專利名稱：一種輔酶q10工業(yè)化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域，特別指對(duì)輔酶QlO培養(yǎng)基、關(guān)鍵促進(jìn)因子配方優(yōu)化及發(fā)酵工藝改進(jìn)的輔酶QlO工業(yè)化生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
輔酶QlO又稱泛醌，為脂溶性醌類化合物，是細(xì)胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑和細(xì)胞代謝激活劑，廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物體內(nèi)，是生物細(xì)胞呼吸鏈中的重要遞氫體。同時(shí)由于其醌環(huán)的天然氧化還原特性，輔酶QlO具有保護(hù)和恢復(fù)生物膜結(jié)構(gòu)的完整性、穩(wěn)定膜電位和增強(qiáng)免疫反應(yīng)等作用。作為一種良好的生化藥物，輔酶QlO近年來已被廣泛應(yīng)用于各類心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病治療，并可預(yù)防動(dòng)脈硬化、中風(fēng)和高血壓，對(duì)心臟、肝臟和腎也有良好的保健作用。此外，輔酶QlO還具有抗衰老作用，在化妝品和保健品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前，國內(nèi)外輔酶QlO的生產(chǎn)以微生物發(fā)酵法為主。動(dòng)植物組織提取法來源有限， 原料價(jià)格高，且化學(xué)成份復(fù)雜，輔酶QlO含量低，規(guī)模化生產(chǎn)受制約；化學(xué)合成法合成條件苛刻、工藝復(fù)雜，產(chǎn)物為順反異構(gòu)體混合物，生物活性低，不適合現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)；利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶QlO具有原料來源豐富、成本低、反應(yīng)條件溫和產(chǎn)物生物活性高等優(yōu)點(diǎn)， 是最具發(fā)展?jié)摿Φ纳a(chǎn)方法。近年來，國內(nèi)對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶QlO的研究主要集中在高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵小試實(shí)驗(yàn)水平，如天辰神舟實(shí)業(yè)有限公司在“一株產(chǎn)輔酶QlO的類球紅細(xì)菌突變株及培養(yǎng)方法”的專利申請(qǐng)中利用空間搭載誘變手段獲得突變株，發(fā)酵單位達(dá)到800mg/L ；喬志新等采用基因組改組技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)誘變育種方法快速融合多種正向突變獲得高產(chǎn)菌株，單位菌體的輔酶QlO產(chǎn)量為8. 31mg/g。當(dāng)前對(duì)輔酶QlO工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)工藝研究甚少，發(fā)酵水平普遍較低，周期長(zhǎng)，成本高。除利用各種誘變技術(shù)獲得高產(chǎn)菌株外，對(duì)培養(yǎng)基、關(guān)鍵促進(jìn)因子配方優(yōu)化及發(fā)酵工藝改進(jìn)也是實(shí)現(xiàn)高效、低廉工業(yè)化生產(chǎn)輔酶QlO的有效途徑。目前尚未見到將該關(guān)鍵促進(jìn)因子組合及添加方法、溶氧反饋-補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于輔酶 