)粒在提高番茄果實(shí)色素積累中應(yīng)用，以培育出品質(zhì)更 好的番茄。本發(fā)明的技術(shù)方案如下利用生物信息學(xué)方法分析確定一個(gè)與質(zhì)體分裂調(diào)控有關(guān)的基因HPl (Gene Bank AY531660. 1)作為誘餌基因構(gòu)建到PLexA酵母雙雜交系統(tǒng)的表達(dá)載體中，然后利用番茄果 實(shí)發(fā)育的目標(biāo)基因文庫(kù)(所述文庫(kù)及其構(gòu)建見實(shí)施例1)篩選到與HPl基因相互作用的目 標(biāo)基因,命名為HP5 (high-pigment 5)基因。序列分析顯示基因HP5的mRNA包含1551個(gè) 堿基的開放閱讀框，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO 2 所示。在 DFCI 網(wǎng)站(http//compbio. dfci. harvard, edu)找到 7 個(gè) EST (expressed sequence tag)，顯示該基因可能是番茄的一個(gè)調(diào)節(jié)基因。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列中的基因片 段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是位于起始密碼子下游1135bp至1549bp的核苷酸 序列，將所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的 基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于步驟如下(1)在序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基 因片段是位于起始密碼子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入 到質(zhì)粒PSK載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK 中間載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子；(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段 的部分，然后連接到真核表達(dá)載體上，即獲真核重組質(zhì)粒。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒及其制備方法中，所述真核表達(dá)載體為pHB、pM0N1772、 pBE12、pBC7、pBI121 中的一種。將本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化番茄，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。實(shí)驗(yàn)表明所述轉(zhuǎn) 基因番茄植株的未成熟果實(shí)顏色明顯深于野生型番茄植株的未成熟果實(shí)；對(duì)成熟的轉(zhuǎn)基因 番茄果實(shí)和野生型番茄果實(shí)的番茄紅素的含量進(jìn)行測(cè)定顯示與野生型番茄的番茄紅素含 量相比，轉(zhuǎn)基因番茄的番茄紅素含量有明顯的提高。由此可見，本發(fā)明所述基因HP5和真核 重組質(zhì)粒能夠調(diào)控質(zhì)體的發(fā)育和調(diào)控番茄果實(shí)色素積累，可在提高番茄果實(shí)色素積累中應(yīng) 用。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選，克隆了一個(gè)新的基因HP5，并從該基因的核苷 酸序列中選擇了一段基因片段與真核表達(dá)載體構(gòu)建真核重組質(zhì)粒，為提高番茄果實(shí)色素積 累提供了一種新的真核重組質(zhì)粒，有利于番茄品質(zhì)的改良。2、本發(fā)明所用的基因?yàn)榉驯旧碜杂械幕颍赞D(zhuǎn)基因番茄的安全性能高。3、本發(fā)明所述基因的克隆和番茄轉(zhuǎn)基因均為常規(guī)方法，所需材料易于獲取。


圖1是本發(fā)明所述基因HP5全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增電泳圖，圖中，M泳道分子量標(biāo)記 (Trans2k plus DNAMarker，購(gòu)自TRANS公司)；1泳道基因HP5的全序列。圖2是本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒(pBI121_HP5RNAi)的一種示意圖，其中，sense為 正向基因片段，anti-sense為反向基因片段。圖3是真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄植株中轉(zhuǎn)基因抗性篩選標(biāo)記卡 那霉素抗性基因(NPTII)的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中，M泳道=Marker (DL2000) ；P泳道陽(yáng)性 對(duì)照，PCR模板為真核重組質(zhì)粒pBI121-HP5RNAi ；C泳道陰性對(duì)照，PCR模板為野生型番茄 植株DNA ； 1-7泳道PCR模板為候選的轉(zhuǎn)基因番茄植株DNA。圖4是番茄植株的RT-PCR鑒定結(jié)果圖，圖中，WT泳道野生型番茄植株；1泳道真 核重組質(zhì)粒pBI121-HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄1號(hào)植株；2泳道真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi 轉(zhuǎn)基因番茄2號(hào)植株；3泳道真核重組質(zhì)粒pBI121-HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄3號(hào)植株。圖5是真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片和野生型葉片的顏色 對(duì)比照片，從左至右計(jì)數(shù)，第1 3片番茄葉分別為pBI121-HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄1號(hào)、2號(hào)、 3號(hào)植株的葉片；第4片番茄葉為野生型番茄植株的葉片。圖6是真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片和野生型番茄植株葉 片葉綠素含量測(cè)定的統(tǒng)計(jì)圖，圖中，WT代表野生型番茄植株，圖7是真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)和野生型番茄果實(shí)在綠肩 (green shoulder)期間的色素含量對(duì)比照片，其中，A為野生型番茄果實(shí)；B、C、D為分別為 pBI121-HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)的果實(shí)。圖8是真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄植株和野生型番茄植株在相同 的生長(zhǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)60天后植株的表型對(duì)比照片，圖中，WT代表野生型番茄植株。圖9是真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄植株和野生型番茄植株節(jié)間長(zhǎng) 的統(tǒng)計(jì)分析圖，圖中，WT代表野生型番茄植株。