專利名稱：一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因fmo及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，涉及一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種利用功能互補(bǔ)法從來自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸為底物合成靛藍(lán)的惡臭假單胞菌克隆、編碼黃素單加氧酶(FMO)基因，并將該基因重組到大腸桿菌體內(nèi)，得到的一種具有黃素單加氧酶活性的重組菌，將其命名為黃素單加氧酶基因FM0。在有色氨酸存在的條件下，用該黃素單加氧酶基因FMO可合成靛藍(lán)。
背景技術(shù)：
靛藍(lán)是最早發(fā)現(xiàn)的天然染料之一，廣泛應(yīng)用于印染、醫(yī)藥和食品等工業(yè)。大部分靛藍(lán)是由化學(xué)法生產(chǎn)，天然靛藍(lán)比例非常小。從自然作物中提取遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需求，研究者將眼光轉(zhuǎn)向能夠生產(chǎn)色素的微生物。微生物生長快、培養(yǎng)容易，易于工業(yè)化，利用微生物生產(chǎn)天然色素的技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。微生物合成靛藍(lán)最早的報道是在1982年，研究者從土壤中分離到一株氧化吲哚假單胞菌O^seudomonans indoloxidaes)通過氧化吲哚合成靛藍(lán)任吉元，王文濤等，染料工業(yè)，1997。到20世紀(jì)80年代中期，研究者開始對生物合成靛藍(lán)的原理進(jìn)行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌合成靛藍(lán)的周期太長，1個周期至少要1個月，而細(xì)菌的周期相對較短，1個周期一般為18-24h，產(chǎn)量較高，于是研究者重點(diǎn)對細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)研究。20世紀(jì)80年代中期，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌合成靛藍(lán)的兩條路徑。即微生物合成靛藍(lán)的雙加氧酶途徑和羥化酶途徑。1983年美國Texas大學(xué)微生物系和應(yīng)用微生物學(xué)中心的 Ensley等利用遺傳工程技術(shù)，選育出能夠產(chǎn)生靛藍(lán)的菌株。這種菌株的選育，主要是把2種酶編碼的基因組建在一個菌株中，首先由色氨酸酶將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚，然后由萘雙加氧酶將吲哚氧化成吲羥Ensley B. D. Science. 1983,222(4620) :167_169。1985 年瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的Mermod等報道了另一種合成靛藍(lán)的途徑。即一種假單胞菌(I^seudomonae putida mt-2)中含有可以降解甲苯、二甲苯或甲苯的其他衍生物的酶的基因。這種基因在TOL質(zhì)粒上，利用二甲苯氧化酶的釋放、產(chǎn)生、脫羥和單加氧化作用。以吲哚作為靛藍(lán)的前體，在二甲苯氧化酶的作用下，直接在C3位置發(fā)生羥化生成吲羥，單加氧酶使雙鍵發(fā)生環(huán)化再經(jīng)空氣氧化，自動二聚形成靛藍(lán)Mermod N. Bio Technology. 1986,4(4) 321-324]0長期以來研究者沿著這兩條路徑來尋找新的突破。并最終確定了苯乙烯單加氧酶、苯酚羥化酶、黃素單加氧酶等。在20世紀(jì)末，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450酶在生物合成靛藍(lán)中的也具有重要作用李紅梅等，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展。2005，32(7) :1-6。對生物合成靛藍(lán)的酶的研究目前仍主要集中在雙加氧酶和單加氧酶上，細(xì)胞色素酶的研究也是最近才開始，而其反應(yīng)系統(tǒng)要比雙加氧酶和單加氧酶復(fù)雜很多，并且由于反應(yīng)機(jī)理的限制，要想取得重大突破還是需要付出更多努力來尋找創(chuàng)新點(diǎn)。開發(fā)新菌種仍然是未來的努力方向辛嘉英等，現(xiàn)代化工，2008，28 (7) :31-35。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO及其制備方法和應(yīng)用，所述基因來源于受萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤中篩選獲得的能在色氨酸存在時合成靛藍(lán)的惡臭假單胞菌。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下方式來實(shí)現(xiàn)的。