QlO工業(yè)化生產(chǎn)的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種輔酶QlO工業(yè)化生產(chǎn)方法，本生產(chǎn)方法針對(duì)輔酶QlO在工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)方面存在的不足，設(shè)計(jì)出新的發(fā)酵工藝路線，其特點(diǎn)為根據(jù)微生物細(xì)胞自身的生理需要、輔酶QlO的合成途徑和代謝調(diào)控機(jī)制，添加關(guān)鍵促進(jìn)因子，通過對(duì)種子、發(fā)酵培養(yǎng)基及合成輔酶QlO的關(guān)鍵促進(jìn)因子配方優(yōu)化，有效地提高了菌濃及單位發(fā)酵液的輔酶QlO含量；并對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，確定出溶氧反饋-補(bǔ)料分批培養(yǎng)為最佳補(bǔ)糖模式，通過溶氧反饋補(bǔ)糖、中間變速流加營(yíng)養(yǎng)源料及連續(xù)流加磷水、氨水等策略對(duì)輔酶QlO進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，有效地提高細(xì)胞密度，控制代謝流，并延長(zhǎng)產(chǎn)物合成期，實(shí)現(xiàn)輔酶QlO 產(chǎn)量的大幅度提高，生產(chǎn)成本則大大降低。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題由如下方案來實(shí)現(xiàn)突變株Rhodobacter sphaeroides Nr-F 17經(jīng)斜面?zhèn)鞔澳钙颗囵B(yǎng)后按2 5%0 接種量接入已滅菌的一級(jí)種子罐中培養(yǎng)，控制攪拌轉(zhuǎn)速250 500rpm、空氣流量20 80m3/ h、罐溫28 32°C、罐壓0. 02 0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間30 60h ；將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液按5 15%接種量移入已滅菌的二級(jí)種子罐中培養(yǎng)，控制攪拌轉(zhuǎn)速100 200rpm、空氣流量100 300m7h、罐溫28 32°C、罐壓0. 02 0. 05Mpa, 培養(yǎng)時(shí)間10 20h，一級(jí)、二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖3 10g，酵母粉1 5g，硫酸銨2 6g，味精0. 5 2g，玉米漿粉0. 3 2g，硫酸鎂1 4g，磷酸二氫鉀0. 3 2g，氯化鈉1 4g，硫酸亞鐵0. 2 lg，硫酸錳0. 03 0. Ig,硫酸鋅0. 001 0. Olg,輕質(zhì)碳酸鈣 5 10g,7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下滅菌25min ；母瓶及一級(jí)、二級(jí)種子罐接種前均按配料體積的2 5%移入已滅菌的關(guān)鍵促進(jìn)因子至培養(yǎng)基中；在無菌條件下，將培養(yǎng)好的二級(jí)種子液按10 20%接種量移入發(fā)酵罐，發(fā)酵基礎(chǔ)料配方為葡萄糖10 20g，硫酸銨3 10g，味精2 8g，玉米漿粉4 9g，硫酸鎂5 IOg,磷酸二氫鉀0. 1 0. 5g，氯化鈉1 5g，硫酸亞鐵1 3g，硫酸錳0. 1 0. 4g，氯化鈷 0. 005 0. Olg, 7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下滅菌 25min ；控制攪拌轉(zhuǎn)速80 130rpm、空氣流量1000 2500m7h、罐溫30 !35°C、罐壓 0. 03 0. 06Mpa,當(dāng)溶氧值急劇上升時(shí)開始流加葡萄糖，保持培養(yǎng)過程中5%的溶解氧，在發(fā)酵對(duì)數(shù)期，通過提高攪拌速度、空氣流量及葡萄糖的流加速率，使菌體終濃度達(dá)90g/L以上，總培養(yǎng)時(shí)間為70 100h，發(fā)酵至30 60h，采用逐步增加流速的方法補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)源料，補(bǔ)料體積為發(fā)酵液體積的3 8%，發(fā)酵過程流加磷酸二氫鉀溶液，發(fā)酵前期和中后期分別控制溶磷水平在0. 14 0. 18g/L和0. 08 0. 12g/L，補(bǔ)入氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值在6. 5 7. 0 之間，氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，當(dāng)菌體染色變淺，部分菌絲自溶，效價(jià)增長(zhǎng)緩慢時(shí)， 終止發(fā)酵；上述關(guān)鍵促進(jìn)因子的優(yōu)選組合為茄尼醇0. 