圖10是根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖11是真核重組質(zhì)粒pBI121_HP5RNAi轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中的番茄紅素含量和野生 型番茄果實(shí)中的番茄紅素含量測(cè)定統(tǒng)計(jì)分析圖，圖中，WT代表野生型番茄植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件 的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照 制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 番茄果實(shí)發(fā)育的目標(biāo)基因文庫(kù)(cDNA)構(gòu)建1、番茄果實(shí)Total RNA的提取1)液氮迅速研磨番茄果實(shí)(直徑2-3cm的綠色果實(shí))，按50_100mg組織/ml Trizol (購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司)加入Trizol，劇烈震蕩，室溫放置5min。2) 212，OOOrpm 離心 5min。3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置!Bmin。
4) 4"C 12，OOOg 離心 15min。5)取上清，按0. 5ml異丙醇/ml Trizol加入異丙醇混勻，室溫放置lOmin。6) 4°C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底。7)按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。8) 4"C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清。9)室溫干燥5-lOmin (RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。)。10)用 50ul DEPC-H20 溶解 RNA 樣品，55-60°C，5-10min。2.、磁珠法分離mRNA (promega mRNA分離試劑盒，購(gòu)于寶信生物技術(shù)有限公司)1)在 RNase-free 的 Eppendorf 管中加入 0. 1 1. Omg 的總 RNA 禾口 RNase—free /K 至終體積為500ul.2) 65 °C 加熱 10 分鐘。3)加入3ul生物素標(biāo)記的Oligo (dT)和13ul 20 X SSC于RNA中，輕輕混合，室溫 放置逐漸冷去至室溫，一般需10分鐘左右。4)同時(shí)配 0.5 X SSC 1. 2ml 和 0. 1 X SSC 1.4ml.5)將磁珠(SA-PMPs)輕晃散開，放入磁性分離架上，使SA-PMPs集中于管的一側(cè) (約30sec)，小心去上清，切不可離心。用0. 3ml 0. 5 Xssc漂洗SA-PMPs，用磁性分離架集 中磁珠，去除上清，重復(fù)3次。6)將漂洗后的SA-PMPs重新懸浮于0. Iml 0. 5Xssc，注意漂洗后的SA-PMPs應(yīng)在 30分鐘內(nèi)使用。7)將(3)中的oligo (dT) /mRNA退火反應(yīng)物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，輕 輕搖勻，室溫下放10分鐘。8)用磁性分離架捕獲SA-PMPs，小心去上清，但不要棄去。9)用0. 1 X SSC,每次0. 3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs懸浮，最后一次漂洗后盡 可能多的吸取水相，而不損壞SA-PMPs。10)將SA-PMPs重新懸浮在0. Iml RNase-free水中，反復(fù)顛倒，使SA-PMPs散開， 洗脫mRNA。11)用磁性分離架捕獲SA-PMPs，將洗脫的mRNA吸入另一個(gè)新的Eppendorf管中。12)將SA-PMPs再懸浮于0. 15ml RNase-free的水中，洗脫，與(11)步洗脫液合并。13)將得到的mRNA溶液取幾微升跑電泳，若mRNA濃度不足以進(jìn)行下一步的反轉(zhuǎn) 錄，則需將得到的mRNA溶液濃縮(濃縮步驟見14-18)。14)加0. 1體積的3mol/l NaAc和1. 0體積的異丙醇于洗脫液中，_20°C沉淀過(guò)夜。15)4°C，13000g離心60分鐘。去上清，加入500ul 70%乙醇混勻。16)4°C，7500g 離心 10 分鐘。17)去上清，真空或空氣中自然風(fēng)干，但不要太干，加適量RNase-free水溶解。18)重復(fù)步驟5-12，將步驟8保留下的樣品重新上柱。3、cDNA雙鏈合成(promega cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，購(gòu)于寶信生物技術(shù)有限公司)3. ISuperscipt II-RT 合成第一鏈1)在一 RNase-free 的 0. 2ml PCR 管中，加入
5ul mRNA (大約 500ng)Iul Xho I Primer (1. 4ug/ul)(5，GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT. · · 3，)6ul RNase-free water2)混勻后，70°C反應(yīng)10分鐘。3)反應(yīng)完成后，立刻將反應(yīng)體系置于冰上5min。稍微離心一下，順序加入以下試劑5Xfirst strand buffer,4ul ；0. IM DTT，2ul ；IOmM dNTP, Iul ；混勻，稍微離心反 應(yīng)物之后，42°C放置2分鐘；反應(yīng)完成，趁熱加入Iul Superscipt II-RT，混勻；42°C反應(yīng)50 分鐘，然后70°C，15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。3. 2cDNA第二鏈的合成1)第一鏈反應(yīng)完成后，取2ul —鏈產(chǎn)物_20°C冰箱中保存，待電泳檢測(cè)。其余的產(chǎn) 物合并，混勻，然后順序加入下列試劑(promega)10XDNA Polymerase I buffer, 20u 1 ； IOmM dNTP，6ul;dd H20,163ul ；RNase H(2U/ul)，Iul ；DNA Polymerase I (lOU/ul)，IOul ；總體系為 200ul。2)混勻后，16°C反應(yīng)2. 5小時(shí)。3)70°C滅活 10 分鐘。4)反應(yīng)完成后，得到200ul cDNA第二鏈反應(yīng)體系，將此體系置于冰上?；萌?111 二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一起電泳鑒定。同時(shí)上11Λ ladder，確定 雙鏈的大小范圍。3. 3雙鏈cDNA末端補(bǔ)平1)在第二鏈反應(yīng)體系中，順序加入下列試劑(promega cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，購(gòu) 于寶信生物技術(shù)有限公司)IOmM dNTP，6ul ；T4 DNA Polymerase(8. 7U/ul) ,2ul ；BSA(10mg/ml)，2ul。2)稍微離心混勻反應(yīng)物，37°C反應(yīng)至少30分鐘，然后75°C滅活10分鐘。3)加入等體積酚/氯仿/異戊醇，劇烈振蕩后，常溫下13000g離心5分鐘。4)離心后，吸取上清于另一 1. 5ml eppendof管中，加入等體積氯仿，上下顛倒幾 次混勻后，常溫下13000g離心5分鐘。5)吸取上清至另一 ^pendof管，加入1/10V3M NaAc (PH5. 2)和2. 5V預(yù)冷的無(wú)水 乙醇，混勻，_20°C放置過(guò)夜以沉淀雙鏈cDNA。6)第二日，將昨日沉淀物在4°C，13000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA。7)離心完畢，棄上清，加入Iml 70%乙醇洗滌沉淀，常溫下13000g離心5分鐘。8)離心完畢，棄上清，干燥沉淀至無(wú)乙醇?xì)馕丁?) PCR純化試劑盒操作流程9-1)溶液PE使用前應(yīng)加入適量體積95% -100%的乙醇，混勻。9-2)向200ul 二鏈補(bǔ)平產(chǎn)物中加入5倍體積的buffer PB,混勻。9-3)加入 spin column 中，13000rpm 離心 lmin。9-4)加入 0. 75ml buffer ΡΕ, 13000rpm 離心 lmin。9-5) 13000rpm,再離心 lmin。