所述的來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FM0，編碼成一個新型的黃素單加氧酶，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。所述的黃素單加氧酶基因FMO的獲取方法如下利用含0. 001%色氨酸的LB培養(yǎng)基，從被萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤微生物中，選擇菌落顏色為靛藍(lán)色的菌株；再將選擇出來的菌落置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時以上；之后提取總DNA，用0. 02-0. 5u/ μ L濃度限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A酶切提取所得的總DNA，時間20-60分鐘，并將酶切片段連接到表達(dá)載體PG251 (CN1338515NCBI)中，將連接物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株DH5 α 中，提取質(zhì)粒PFM0，再次轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，涂布于含有0. 001 %色氨酸的LB平板上，挑選顏色為靛藍(lán)色的菌落。從該靛藍(lán)色菌種克隆抽提的質(zhì)粒PFMO再次轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，結(jié)果證明這個克隆所產(chǎn)生的菌落均為靛藍(lán)色，對質(zhì)粒pFMO進(jìn)行測序，即得本發(fā)明的黃素單加氧酶基因FMO。所述的來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO的具體獲取方法，包括以下步驟1、菌種分離稱取被芳香族化合物污染的土壤樣品lg，加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，3000轉(zhuǎn)/分輕離心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ 1溶液涂布于含有0. 001%色氨酸的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh。將顏色為靛藍(lán)色的單菌落接種于加入1. 6ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，
培養(yǎng)48h，然后吸取150 μ 1的培養(yǎng)液再次涂布與含有色氨酸的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48h，觀察并挑取菌落顏色為靛藍(lán)色生長良好的菌株。2、總 DNA 提取將分離獲得的細(xì)菌單株在液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl,10g/L 胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)中培養(yǎng)過夜(16小時)，菌體培養(yǎng)液以6，000g重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。先將這些沉淀在_20°C下冷凍lh，之后使用TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,lmMEDTA, pH 8.0)清洗一次，然后懸浮于濃度為10mg/mL溶菌酶的無菌水中， 37 °C搖床培養(yǎng)Ih。接著向培養(yǎng)液中加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和濃度為5M的NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入濃度為20mg/mL蛋白激酶K，37°C培養(yǎng)lh。用與培養(yǎng)菌液液體體積相當(dāng)(1 倍體積)的苯酚氯仿異戊醇05 24 1，體積比)提取DNA;水相用與相當(dāng)水相體積1/2的氯仿異戊醇04 1，體積比)萃取，振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(dāng)(1倍體積)的異戊醇，振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精沖洗 DNA,干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮，所得總DNA于4°C保存。3、惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FMO的獲取與篩選用0. 02-0. 5ιι/μ L濃度限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A酶切提取所得的總DNA成團(tuán)泛菌，時間20-60分鐘，然后0.7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳，切下長度為5-71Λ的DNA片段，用膠試劑盒(上海生工生物工程有限公司)回收。選擇pG251(CN1338515NCBI)作為表達(dá)載體，用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI酶切并進(jìn)行膠回收。