3 0. Sg, β -胡蘿卜素0. 2 lg， L-酪氨酸0.2 lg，L-苯丙氨酸0.2 0. 9g，麥角固醇0. 15 0. 3g，硫胺素15 25g，核黃素15 25g，泛酸鈣1 5g，煙酸10 20g，水1000ml，121°C下滅菌20min ；營(yíng)養(yǎng)源料配方為3倍濃縮的發(fā)酵基礎(chǔ)料，并含3 7% (ν/ν)的關(guān)鍵促進(jìn)因子， 121°C 下滅菌 25min。下面詳述生產(chǎn)方法1.種子制備①菌種類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides) Nr-F 17突變株(實(shí)驗(yàn)室編號(hào))。②菌種傳代采用斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基，于30°C避光培養(yǎng)4天，至長(zhǎng)出草綠色圓形菌落，直徑約1. 4 2. 0mm。③母瓶培養(yǎng)培養(yǎng)基配方葡萄糖10g，酵母膏6g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，硫酸銨0.75g，硫酸鎂Ig,磷酸二氫鉀0. 3g，硫酸亞鐵0. 2g，硫酸錳0. 05g,硝酸鉀0. 03g,硫酸鋅0. 007g,水 1000ml，pH7. 2，滅菌溫度和時(shí)間121°C、25min ；每瓶接入10 20個(gè)單菌落，在溫度為30°C， 攪拌轉(zhuǎn)速300rpm條件下，搖床培養(yǎng)25h。2.突變株的發(fā)酵配方優(yōu)化
本發(fā)明采用響應(yīng)面分析法，對(duì)輔酶QlO發(fā)酵中不同來源的碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等進(jìn)行優(yōu)化，確定出培養(yǎng)基的最佳組成和含量。通過適當(dāng)添加不同前體物和促進(jìn)劑等輔酶QlO生物合成關(guān)鍵促進(jìn)因子，有效地促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，控制代謝產(chǎn)物流向，實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的最大化積累。種子培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為葡萄糖3 10g，酵母粉1 5g，硫酸銨2 6g，味精 0. 5 2g，玉米漿粉0. 3 2g，硫酸鎂1 4g，磷酸二氫鉀0. 3 2g，氯化鈉1 4g，硫酸亞鐵0. 2 lg，硫酸錳0. 03 0. lg，硫酸鋅0. 001 0. Olg，輕質(zhì)碳酸鈣5 IOg,/K 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C 下滅菌 25min。發(fā)酵基礎(chǔ)料的優(yōu)選配方為葡萄糖10 20g，硫酸銨3 10g，味精2 8g，玉米漿粉4 9g，硫酸鎂5 10g，磷酸二氫鉀0. 1 0. 5g，氯化鈉1 5g，硫酸亞鐵1 3g，硫酸錳 0. 1 0. 4g，氯化鈷 0. 005 0. Olg, 7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下滅菌 25min。關(guān)鍵促進(jìn)因子優(yōu)選組合為茄尼醇0.3 0.8g，β-胡蘿卜素0.2 lg，L-酪氨酸 0. 2 lg，L-苯丙氨酸0. 2 0. 9g，麥角固醇0. 15 0. 3g，硫胺素15 25g，核黃素15 25g，泛酸鈣1 5g，煙酸10 20g，水1000ml，121°C下滅菌20min。營(yíng)養(yǎng)源料配方3倍濃縮的發(fā)酵基礎(chǔ)料，并含3 7% (ν/ν)的關(guān)鍵促進(jìn)因子， 121°C 下滅菌 25min。關(guān)鍵促進(jìn)因子的添加方法1)接種前按配料體積的2 5%加入培養(yǎng)基中，包括母瓶、一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐和發(fā)酵罐；2)在發(fā)酵中后期以變速流加營(yíng)養(yǎng)源料的方式補(bǔ)入。