9-6)將 spin column 放入一新的離心管中，加入 50ul buffer EB，靜置 lOmin。9-7) 13000rpm 離心 2min。9-8)加入 30ul buffer EB，靜置 IOmin09-9) 13000rpm 離心 2min。9-10)加入1/10體積3M的NaAc，2. 5倍體積無(wú)水乙醇，混勻，_20°C沉淀過(guò)夜。3. 4EcoR I 接頭(adaptor)力口接1)往雙鏈 cDNA 沉淀中加入 9ul EcoR I adaptor (400ng/ul)，4°C至少放置 30 分 鐘以充分溶解cDNA沉淀。2)溶解完成后，順序加入下列試劑IOXLigase Buffer, 1. 2ul ； IOmM rATP, Iul ；T4DNA Ligase，Iul。3)混勻后，4°C連接3days，或者8°C過(guò)夜連接。3. 5雙鏈cDNA末端的磷酸化及Β ο I酶切1)連接反應(yīng)完成后，將反應(yīng)體系70°C放置15分鐘滅活T4DNA Ligase02)稍微離心使反應(yīng)物集中至管底，室溫下放置5分鐘，然后加入下列試劑IOXLigase Buffer, Iul ； IOmM rATP, Iul ；dd H20，6ul ；T4PNK (10U/ul)，Iul。3)37°C反應(yīng)30分鐘，然后70°C滅活15分鐘。4)稍微離心使反應(yīng)物集中至管底。5)室溫放置5分鐘；然后加入下列試劑Xho 10XBuffer,4ul ；BSA,2ul ；ddH20,5ul ；Xho I (10U/ul)，8ul。6)37°C反應(yīng)1. 5小時(shí)，然后65°C滅活酶10分鐘。7)反應(yīng)完成，雙鏈cDNA合成完畢。置于4°C準(zhǔn)備回收。3.6膠回收cDNA IAEXII GEL Extraction Kit回收試劑盒，購(gòu)于保守寶信生物技 術(shù)有限公司)1)配制小膠數(shù)板(每個(gè)樣品一板)瓊脂糖凝膠，2ul EB/300ml膠。2)取4°C保存樣品上樣，40ul/孔。3)電泳 50V;lhr。4)紫外燈下分別切下500 IkbU. 0-2. Okb及2. 0-4. Okb cDNA片段·，分別放入 已做標(biāo)記的1.5ml離心管中。5)稱取膠重，加入三倍體積buffer QXI (例如，IOOmg膠中加入300ul buffer QXI)。6)50°C水浴數(shù)分鐘，至膠完全融化。用手指彈QIAEX II使重懸，每管中加入 5ulQIAEXII。7) 50°C水浴lOmin，每隔^iin取出顛倒混勻數(shù)次，使QIAEX II保持懸浮。8)4°C,13000rpm,30seco (棄上清，離心機(jī)中甩一下，吸取上清)。9)加入 500ul buffer QXI，輕彈管底使 QIAEX II 重懸。10)離心并去上清(同操作8)。11)加入 500ul buffer PE，重懸 QIAEX II，離心 30sec，去上清。12)再加入500ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30sec，棄上清，離心機(jī)中甩一 下，吸去上清。
13)超凈臺(tái)上吹干(至無(wú)乙醇味)，加入IOul elution buffer，重懸QIAEX II，靜 置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。14)取Iul上清上樣電泳，同時(shí)做分子量標(biāo)準(zhǔn)(11Λ ladder)及DNA含量標(biāo)準(zhǔn) (10ng，20ng)作對(duì)照。15)將收回的cDNA置于_20°C內(nèi)保存，據(jù)電泳結(jié)果，取適量DNA進(jìn)行連接。4、載體制備4. IpBlueScriptII的提取(promega cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，購(gòu)于寶信生物技術(shù)有 限公司)1)取Iul商品的pBlueScriptll，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌中，取5ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻 涂布在含AMP的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。2)第二天取一只無(wú)菌的50ml離心管，加入IOml AMP抗性的LB液體培養(yǎng)基，挑單 克隆于離心管中，370C，250rpm,培養(yǎng)過(guò)夜。3)第三天取200μ 1小搖后的菌液接種于250ml含AMP的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C， 250rpm培養(yǎng)6hr左右，使OD值達(dá)到0. 6-0. 8。4)將菌液移入250ml離心管中，4°C，3000rpm，離心15min。取出離心管，菌團(tuán)朝上 倒掉上清，將離心管倒置于吸水紙上使上清充分濾干。5)力卩入 IOml 溶液 I (50mM Glucose, 25mM Tris-HCl, IOmM EDTA, ρΗ8· 0)，力口入 RNase至終濃度100 μ g/ml，晃動(dòng)搖菌，使菌體充分懸浮，靜置lOmin。6)按Na0H(0.4N) SDS(2% )—1 1的比例新鮮配制溶液II，加入20ml溶液 II，靜置 3-5min。7)加入15ml冰浴的溶液III，冰浴15_30min。8)4°C，5000rpm，離心 15min。9)取上清于兩個(gè)50ml離心管中，棄去原離心管中的沉淀。10)每管加入0. 6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置IOmin。11)20°〇，1200(^，離心201^11回收質(zhì)粒沉淀。12)棄上清，用70%的乙醇洗2次。13)棄上清，倒扣于吸水紙上，盡量空干液體。14)用 3ml TE (pH8. 0)溶解沉淀，移入 1. 5ml Eppendorf 離心管中。15)電泳檢查DNA質(zhì)量并定量。4. 2pBlueScriptII 的雙酶切消化1)以如下體系進(jìn)行EcoRI酶切pBSK⑴，20μ 1 ；ddH20,154μ 1 ； 10XBuffer Ε，20μ 1 ；混勻，加入限制性內(nèi)切酶 EcoRIdOU/μ 1)，6μ 1 ；總體積為，200 μ 1。2)輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機(jī)上甩一下。3)37°〇，水浴1111·。4)加入 200ul 1 1 的酚 / 氯仿，混勻。4°C，13000rpm，離心 15min。5)取上清，加入等體積的氯仿，4°C，13000rpm，離心lOmin。6)取上清，加入0. 1倍體積的NaAC和2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，-20 V，沉淀30min。7)4°C，13000rpm，離心 lOmin，棄上清，取沉淀。