先對酶切的載體質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化操作，以降低質(zhì)粒自連，并對堿性磷酸酶進(jìn)行失活操作(Sambrook，分子克隆手冊，1989)，再與外源的DNA片段(即長度為5-71Λ的惡臭假單胞菌DNA片段)連接。反應(yīng)溫度16°C，連接時間10-1池。連接產(chǎn)物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇離心洗滌，最后用10 μ 1的超純水溶解，將連接物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，電擊參數(shù)為電脈沖2. 5 μ F， 電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5S。復(fù)蘇后，將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有 50 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，37°C培養(yǎng)12_16h，而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega 公司)進(jìn)行質(zhì)粒PFMO提取，這樣就構(gòu)建成了包含有目的基因的基因組文庫。將大量提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α涂布與含有色氨酸的LB平板上培養(yǎng)48h， 挑選顏色為靛藍(lán)色的菌落。從靛藍(lán)色菌落克隆抽提的質(zhì)粒PFMO再次轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α 將轉(zhuǎn)化子用無菌牙簽劃于含0. 001 %色氨酸的LB培養(yǎng)基上，結(jié)果證明這個克隆產(chǎn)生的菌落均為靛藍(lán)色，表明靛藍(lán)合成功能確實(shí)是由于轉(zhuǎn)入PFMO引起的。從上述靛藍(lán)色菌落中提取質(zhì)粒pFMO進(jìn)行測序，找出載體中插入惡臭假單胞菌的 DNA片斷進(jìn)行序列分析，尋找閱讀編碼框，其中包含了一個1382bp的閱讀框，即為本發(fā)明的黃素單加氧酶FM0，其序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。 在該閱讀框的左右兩側(cè)設(shè)計引物PFMOZ :5，-GGATCCATGACTCTTCGTGTAGCTATC-3，禾口PFMOF 5，-GAGCTCCTACCGGCGCAGGGCCTTCAC-3，為擴(kuò)增引物，以 pFMO 質(zhì)粒 DNA 為模版，對1382bp的閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將回收片段用BamHI和McI雙酶解，與pG251表達(dá)載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α涂布與含有0. 001%色氨酸的LB平板上培養(yǎng) 48h，確定1382bp閱讀框表達(dá)質(zhì)粒的正確性。利用PCR進(jìn)行全長擴(kuò)增，在Taq DNA聚合酶存在的反應(yīng)體系中，使用多個擴(kuò)增弓丨物和2個外側(cè)引物完成。擴(kuò)增條件依次為94°C預(yù)熱Imin ；94°C 30秒，50°C 30秒，72°C延長 lOmin，共25個循環(huán)。PCR結(jié)束后，0.8% (w/v)瓊脂糖膠回收。將上述SEQ ID No 1序列與表達(dá)載體相連接后轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞中，能在含有色氨酸的LB培養(yǎng)基上合成靛藍(lán)。有益效果本發(fā)明采用來自被萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤中的惡臭假單胞菌(即一類能夠在芳香族化合物中生長的細(xì)菌)，克隆此類細(xì)菌中的黃素單加氧酶基因，通過培養(yǎng)、 提取總DNA和PCR擴(kuò)增后，即得到如SEQ ID Nol所示的黃素單加氧酶基因FM0，它可以應(yīng)用于靛藍(lán)燃料的生物合成，和降解芳香族污染物。本發(fā)明所述的術(shù)語與其一般概念相同。所述的“核苷酸”和“引物”序列均為5’端至3’端。所述的“生物細(xì)胞”指微生物、植物細(xì)胞或組織。所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要為細(xì)菌；真核微生物為真菌或藻類，真菌主要指酵母菌。