添加關(guān)鍵促進(jìn)因子對(duì)輔酶QlO發(fā)酵生產(chǎn)影響顯著(見圖2)，主要體現(xiàn)①硫胺素、核黃素、泛酸鈣和煙酸等維生素類添加物可有效加快糖酵解速度并激活戊糖磷酸途徑，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，細(xì)胞干重(DCW)明顯增加，獲得高細(xì)胞密度；未添加時(shí)，菌體拉長(zhǎng)變形嚴(yán)重，老化快，中后期效價(jià)增長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)物分泌期明顯縮短。②L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、麥角固醇、β-胡蘿卜素和茄尼醇等有效阻斷或減弱代謝分支，解除反饋抑制，增大輔酶QlO代謝通量，隨著中后期營(yíng)養(yǎng)源料的補(bǔ)入，輔酶QlO效價(jià)增長(zhǎng)迅速，發(fā)酵水平較未添加時(shí)有顯著提高。3.擴(kuò)培工藝及參數(shù)采用三級(jí)發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn)，種子罐的基本培養(yǎng)條件為一級(jí)種子罐攪拌轉(zhuǎn)速250 500rpm，空氣流量20 80m7h，罐溫觀 32°C，罐壓0. 02 0. 05MPa,接種量為2 5%。，培養(yǎng)時(shí)間30 60h ；二級(jí)種子罐攪拌轉(zhuǎn)速100 200rpm，空氣流量100 300m7h，罐溫28 32°C， 罐壓0. 02 0. 05MPa，接種量為5 15%，培養(yǎng)時(shí)間為10 20h。4.發(fā)酵補(bǔ)料-分批培養(yǎng)本發(fā)明在補(bǔ)料-分批培養(yǎng)模式下，通過對(duì)輔酶QlO高產(chǎn)菌的呼吸強(qiáng)度、糖代謝與產(chǎn)物合成關(guān)系研究及A含量與葡萄糖供應(yīng)的動(dòng)力學(xué)分析，確定出最佳的溶氧條件及補(bǔ)糖模式。采用溶氧反饋-補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)，通過溶氧反饋補(bǔ)糖及連續(xù)流加磷水、氨水等策略實(shí)現(xiàn)對(duì)輔酶Qio的反饋調(diào)節(jié)，在發(fā)酵中后期變速流加營(yíng)養(yǎng)源料，從而獲得高細(xì)胞密度，并有效延長(zhǎng)產(chǎn)物合成期，增加產(chǎn)物積累，使菌種獲得最大的生產(chǎn)率。
在無菌條件下，將培養(yǎng)好的二級(jí)種子液按10 20%接種量移入發(fā)酵罐，在攪拌轉(zhuǎn)速80 130rpm，空氣流量1000 2500m3/h，罐溫30 !35°C，罐壓0. 03 0. 06MPa的初始條件下進(jìn)行培養(yǎng)。以溶氧值急劇上升為標(biāo)志開始流加葡萄糖，保持培養(yǎng)過程中5%的溶解氧，在發(fā)酵對(duì)數(shù)期，通過提高攪拌速度、空氣流量及葡萄糖的流加速率，使菌體終濃度達(dá) 90g/L以上，總培養(yǎng)時(shí)間為70 100h。發(fā)酵至30 60h，采用逐步增加流速的方法補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)源料，補(bǔ)料體積為發(fā)酵液體積的3 8%。發(fā)酵過程流加磷酸二氫鉀溶液，分段控制溶磷水平0. 14 0. 18g/L (發(fā)酵前期)，0. 08 0. 12g/L (發(fā)酵中后期)；補(bǔ)入氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液 pH值在6. 5 7. 0之間，氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，當(dāng)菌體染色變淺，部分菌絲自溶， 效價(jià)增長(zhǎng)緩慢時(shí)，終止發(fā)酵。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本生產(chǎn)方法主要由對(duì)輔酶QlO培養(yǎng)基、關(guān)鍵促進(jìn)因子配方優(yōu)化及發(fā)酵工藝改進(jìn)兩部分組成。其中關(guān)鍵促進(jìn)因子優(yōu)選組合，是根據(jù)輔酶QlO生物合成途徑結(jié)合細(xì)菌的代謝調(diào)控機(jī)制優(yōu)選得到的，優(yōu)選組分的加入有效地促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，獲得高細(xì)胞密度，阻斷或減弱代謝分支，增大輔酶QlO代謝通量，達(dá)到增產(chǎn)的效果。