8)加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。9)4°C，13000rpm，離心 lOmin，棄上清，取沉淀。10)自然風(fēng)干沉淀，至無(wú)乙醇味，加入IOOul ddH20充分溶解沉淀。11)加入以下試劑進(jìn)行BioI酶切ddH20, 74 μ 1 ； 10XBuffer D,20y 1 ；混勻，加入限制性內(nèi)切酶 XhoI =XhoI (10U/ μ 1)，6μ 1 ；總體積為 200 μ 1。12)輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機(jī)上甩一下。13)37°〇，水浴1.5111·。14)加入200ul 1 1的酚/氯仿，混勻。15)4°C, 13000rpm，離心 15min。16)取上清，加入等體積的氯仿，4°C，13000rpm，離心lOmin。17)取上清，加入0. 1倍體積的NaAC和2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，_20°C，沉淀30min。18)4°C，13000rpm，離心 lOmin，棄上清，取沉淀。19)加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。20)4°C，13000rpm，離心 lOmin，棄上清，取沉淀。21)自然風(fēng)干沉淀至無(wú)乙醇味，加入40ulddH20充分溶解沉淀，得到雙酶切載體。4. 3載體去磷酸化1)在40ul雙酶切載體中加入以下試劑10 Xbuffer, 6ul ；CIAP (0. 01U/ul)，6ul ；ddH20，8ul ；總體積 60ul。2)輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機(jī)上甩一下。3)37°〇，水浴1111·。4)70°C，15min，滅活酶。5)電泳分離，膠回收雙酶切載體，定量。5、cDNA雙鏈和載體的連接根據(jù)載體和cDNA的電泳定量結(jié)果，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)比例的連接，即dnsert/ vector = 1/3 incert/vector = 1/1 insert/vector = 3/1按以下體系依次加入 ddH20xul
0182]T41igase IOx bufferIul
0183]PBK(E/X)vector (20ng/ul) Iul
0184]cDNA (由濃度及連接比例而定)
0185]T4DNA ligase(3U/ul)Iul
0186]TotalIOul14°C，連接 12 小時(shí)。6、連接產(chǎn)物純化和電轉(zhuǎn)化6.1連接產(chǎn)物純化1)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一 1. 5ml Eppendorf管中，加入下列試劑ddH20, IOu 1 ；3M NaAC (PH5. 2)，2ul ；無(wú)水乙醇，50ul ；輕輕混勻，稍微離心并將其 置于-20°C放置1小時(shí)以上。2) 4°C，top Speed 離心 30 分鐘。
3)小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物；4)加入500ul70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀(注不要離心混勻)。5) 4°C，top Speed 離心 5 分鐘。6)小心移去上清，將此Eppendorf管置空氣中直至無(wú)乙醇?xì)馕丁?)加入10ulddH20重新溶解沉淀，4°C短期保存，_20°C長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?. 2電轉(zhuǎn)化1)從_80°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。2)取1 μ 1純化后的質(zhì)粒于一 1. 5ml的離心管中，將其和0. ICM的電極杯一起置于 冰上預(yù)冷。3)將40 IOOul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1. 5ml的離心管中，小心混勻，冰上 放置IOmin。4)打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2. IKV05)將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極 杯的底部。6)將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入 1000 μ 1的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1. 5ml的離心管中。7) 37 °C, 220-250rpm 復(fù)蘇 1 小時(shí)。8)取20ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160ulS0C涂板，放于37°C溫室，過(guò)夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié) 果，其余菌液加1 1的30%的甘油后混勻-80°c保存。7.菌落PCR
1)取適量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17. 3ul的滅菌水。
2)用滅過(guò)菌的IOul小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。
3)依次加入
IOxbuffer2. 5ul
Mgcl2(25mM)1. 8ul
DNTP (2. 5mM)Iul
T3 引物(IOpmol)Iul
Τ7 引物(IOpmol)Iul
iTaq 酶0. 4ul
total25ul
各試劑均加好后，離心機(jī)上甩一下，使之沉底，置于PCR儀上
4)反應(yīng)條件94 V 5min(預(yù)變性)；94 V 40s (變性)，53. 6 V 30s (復(fù)性)，
72 0C 4min (延伸)，所述變性_復(fù)性_延伸35個(gè)循環(huán)；72 °C 5min (終延伸。)5)待PCR反應(yīng)進(jìn)入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭跑電 泳，同時(shí)上1Kb DNA ladder。半小時(shí)后照相，觀察膠圖，根據(jù)膠圖粗略鑒定插入片段的大小 及小片段率。6)將快速鑒定和菌落PCR檢測(cè)合格的文庫(kù)送檢。8. pBlueScript cDNA 庫(kù)擴(kuò)增1)將cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)入大腸桿菌，如DH5a(DH10B)后，取少量菌液涂布氨芐平板，以推算克隆總量。2)取一大小合適的三角瓶，根據(jù)克隆總量配制2x LB液體，每500ml 2x LB液體可 擴(kuò)增5x105個(gè)克隆，可以適當(dāng)增加2x LB液體的量，但不能少于此比例。3)按每IOOml加0. 3g的比例在2xLB液體中加入瓊脂糖。4) 70°C加熱攪拌至瓊脂糖溶解，高壓滅菌后再70°C攪拌30分鐘。5)37°C放置 1 小時(shí)。6)加入適量安芐青霉素，使之終濃度為50ug/ml。7)加入全部菌液，并輕柔旋轉(zhuǎn)使之混勻，避免振蕩。8)將三角瓶置于冰水中1小時(shí)，水面必須沒過(guò)三角瓶?jī)?nèi)液面。9)輕輕取出三角瓶，30°C培養(yǎng)40-45小時(shí)。10)將三角瓶?jī)?nèi)容物全部轉(zhuǎn)入離心管中，離心10，OOOg, 20分鐘，必須室溫。