圖1為FMO表達(dá)質(zhì)粒與pG251空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其中A為DH5 α (攜帶惡臭假單胞菌FMO表達(dá)質(zhì)粒)，B為陰性對照，即DH5 α (攜帶pG251空質(zhì)粒)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學(xué)出版社，1994)。該書及其后續(xù)出版版本是本領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行與分子生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作時最常用的具有指導(dǎo)性的參考書籍。實(shí)施例1菌種分離稱取被芳香族化合物污染的土壤樣品lg，加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，3000轉(zhuǎn)/分輕離心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ 1溶液涂布于含有色氨酸的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh。將顏色為靛藍(lán)色的單菌落接種與加入1. 6ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，28°C培養(yǎng) 48h，然后吸取150 μ 1的培養(yǎng)液再次涂布與含有色氨酸的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，觀察并挑取菌落顏色為靛藍(lán)色生長良好的菌株。實(shí)施例2總DNA的提取及菌種鑒定將實(shí)施例1分離獲得的顏色為靛藍(lán)色生長良好的細(xì)菌單株在IOml液體LB培養(yǎng)基 (5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)中培養(yǎng)16小時，菌體培養(yǎng)液以6，OOOg重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。先將這些沉淀在_20°C下冷凍lh，之后使用TE緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8. 0)清洗一次，然后加入20 μ 1溶菌酶 (Sigma-Aldrich)濃度為10mg/mL的無菌水懸浮，在37°C下?lián)u床培養(yǎng)lh。 接著加入50 μ L濃度為0. 5Μ EDTA, 50 μ 1濃度為10 % (w/v) SDS和50 μ 1濃度為 5Μ的NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入10 μ 1濃度為20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)， 反應(yīng)物在37°C下培養(yǎng)lh。用與培養(yǎng)菌液體積相當(dāng)(1倍體積)的苯酚氯仿異戊醇 (25 24 1，體積比)提取DNA。水相用與相當(dāng)水相體積1/2 (0. 5倍體積)的氯仿異戊醇04 1，體積比)萃取。振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(dāng)(1倍體積)的異戊醇。振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精沖洗DNA，干燥，之后在 TE緩沖液中重懸浮，所得的總DNA于4°C保存。 以抽提的總DNA為模板，利用細(xì)菌的16s rRNA特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的引物為 P16SF :5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，和 P16SF :5’ -AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3，。以 KOD Plus (Toyobo日本)為iTaq DNA聚合酶，擴(kuò)增條件依次為94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 120 秒，擴(kuò)增30個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，加入2個單位的rtaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)，72°C延伸 300 秒，擴(kuò)增片段長 1500bp (GeneID 1045690NCBI)。PCR 結(jié)束后，(w/v)瓊脂糖凝膠回收，取10 μ 1直接與T/A載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4°C連接過夜。先將上述利用16s rRNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的片段與T/A載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，再用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛細(xì)管自動化測序儀測序，測得的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，得到菌株與惡臭假單胞菌中的16s rRNA有99%的同源性，說明該菌株為惡臭假單胞菌株。實(shí)施例3利用色氨酸合成靛藍(lán)的DNA片斷分離和序列分析用不同濃度(0. 02-0. 