采用溶氧反饋-補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)，使發(fā)酵前期細(xì)菌保持適當(dāng)?shù)谋壬L(zhǎng)率，獲得高細(xì)胞密度，中后期保持一定的溶氧值，避免過低的溶氧條件加速菌體老化，達(dá)到延長(zhǎng)產(chǎn)物累積時(shí)間的目的，同時(shí)葡萄糖濃度控制在低水平，有效抑制了代謝副產(chǎn)物的生成和積累。通過溶氧反饋補(bǔ)糖、變速流加營(yíng)養(yǎng)源料及連續(xù)流加磷水、氨水等策略對(duì)輔酶QlO進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，有效地控制了代謝流，延長(zhǎng)產(chǎn)物合成期，輔酶QlO產(chǎn)量達(dá)3400mg/L和34. 7mg/g DCff,較原發(fā)酵水平有大幅度提高。本生產(chǎn)方法工藝穩(wěn)定，發(fā)酵成本大大降低。


圖1為本發(fā)明的發(fā)酵工藝路線2添加關(guān)鍵促進(jìn)因子對(duì)輔酶QlO發(fā)酵影響
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例如圖1所示，由液氮保存的菌種經(jīng)活化并傳代穩(wěn)定后，30°C平板培養(yǎng)4天， 挑出長(zhǎng)勢(shì)良好的草綠色圓形單菌落至已滅菌好的母瓶培養(yǎng)基，每瓶接入20個(gè)單菌落，控制條件為30°C，300rpm，培養(yǎng)時(shí)間25h ；按2%。接種量接入已滅菌好的一級(jí)種子罐(配料體積 0. 7m3)，控制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，空氣流量45m7h，罐溫30°C，罐壓0. 04MPa,培養(yǎng)時(shí)間38h。當(dāng)種子液菌體形態(tài)均勻，菌量豐富，且無菌度合格后，按10 %接種量移入已滅菌好的二級(jí)種子罐(配料體積7m3)，在攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，空氣流量300m3/h，罐溫30°C，罐壓0. 04MPa條件下培養(yǎng)12h。關(guān)鍵促進(jìn)因子優(yōu)選組合為茄尼醇0.4g，β-胡蘿卜素0.3g，L-酪氨酸0.3g， L-苯丙氨酸0. 5g，麥角固醇0. 15g，硫胺素15g，核黃素15g，泛酸鈣lg，煙酸10g，水IOOOml， 121°C下滅菌20min，各級(jí)接種前均按配料體積的4%移入培養(yǎng)基中；一級(jí)、二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖5g，酵母粉3g，硫酸銨4g，味精lg，玉米漿粉0. Sg,硫酸鎂2g，磷酸二氫鉀 Ig,氯化鈉2. 4g，硫酸亞鐵0. 5g，硫酸錳0. Ig,硫酸鋅0. 005g,輕質(zhì)碳酸鈣5g，水IOOOml，pH 6. 5，121°C 下滅菌 25min。
當(dāng)二級(jí)種子液菌體形態(tài)均勻，菌量豐富，且無菌度合格后，按15%接種量移入 120m3發(fā)酵罐(配料體積50m3)。發(fā)酵基礎(chǔ)料配方為葡萄糖20g，硫酸銨5g，味精5g，玉米漿粉7g，硫酸鎂7g，磷酸二氫鉀0. 3g，氯化鈉3g，硫酸亞鐵2g，硫酸錳0. 4g，氯化鈷0. 008g, 水 1000ml, pH 6. 5，121°C 下滅菌 25min?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速80rpm，空氣流量1500m3/h，罐溫32°C，罐壓0. 04MPa,總培養(yǎng)時(shí)間為 88h。發(fā)酵過程中，當(dāng)溶氧值急劇上升時(shí)開始流加葡萄糖，保持培養(yǎng)過程中5%的溶解氧，在 32h(發(fā)酵對(duì)數(shù)后期)，將攪拌速度、空氣流量及葡萄糖的流加速率分別勻速提升至120rpm、 2000m3/h和400L/h，使菌體終濃度達(dá)90g/L以上；發(fā)酵至30 60h，變速流加營(yíng)養(yǎng)源料 4. 