11)棄上清，每IOOml培養(yǎng)基離心得到的沉淀用IOml 2x LB-甘油(12. 5%)重懸。12)將重懸液留下IOul檢測(cè)滴度，其余分裝于1. 5ml離心管，_80°C冰箱內(nèi)保存。13)取Iul擴(kuò)增后菌液倍比稀釋。14)各取IOul稀釋為10-5和10_6的菌液涂布于含安芐青霉素的LB固體平板上， 37°C過(guò)夜培養(yǎng)，次日計(jì)算其克隆數(shù)以及擴(kuò)增后總克隆數(shù)。通過(guò)本實(shí)施例獲得了番茄果實(shí)發(fā)育目標(biāo)基因的cDNA文庫(kù)。實(shí)施例2 利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選與HPl基因相互作用的目標(biāo)基因1、培養(yǎng)基與試劑1. 1SD/-Ura 液體培養(yǎng)基酵母氮源化他)，0.678;葡萄糖，2.0(^;10\00(-見8，-1^11，-11卬，-此&)，10.01111； 20 XHis，5. Oml ；20 X Leu, 5. Oml ；20 X Trp, 5. Oml ；ddH20 至 100. Oml ； 115°C，滅菌 15min。1. 2YPD液體培養(yǎng)基Polypepton, 6. Og ；bacto-Yeast Extract, 3. Og ；葡萄糖,6. Og ；ddH20 補(bǔ)至 300ml， 115°C,滅菌 15min。1. 310 XDropout (-His, -Trp, -Leu, -Ura)氨基酸溶液為不含His，Trp，Leu，Ura 等成份的 IOXDropout 溶液。每IOOOml溶液中含有下列成份，用ddH20配制后保存于4°C。l)L-Isoleucine L-異亮氨酸300mg2) L-Valine L-纈氨酸1500mg3) Adenine 腺嘌呤200mg4) L-Arginine HCl L-精氨酸200mg5) L-Lysine HCl L-賴氨酸鹽酸鹽300mg6) L-Methionine L-甲硫氨酸200mg7) L-Phenylalanine 苯丙氛酸500mg8) L-Threonine L-蘇氨酸2000mg9) L-Tyrosine L-酪氨酸300mg1.4 20 X氨基酸儲(chǔ)存液 每IOOml溶液中分別含有下列成份，配制后保存于4°C。
20×HiS L—Histidine L一組氨酸40mg
20×／rp L-／ryptophan L一色氨酸40mg
20×Leu L—Leuc ine L一白氨酸200mg
20×Ura Uracil尿嘧啶40mg
1．5酵母轉(zhuǎn)化緩沖液
緩沖液體積緩沖液配制
10×／E100ml／riS 1．2ig；ED／ANa2。2H20 0．37g；ddH20 80ml；鹽酸調(diào)pH7．5；ddH20
定容
10×LiAc100ml LiAc．2H20 10．20g；ddH20 50ml，冰醋酸調(diào)pH7．5；ddH20定容
50％PEG100ml PEG335050．Og；ddH20定容
1．6其它緩沖液
緩沖液體積緩沖液配制
TE 1000ml；TriS 1．2ig；ED／ANa2。2H20 0．37g；ddH20 800ml；調(diào)pH；ddH20定容。
S／E 1000mlNaCl 5．84g；TriS 1．2ig；ED／ANa2。2H20 0．37gddH20 800ml鹽酸調(diào)pH8．0；ddH20定容
2、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的基本流程
2．1將報(bào)告基因p80p—LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD／一Ura篩選。
2．2同時(shí)構(gòu)建或擴(kuò)增DNA文庫(kù)，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。
2．3構(gòu)建DNA—BDfl靶蛋白質(zhì)粒pLexA—HPl，作為釣餌(bait)。
2．4將上述釣餌質(zhì)粒pLexA—HP l轉(zhuǎn)化EGY48(p80p—LacZ)細(xì)胞株，用SD／一Hi s／一Ura篩選；
并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD／Gal／Raf／一His／一Ura檢測(cè)此DNA—BD／靶蛋白是否具有直接激活報(bào)告基因的活性，以及對(duì)酵母細(xì)胞是否具有殺傷毒性。
轉(zhuǎn)化質(zhì)粒選擇培養(yǎng)基克隆生長(zhǎng)情況說(shuō)明
pLexA—Po sSD／一Hi S，一Ura藍(lán)陽(yáng)性對(duì)照
pLexASD／一Hi S，一Ura白陰性對(duì)照
PLexA—HP 1SD／一Hi S，一Ura白沒有直接激活活性
PLexA—HP 1SD／一Hi S，一Ura藍(lán)具有直接激活活性
PLexA—HPlSD／一HiS，一Ura菌落不能生長(zhǎng)酵母細(xì)胞毒性
1)如果pLexA—HPl能夠自動(dòng)激活報(bào)告基因，則設(shè)法去除其激活活性部位、或者將LacZ報(bào)告基因整合入基因組，減少半乳糖苷酶的信號(hào)作用。
2)如果pLexA—HPl雖然不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，但對(duì)酵母宿主細(xì)胞有毒性，則需要與純化的文庫(kù)DNA同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母。
2．5如果pLexA—HPl既不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，也不具有毒性，則可以與實(shí)施例l純化的文庫(kù)DNA同時(shí)、或順序轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。
轉(zhuǎn)化質(zhì)粒SD固體培養(yǎng)基LacZ表型
對(duì)照l(shuí)pLexA—Pos Gal／Raf／一Hi s／一Ura藍(lán)
對(duì)照2pLexA一53Gal／Raf／一Hi s／一Trp／一Ura／一Leu+pB42AD—T藍(lán)
實(shí)驗(yàn)pLexA-HPlGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/_Leu+pB42AD-文庫(kù)待測(cè)1)用SD/-HiS/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽(yáng)性共轉(zhuǎn)化子，并擴(kuò)增，使宿主細(xì)胞中的質(zhì) 粒在誘導(dǎo)前達(dá)到最大拷貝數(shù)。2)上述重組轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-HiS/-Trp/-Ura/-Leu， 觀察LacZ及Leu報(bào)告基因的表達(dá)情形，藍(lán)色克隆即為陽(yáng)性。白色克隆為假陽(yáng)性，說(shuō)明Leu 雖有表達(dá)，但半乳糖苷酶無(wú)表達(dá)。3)同時(shí)用LacZ、LeU兩個(gè)報(bào)告基因的目的，是為了盡可能消除實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性誤差， 譬如AD融合蛋白不與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而直接與啟動(dòng)子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2個(gè) 報(bào)告基因的啟動(dòng)子不同，出現(xiàn)上述假陽(yáng)性的幾率就大大減少了。