5u/ μ L)限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A(寶生物工程(大連)有限公司)酶切實(shí)施例2提取所得的惡臭假單胞菌總DNA，時間20-60分鐘，然后0. 7% (w/ ν)瓊脂糖凝膠電泳，切下長度為5-71Λ的DNA片段，用膠試劑盒(上海生工生物工程有限公司)回收。選擇pG251 (CN1338515NCBI)作為表達(dá)載體，用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI (寶生物工程(大連)有限公司)酶切并進(jìn)行膠回收。先對酶切的載體質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化操作，以降低質(zhì)粒自連，并對堿性磷酸酶進(jìn)行失活操作(Sambrook，分子克隆手冊，1989)，再與外源的DNA片段(即長度為5-71Λ的成團(tuán)泛菌DNA片段)連接。連接前，將回收的部分酶解的細(xì)菌基因組DNA片段與pG251載體DNA， 用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計濃度，確保連接反應(yīng)中外源DNA的濃度至少是載體濃度3-5 倍。反應(yīng)溫度16°C，連接時間為10-12h。連接產(chǎn)物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇離心洗滌，最后用10 μ 1的超純水溶解，將連接物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，電擊參數(shù)為電脈沖2. 5 μ F， 電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5S。復(fù)蘇后，將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有 50yg/mL氨芐青霉素)平板上，37°C培養(yǎng)12_1他，而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega 公司)進(jìn)行質(zhì)粒PFMO提取，這樣就構(gòu)建成了包含有目的基因的基因組文庫。將大量提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α涂布于含有0. 001%的色氨酸的LB平板上培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)有多個菌落生長良好。將這些菌落接種到含0.001%色氨酸的LB平板上， 挑選較好的菌落，抽提該克隆的質(zhì)粒PFMO再次轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，將轉(zhuǎn)化子用無菌牙簽點(diǎn)于含0. 001%色氨酸的LB固體培養(yǎng)基上，結(jié)果證明這個克隆所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子可合成靛藍(lán)，表名靛藍(lán)合成功能確實(shí)是由于轉(zhuǎn)入PFMO引起的。利用逐步序列測定方法對上述篩選獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序。測序的引物分別為Par 1 :5’ -GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3，Par2 :5’ -CTGACAGCGTTATTGATGACA-3’Par3 :5’ -GATCACCGCATGGCGATGTGT-3，Par4 :5’ -AACG CCAGTCCACCAGCACG-3’分析結(jié)果表明，插入的片斷大小為3170bp，從測序結(jié)果中尋找閱讀編碼框，其中包含了一個1382bp的閱讀框。在閱讀框的左右兩側(cè)設(shè)計引物PFMOZ :5，-GGATCCATGACTCTTCGTGTAGCTATC-3，禾口PFMOF :5，-GAGC TCCTACCGGCGCAGGGCCTTCAC-3，為擴(kuò)增引物，以 pFMO 質(zhì)粒 DNA 為模版，對1382bp的閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，擴(kuò)增條
9件依次為94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 2分鐘，30個循環(huán)。然后加入2單位rtaq(寶生物工程(大連)有限公司)，在72°C延伸30分鐘。PCR結(jié)束后，(w/v)瓊脂糖凝膠回收，獲得長度為1382bp的SEQ ID Nol核苷酸，即為本發(fā)明的黃素單加氧酶FM0，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。將回收片段用BamHI和McI雙酶解，與pG251表達(dá)載體連接，用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計濃度，確保連接反應(yīng)中外源DNA的濃度至少是載體濃度3-5倍。反應(yīng)溫度16°C， 連接時間為10-1 1。再將該載體轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)中。利用ABI Prism Big Dye的 ABI3700毛細(xì)管自動化測序儀測序，確定1382bp閱讀框(惡臭假單胞菌FM0)表達(dá)質(zhì)粒的正確性。將大腸桿菌DH5 a (攜帶惡臭假單胞菌FMO表達(dá)質(zhì)粒)和DH5 a (攜帶pG251空質(zhì)粒)接種到含色氨酸的LB固體培養(yǎng)基中，經(jīng)^°C、4 !培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對照B在LB 中呈現(xiàn)正常菌落的淡黃色；而DH5 a (攜帶惡臭假單胞菌FMO表達(dá)質(zhì)粒)A在LB中菌落呈現(xiàn)明顯的靛藍(lán)色(參看圖1)。實(shí)施例4惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FMO的篩選與合成通過基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆篩選合成本發(fā)明的惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FM0，所用的引物如下1FM01 ATGACTCTTC2FM0-2 GATTTGCGGC3FM0-3 GCCGCCATGC4FM0-4 CACCGGCTCG5FM0-5 CAGCATGGCG6FM0-6 GAAATGTTCA7FM0-7 AGCTTCGATG8FM0-8 ATCGCGCACC9FM0-9 AAAGCCGGGG10FM0-10 GCCGTAGTCA11FM0-11 AGCGCCCATG12FM0-12
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GTGTAGCTAT CATCGGTGCC GGCCCCTCCG GCCTTGCGCA ACTGCGTGCC ATGGCGGCGC CCTGGGCATG GGCGGACTGG AAGGCACGCA GTTGCGCAAG CGCAAATCGT CTGCTTCGAA AAGCAGGCCG ACTGGGGCGG CATGTGGAAC CCATGCTGGT CGAGTCCGGT GCGCCAGGTG TAGTTCCACA TGCCGCCCCA AGCCGGTGCA CGGCAGCATG TACCGCTACT TGTGGTCCAA CGGCCCCAAG TCGAAGCTG TAGTCGGCGA ACTCCAGGCA CTCCTTGGGGC CGTTGGACCA AACATTTCG GCCGGCCAAT CTCCTCATAT CCGCCGCGCGA GGTGCTGTGG CCGGCTTTT TTCACGCGGC CCTGGATGTA GTCCCACAGCA CCTCGCGCGG TGCGCGATT TCATCCGCTT CAATACCGTG GTCAAGCACGT CAGCTTCAAT TGGGCGCTG ACGGTGAACT CGCGTGTCTG CTCATTGAAGC TGACGTGCTT ACTACGGCG CAGGGGTCGG CATCGAGCAG GTGTTCGACTA CGTGGTGGTC0085]TTCGAACTCCGGCACATGCGGGGTGGAGA AGTGGCCACT GGCGACCACCACGTAGTCGAA0086]13FM0-13 0087]CATGTGCCGGAGTTCGAAGGCTTCGAGCG TTTCACCGGG CGTATCCTGCACGCCCACGAT0088]14FM0-14 0089]GATGAGCAGGTCCTGGCCCTTGAATTCCA CCGCTTCACG AAAATCGTGGGCGTGCAGGAT0090]15FM0-15 0091]GGCCAGGACCTGCTCATCGTTGGCAGCA GTTATTCCGCC GAAGACATAGGTTCGCAGTGC0092]16FM0-16 0093]GGTACGTTAGGCCGTGGTGATCGACCGTGCACCGTACTT GTAGCACTGCGAACCTATGTC0094]17FM0-17 0095]ACCACGGCCTAACGTACCCAGGCCGATGGGGCTTCAAGTGGCCCACGGGGTGGGAAGAGC0096]18FM0-18 0097]CGAAGAACGCCAGGTCGTTCTCGACCCTGACCAGTTGCGGACGCTCTTCCCACCCCGTGG0098]19FM0-19 0099]ACGACCTGGCGTTCTTCGCCGATGGATCGAGCAAGCGCATCGACGCAATCATCCTGTGCA0100]20FM0-20 0101]TCAGCTCATCCGGCAGGAACGGGAAGTGATGCTGGTAGCCCGTGCACAGGATGATTGCGT0102]21FM0-21 0103]TCCTGCCGGATGAGCTGACCCTCAAGACCAACAACCGCCTGTGGCCTGCGGGGCTCTACC0104]22FM0-22 0105]CCAGGTAGAGCAACTGCGGGTTCTGCTCCCAGACCACGCCTTGGTAGAGCCCCGCAGGCC0106]23FM0-23 0107]CGCAGTTGCTCTACCTGGGCATGCAGGACCTCTGGTACAGCTTCAACCTGTTCGACGCCC0108]24FM0-24 0109]GCTGCAGGCGCCCCAGCATATAGTCGCGTGCAAACCATGCCTGGGCGTCGAACAGGTTGA0110]25FM0-25 