4)將藍(lán)色陽(yáng)性克隆進(jìn)行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫(kù)質(zhì)粒。2. 6陽(yáng)性克隆的篩選1)隨機(jī)選取50個(gè)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化E. coli KC8宿主菌，抽提 大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫(kù)質(zhì)粒。2)如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個(gè)陽(yáng)性克隆來(lái)分析。最后得到數(shù)種片段大 小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，檢測(cè)是否仍為陽(yáng)性克隆。2. 7用質(zhì)粒自然分選法(Natural Segregation)篩除只含有AD-文庫(kù)雜合子的克 隆1)將初步得到的陽(yáng)性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1_2天，含有HIS3 編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10% -20%左右的頻率隨機(jī)丟失。2)30°C孵育2-3，將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/_Trp/-Ura。3)再挑取生長(zhǎng)的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩 選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫(kù)雜合子的重組子。4)將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗(yàn)證 AD-文庫(kù)能否直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，棄去陽(yáng)性克隆，保留陰性克隆。2. 8酵母雜合試驗(yàn)(Yeast Mating)確定真陽(yáng)性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其對(duì)應(yīng)的YM4271宿主細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的質(zhì)?；?文庫(kù)DNA，通過(guò)雜合實(shí)驗(yàn)確篩選pLexA-HPl與pB42AD_文庫(kù)確實(shí)具有相互作用的真陽(yáng)性克隆。質(zhì)粒1(in YM4271)質(zhì)粒 2(in EGY48) LacZ 表型 Leu 表型pLexA pB42AD 白不能生長(zhǎng)pLexA-HP lpB42AD 白不能生長(zhǎng)pLexA pB42AD_文庫(kù)白不能生長(zhǎng)pLexA-HP lpB42AD_ 文庫(kù)藍(lán)真陽(yáng)性pLexA-Lam pB42AD_ 文庫(kù)白不能生長(zhǎng)2. 9陽(yáng)性克隆的進(jìn)一步篩選和確證1)擴(kuò)增初步確定的陽(yáng)性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因 組DNA，也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。電轉(zhuǎn)化E. coli KC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復(fù)制起始 調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容；同時(shí)利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含 有AD-文庫(kù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長(zhǎng)，將其擴(kuò)增、并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定。3)用pLexA-HPl與pB42AD_庫(kù)DNA——對(duì)應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報(bào)告基因的酵母菌 EGY48中，先到SD/-HiS/-Trp/-Ura板擴(kuò)增，并與后面的誘導(dǎo)板形成對(duì)照，說(shuō)明報(bào)告基因的 表達(dá)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的表達(dá)有關(guān)，再確證LacZ、LeU報(bào)告基因的表達(dá)。4)擴(kuò)增與靶DNA相互作用的文庫(kù)DNA，進(jìn)行序列分析及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、功能研究。通過(guò)本實(shí)施例獲得一個(gè)與HPl基因相互作用的新基因，命名為HP5 (high-pigment 5)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。實(shí)施例3 基因HP5的克隆1、試劑限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、PrimeStar熱啟動(dòng)高保真DNA聚合 酶、pMDIS-T克隆載體、大腸桿菌(E. coli)JM109菌株等購(gòu)自大連寶生物工程公司；Trizol 試劑購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司；質(zhì)粒提取及DNA回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PCR引 物由上海英俊生物公司合成；其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。2、大腸桿菌菌株和植物材料大腸桿菌克隆菌株為E. coli JM109，購(gòu)自Clontech公司。番茄野生型種子為AC+， 可通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買。3、培養(yǎng)基和溶液LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH調(diào)pH至7. 0，高壓 滅菌。SOB 培養(yǎng)基胰蛋白胨 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 0. 58g/L，KCl 0. 19g/L， IOOXMg2+IOmLo 用 NaOH 調(diào) pH 至 7. 0，高壓滅菌。SOC 培養(yǎng)基S0B+20mM 葡萄糖。TB buffer (臨用前配置)=IMKCl 4mL, 0. 45MMnCl22. 4mL, 0. 50M CaCl2O. 6mL,0. 50M K-MES 0. 5mL, ddH20 12. 5mL(總體積 20mL)。IOOXMg2+溶液:20. 33g MgCl2. 6H20 ；24. 65g MgSO4. 7H20定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。20%葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于IOOmL H2O,過(guò)濾除菌。