0111]TGCTGGGGCGCCTGCAGCTACCGCCCAAGGCGGACATGCAAGCCGACAGCAAGCGCTGGC0112]26FM0-26 0113]CATACATCGAGGCTGTGGTTTCCAGACGCTCCTCATCCTCGCGCCAGCGCTTGCTGTCGG0114]27FM0-27 0115]CCACAGCCTCGATGTATGAGTTCCAGGGTCGATACATCAAGCACCTGATCGAGCAGACCG0116]28FM0-28 0117]GGAAGATGCGATTGACCGCATCGATGTCGAAGCTTGGGTAATCGGTCTGCTCGATCAGGT0118]29FM0-29 0119]CGGTCAATCGCATCTTCCTGCAATGGAAGCAGGACAAGAAGCACGACATCATGGGCTATC0120]30FM0-30 0121]CTGCTTTCGTGCCGGTGATCACCGAGCGGTACGACTTGTCGCGATAGCCCATGATGTCGT0122]31FM0-31 0123]TCACCGGCACGAAAGCAGTGCCCCACCATACCCGCTGGATGCAGGCGCTGGACGACTCGC
32FM0-32 CCTCACCTTG CTTGCCGTCC GTTTCGCGCA GGTATTCCTG CAGCGAGTCG TCCAGCGCCT33FM0-33 ACGGCAAGCA AGGTGAGGTG AAGGCCCTGC GCCGGTAG34FM0-34 CTACCGGCGC AGGGCCTTCA利用PCR進(jìn)行β -胡蘿卜素全長操縱子擴(kuò)增，在100μ 1反應(yīng)體系中， FM0-2-FM0-33共32個引物的添加量為2ng，外側(cè)引物FM0-1和FM0-34添加量為30ng。以 KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)為Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增條件依次為94°C預(yù)熱Imin ； 940C 30s ；50°C 30s ；72°C lOmin，使用的，共25個循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物即為FMO基因。PCR結(jié)束后，1 % (w/v)瓊脂糖膠回收，取10 μ 1直接與Τ/Α克隆載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4°C連接過夜。高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽性克隆，將該陽性克隆經(jīng)ABI Prism Big Dye的ΑΒΙ3700毛細(xì)管自動化測序儀測序，獲得長度為1382bp的SEQ ID Nol核苷酸，即為本發(fā)明的黃素單加氧酶FM0，其編碼的氨基酸序列如 SEQIDNo2 所示。
權(quán)利要求
1.一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO的制備方法，其特征在干， 利用功能互補(bǔ)法對來自被芳香族化合物污染的土壌中能以色氨酸為底物合成靛藍(lán)的惡臭 假單胞菌克隆、編碼黃素單加氧酶(FMO)基因，并將該基因重組到大腸桿菌體內(nèi)而獲得，具 體包括以下步驟1)菌種分離；2)總DNA的提取及菌種鑒定；3)惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FMO的篩選與合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在干，所述的芳香族化合物為萘或苯酚。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在干，通過基因合成方法克隆篩選與合成 所述的黃素單加氧酶基因FM0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在干，所述基因合成方法所用的引物如下 IFMO 1 ATGACTCTTC GTGTAGCTAT CATCGGTGCC GGCCCCTCCG GCCTTGCGCA ACTGCGTGCC 2FM0-2 GATTTGCGGC ATGGCGGCGC CCTGGGCATG GGCGGACTGG AAGGCACGCA GTTGCGCAAG 3FM0-3 GCCGCCATGC CGCAAATCGT CTGCTTCGAA AAGCAGGCCG ACTGGGGCGG CATGTGGAAC 4FM0-4 CACCGGCTCG CCATGCTGGT CGAGTCCGGT GCGCCAGGTG TAGTTCCACA TGCCGCCCCA 5FM0-5 CAGCATGGCG AGCCGGTGCA CGGCAGCATG TACCGCTACT TGTGGTCCAA CGGCCCCAAG 6FM0-6 GAAATGTTCA TCGAAGCTG TAGTCGGCGA ACTCCAGGCA CTCCTTGGGGC CGTTGGACCA 7FM0-7 AGCTTCGATG AACATTTCG GCCGGCCAAT CTCCTCATAT CCGCCGCGCGA GGTGCTGTGG 8FM0-8 ATCGCGCACC CCGGCTTTT TTCACGCGGC CCTGGATGTA GTCCCACAGCA CCTCGCGCGG 9FM0-9 AAAGCCGGGG