IM KCl 溶液7. 45g KCl 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。0. 45M MnCl2 溶液8. 9g MnCl2. 4H20 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。0. 50M CaCl2 溶液7. 35g CaCl2. 2H20 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。0. 50M K-MES 溶液9. 76g MES 定容于 IOOmL H2O,用 KOH 調(diào) pH 至 6. 3，過(guò)濾除菌， 分裝成0. 5mL每管，-20°C儲(chǔ)存。DMSO 分裝 200 μ 1 新鮮 DMSO，_20°C 儲(chǔ)存。4、實(shí)驗(yàn)方法4. 1質(zhì)粒微量提取1)將帶有克隆載體pMDIS-T質(zhì)粒(購(gòu)自大連寶生物工程公司)的E. coli JM109 接種于裝有5ml LB培養(yǎng)液(含適量抗生素)的試管中，37°C搖床培養(yǎng)12 16hr，以擴(kuò)增質(zhì)粒。2)取1. 5 5ml的菌液，于室溫下10，OOOxg離心lmin。倒凈培養(yǎng)基，往沉淀中加 入250 μ 1的solution I/RnaseA (購(gòu)自O(shè)MEGA公司)混和液，漩渦振蕩使細(xì)胞完全重新懸浮。3)往重懸混和液中加入250 μ 1 solution II (購(gòu)自O(shè)MEGA公司)，輕輕翻轉(zhuǎn)試管 4 6次混和溶液，以獲得一澄清的裂解液。4)往上述混和液中加入350ul solution III (購(gòu)自O(shè)MEGA公司)，并溫和地上下 顛倒離心管數(shù)次，直至形成白色絮狀沉淀。于室溫下10，OOOxg離心lOmin。5)取一干凈的質(zhì)粒微量分離柱置于2ml收集試管上(已備)。小心將上清轉(zhuǎn)至 質(zhì)粒微量分離柱內(nèi)，確保轉(zhuǎn)至柱內(nèi)的上清中沒有細(xì)胞雜質(zhì)沉淀。于室溫下10，OOOxg離心 lmin，使裂解液完全流過(guò)柱子。6)棄去離心甩出液，加入500 μ 1的solution HB緩沖液(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)到柱 子上，室溫下10，OOOxg離心Imin洗滌柱子，確保除去殘余的蛋白質(zhì)以得到后面操作所需的
高質(zhì)量DNA。7)棄去收集液，加入700 μ 1用無(wú)水乙醇稀釋的wash buffer緩沖液洗滌柱子，室 溫10，OOOxg離心lmin,棄去洗滌液。8)可選做步驟重復(fù)步驟7，用700 μ 1 wash buffer緩沖液再洗滌柱子一次。9)室溫下10，OOOxg離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)。10)把柱子置于一干凈的1. 5ml離心管上，直接加入30 50 μ 1滅菌去離子水或 TE緩沖液液到柱子基質(zhì)上(所加的量取決于預(yù)期終產(chǎn)物濃度)，10，OOOxg離心Imin以洗脫 出 DNA0存)。
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4. 2DNA回收方案
見實(shí)施例1的3. 6膠回收方案。
4. 3番茄葉片RNA的提取
見實(shí)施例1的1.番茄果實(shí)Total RNA的提取。
4. 4RT-PCR
1)RT
冰上在一個(gè)200 μ 1 EP管中加入以下組分 5XRT Buffer4 μ 1
dNTP Mixture(各 IOmM)2 μ 1
RNase Inhibitor (IOU/μ 1)1 μ 1
01igo(dT)20(10pmol/y 1)1 μ 1
Total RNA3 μ 1
RNase-Free H2O8 μ 1
ReverTra Ace1 μ 1
按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄42°C 20min(反應(yīng))；99°C 5min(酶變性)；4°C 5min(保
2)PCR
1))番茄基因HP5的克隆
冰上在一個(gè)的200 μ 1 EP管中加入以下組分5XPrimeStar BufferdNTP Mixture (各 2. 5mM)
10 μ 1 4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 32. 5μ 1 0. 5μ 1RT 產(chǎn)物HP5-F1HP5-R1ddH20 PrimeStar按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:98°C 3min (預(yù)變性)；98°C IOs (變性)，58°C 15s (復(fù)性)， 72 °C 2min (延伸)，所述變性_復(fù)性_延伸30個(gè)循環(huán)；72 °C 5min (終延伸)。以上述PCR產(chǎn)物為模板，以巢式引物HP5-F2和HP5-R2進(jìn)行第二輪高保真PCR，延 伸時(shí)間2min，其它條件同上。引物序列如下HP5-F1 :5，-GCAGCCATATAAAACATGAGACT-3，HP5-R1 :5，-CTATTTACTTCGAACATCAGGCC-3，HP5-F2 :5， -GGATCCATGGAGACTTCATTGGTTAATC-3，HP5-R2 :5， -GAGCTCCTATTTACTTCGAACATCAGGC-3，通過(guò)上述操作，獲得了番茄HP5基因的全長(zhǎng)片段(1551bp)。4. 5目的DNA片段與克隆載體pMD18_T的連接目的DNA片段與克隆載體pMDIS-T按摩爾分子數(shù)比3/1連接，反應(yīng)體系如下IOXligase Buffer1 μ 1pMD18-T(50y g/μ 1)1 μ 1目的 DNA 片段( 150 μ g/μ 1)Ιμ T4Ligase (350U/ μ 1)1 μ 1ddH206 μ 116°C，連接 12 小時(shí)。4. 6大腸桿菌轉(zhuǎn)化1)感受態(tài)細(xì)胞的制備a)接種大腸桿菌單菌落于2mL SOB培養(yǎng)液中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)；b)轉(zhuǎn)接0. 5mL過(guò)夜培養(yǎng)物至50mL SOB培養(yǎng)液中，18 °C劇烈震蕩18 24h至 A600 ^ 0. 55 ；c)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰浴IOmin, 4°C 4，OOOrpm離心IOmin ；d)去上清，加16mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞(注意輕輕旋轉(zhuǎn)，不要用振蕩器或 吹吸混勻)，冰浴 IOmin, 4°C 4，OOOrpm 離心 IOmin ；e)去上清，加4mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞，加入280 μ 1的DMS0，輕緩混勻，冰 浴 IOmin ；f)分裝于預(yù)冷得1. 5mLEP管中，液氮凍存。2)轉(zhuǎn)化a)從液氮中取出感受態(tài)細(xì)胞冰浴解凍；
b)將10 μ 1連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，冰浴30min ；c) 42°C熱沖擊 90s，立即冰浴 l_2min ；