TGCGCGATT TCATCCGCTT CAATACCGTG GTCAAGCACGT CAGCTTCAAT 10FM0-10 GCCGTAGTCA TGGGCGCTG ACGGTGAACT CGCGTGTCTG CTCATTGAAGC TGACGTGCTT 11FM0-11 AGCGCCCATG ACTACGGCG CAGGGGTCGG CATCGAGCAG GTGTTCGACTA CGTGGTGGTC 12FM0-12 TTCGAACTCC GGCACATGCG GGGTGGAGA AGTGGCCACT GGCGACCACCA CGTAGTCGAA 13FM0-13 CATGTGCCGG AGTTCGAAGG CTTCGAGCG TTTCACCGGG CGTATCCTGCA CGCCCACGAT14FM0-14 GATGAGCAGG 15FM0-15 GGCCAGGACC 16FM0-16 GGTACGTTAG 17FM0-17 ACCACGGCCT 18FM0-18 CGAAGAACGC 19FM0-19 ACGACCTGGC 20FM0-20 TCAGCTCATC 21FM0-21 TCCTGCCGGA 22FM0-22 CCAGGTAGAG 23FM0-23 CGCAGTTGCT 24FM0-24 GCTGCAGGCG 25FM0-25 TGCTGGGGCG 26FM0-26 CATACATCGA 27FM0-27 CCACAGCCTC 28FM0-28 GGAAGATGCG 29FM0-29 CGGTCAATCG 30FM0-30 CTGCTTTCGT 31FM0-31 TCACCGGCAC 32FM0-32 CCTCACCTTG 33FM0-33 TCCTGGCCCT TGAATTCCA CCGCTTCACG AAAATCGTGGG CGTGCAGGAT TGCTCATCGT TGGCAGCA GTTATTCCGCC GAAGACATAGG TTCGCAGTGC GCCGTGGTGA TCGACCGTGC ACCGTACTT GTAGCACTGCG AACCTATGTC AACGTACCCA GGCCGATGGG GCTTCAAGTG GCCCACGGGG TGGGAAGAGC CAGGTCGTTC TCGACCCTGA CCAGTTGCGG ACGCTCTTCC CACCCCGTGG GTTCTTCGCC GATGGATCGA GCAAGCGCAT CGACGCAATC ATCCTGTGCA CGGCAGGAAC GGGAAGTGAT GCTGGTAGCC CGTGCACAGG ATGATTGCGT TGAGCTGACC CTCAAGACCA ACAACCGCCT GTGGCCTGCG GGGCTCTACC CAACTGCGGG TTCTGCTCCC AGACCACGCC TTGGTAGAGC CCCGCAGGCC CTACCTGGGC ATGCAGGACC TCTGGTACAG CTTCAACCTG TTCGACGCCC CCCCAGCATA TAGTCGCGTG CAAACCATGC CTGGGCGTCG AACAGGTTGA CCTGCAGCTA CCGCCCAAGG CGGACATGCA AGCCGACAGC AAGCGCTGGC GGCTGTGGTT TCCAGACGCT CCTCATCCTC GCGCCAGCGC TTGCTGTCGG GATGTATGAG TTCCAGGGTC GATACATCAA GCACCTGATC GAGCAGACCG ATTGACCGCA TCGATGTCGA AGCTTGGGTA ATCGGTCTGC TCGATCAGGT CATCTTCCTG CAATGGAAGC AGGACAAGAA GCACGACATC ATGGGCTATC GCCGGTGATC ACCGAGCGGT ACGACTTGTC GCGATAGCCC ATGATGTCGT GAAAGCAGTG CCCCACCATA CCCGCTGGAT GCAGGCGCTG GACGACTCGC CTTGCCGTCC GTTTCGCGCA GGTATTCCTG CAGCGAGTCG TCCAGCGCCTACGGCAAGCA AGGTGAGGTG AAGGCCCTGC GCCGGTAG 34FM0-34 CTACCGGCGC AGGGCCTTCA 。
6.權(quán)利要求1所述的來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO在靛藍(lán)合成中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO及其制備方法和應(yīng)用。具體涉及一種利用功能互補(bǔ)法從來自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸為底物合成靛藍(lán)的惡臭假單胞菌克隆、編碼黃素單加氧酶(FMO)基因，并將該基因重組到大腸桿菌體內(nèi)，得到的一種具有黃素單加氧酶活性的重組菌，將其命名為黃素單加氧酶基因FMO，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。在有色氨酸存在的條件下，用該黃素單加氧酶基因FMO可合成靛藍(lán)。
文檔編號C12N15/53GK102559709SQ20101060054
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者付曉燕, 周惠, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院