d)加 0. 8mL 的 S0C,混勻，37°C溫和搖床 Ih0e)室溫13，OOOrpm離心lmin，倒掉一部分上清液，留約200 μ 1的上清液，用槍頭 將上清液與細(xì)胞混勻，涂布LB+amp (50 μ g/ml)平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。4. 7細(xì)胞快速裂解法鑒定重組質(zhì)粒1)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于500 μ 1含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至 A600 為 0.6 0.8。2)取200 μ 1菌液至0. 5ml EP管中，13，OOOrpm離心lmin，去上清，留約20 μ 1上清。3)力口 20 μ 1 2 X 快速裂解液
，劇烈振蕩。4) 13，OOOrpm 離心 15min。5)取5 μ 1上清直接電泳。與對(duì)照比，電泳帶滯后的即可能是重組質(zhì)粒。4. 8菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)快速裂解法鑒定的重組質(zhì)粒再做菌落PCR以確定插入片段是目標(biāo)片段，反應(yīng) 體系如下 ο X PCR Buffer2 μ 1Mg2+(1. 5mM)1. 2μ 1
dNTP Mixture(各 2. 5mM)0. 6μ 1
菌液1 μ 1
M13F0. 4μ 1
M13R0. 4μ 1
ddH2012. 4μ 1
TaqDNA聚合酶1 μ 1
反應(yīng)條件:94°C 5min (預(yù)變性)；94°C 40s (變性)，56°C 30s (復(fù)性)，72°C 2min (延
伸)，所述變性_復(fù)性_延伸30個(gè)循環(huán)；72°C 5min (終延伸)。對(duì)菌落PCR確定的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和拼接，所得序列為 序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。實(shí)施例4 真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能驗(yàn)證1、材料1. 1實(shí)驗(yàn)材料番茄野生型種子為AC+，可通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買。1. 1. 1主要試劑1)菌株大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a，購(gòu)自天為時(shí)代公司。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 由本實(shí)驗(yàn)室保存。2)質(zhì)粒pMD18-T 載體衍生自 pUC18，2. 692Kb，Ampr,為克隆 PCR 產(chǎn)物(ΤΑ Cloning)的專 用載體，插入位點(diǎn)為EcoRV的酶切位點(diǎn)，購(gòu)自TaKaRa。
質(zhì)粒pSKint (以下簡(jiǎn)寫pSK) =Amp抗性，具有兩處多克隆位點(diǎn)。植物真核表達(dá)載體pBI121 含有選擇標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因及 β-葡萄糖苷酸酶(⑶S)基因，由本實(shí)驗(yàn)室保存。3)植物激素吲哚乙酸(IndoleaceticAcid, IAA)；激動(dòng)素(Kinetin，Kt) ；6_ 芐氨基嘌呤 (6-Benzylaminopurine, 6-BA)；乙酰丁香酮(Acetosyringone, ACE) ；2，4-二氯苯氧基乙酸 (2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4~D)。4)抗生素羧卞青霉素(Carbenicillin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin，Km)5)植物DNA提取緩沖液IOOmmol/L Tris 'HCl(ρΗ8· 0)，50mmol/L EDTA(pH8. 0)，500mmol/L NaCl，IOmmol/ La-巰基乙醇，10%或20% SDS。6)培養(yǎng)基與溶液酵母提取物lg/L，胰蛋白胨 5g/L，蔗糖 5g/L，MgSO4. 7H20 0. 5g/L。用 NaOH 調(diào) pH 至7.0，高壓滅菌。番茄轉(zhuǎn)化過(guò)程中所用培養(yǎng)基如下(表1)表1番茄組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.一種真核重組質(zhì)粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中的基因 片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是起始密碼子下游1135bp至1549bp的核苷酸序 列，所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因 片段之間存在有150bp的內(nèi)含子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真核重組質(zhì)粒，其特征在于所述真核表達(dá)載體為pHB、 PM0N1772、pBE12、pBC7、pBI121 中的一種。
4.一種真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于步驟如下(1)在序列表中SEQID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基因片 段是起始密碼子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入到質(zhì)粒pSK 載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的PSK中間載體， 正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子；(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段的部 分，然后連接到真核表達(dá)載體上，即獲真核重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的真核重組質(zhì)粒的制備方法，，其特征在于所述真核表達(dá)載體 為 pHB、pM0N1772、pBE12、pBC7、pBI121 中的一種。
6.權(quán)利要求2或3所述真核重組質(zhì)粒在提高番茄果實(shí)色素積累中的應(yīng)用。
全文摘要
一種基因，它具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。一種真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是起始密碼子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子。制備方法(1)將上述基因片段正向插入到pSK載體上，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK載體；(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK載體上含有所述基因片段的部段連接到真核表達(dá)載體上。實(shí)驗(yàn)表明，所述真核重組質(zhì)?？稍谔岣叻压麑?shí)色素積累中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/79GK102121016SQ20101059855
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者劉永勝, 劉繼愷, 唐曉鳳, 張治國(guó), 李穎楠, 苗敏, 高永峰 申請(qǐng)人:四川大學(xué)