5m3，設(shè)初始流速為100L/h，每IOh增加50L/h，營(yíng)養(yǎng)源料配方為3倍濃縮的發(fā)酵基礎(chǔ)料， 并含6% (ν/ν)的關(guān)鍵促進(jìn)因子，121°C下滅菌25min;中間在線測(cè)量和控制攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、溶氧和PH值，離線檢測(cè)殘?zhí)菨舛?、溶磷、氨基氮濃度等并觀察菌體形態(tài)。發(fā)酵過程流加磷酸二氫鉀，培養(yǎng)前3 控制發(fā)酵液溶磷在0. 14 0. 18g/L，32h后在0. 08 0. 12g/L，補(bǔ)入氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值在6. 5 7. 0之間，氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，當(dāng)菌體染色變淺，部分菌絲自溶，效價(jià)增長(zhǎng)緩慢時(shí)放罐。
權(quán)利要求
1. 一種輔酶Qio工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟突變株Miodobacter sphaeroides Nr-F 17經(jīng)斜面?zhèn)鞔澳钙颗囵B(yǎng)后按2 5%。接種量接入已滅菌的一級(jí)種子罐中培養(yǎng)，控制攪拌轉(zhuǎn)速250 500rpm、空氣流量20 80m3/h、 罐溫28 32"C、罐壓0. 02 0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間30 60h ；將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液按5 15%接種量移入已滅菌的二級(jí)種子罐中培養(yǎng)，控制攪拌轉(zhuǎn)速100 200rpm、空氣流量100 300m7h、罐溫28 32°C、罐壓0. 02 0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間10 20h，一級(jí)、二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖3 10g，酵母粉1 5g，硫酸銨 2 6g，味精0. 5 2g，玉米漿粉0. 3 2g，硫酸鎂1 4g，磷酸二氫鉀0. 3 2g，氯化鈉 1 4g，硫酸亞鐵0. 2 lg，硫酸錳0. 03 0. lg，硫酸鋅0. 001 0. Olg，輕質(zhì)碳酸鈣5 10g,7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下滅菌25min ；母瓶及一級(jí)、二級(jí)種子罐接種前均按配料體積的2 5%移入已滅菌的關(guān)鍵促進(jìn)因子至培養(yǎng)基中；在無菌條件下，將培養(yǎng)好的二級(jí)種子液按10 20%接種量移入發(fā)酵罐，發(fā)酵基礎(chǔ)料配方為葡萄糖10 20g，硫酸銨3 10g，味精2 8g，玉米漿粉4 9g，硫酸鎂5 10g，磷酸二氫鉀0. 1 0. 5g，氯化鈉1 5g，硫酸亞鐵1 3g，硫酸錳0. 1 0. 4g，氯化鈷0. 005 0. Olg, 7jc 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下滅菌 25min ；控制攪拌轉(zhuǎn)速80 130rpm、空氣流量1000 2500m7h、罐溫30 !35°C、罐壓0. 03 0. 06Mpa,當(dāng)溶氧值急劇上升時(shí)開始流加葡萄糖，保持培養(yǎng)過程中5%的溶解氧，在發(fā)酵對(duì)數(shù)期，通過提高攪拌速度、空氣流量及葡萄糖的流加速率，使菌體終濃度達(dá)90g/L以上，總培養(yǎng)時(shí)間為70 100h，發(fā)酵至30 60h，采用逐步增加流速的方法補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)源料，補(bǔ)料體積為發(fā)酵液體積的3 8%，發(fā)酵過程流加磷酸二氫鉀溶液，發(fā)酵前期和中后期分別控制溶磷水平在0. 14 0. 18g/L和0. 08 0. 12g/L，補(bǔ)入氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值在6. 5 7. 0之間， 氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，當(dāng)菌體染色變淺，部分菌絲自溶，效價(jià)增長(zhǎng)緩慢時(shí)，終止發(fā)酵；上述關(guān)鍵促進(jìn)因子的優(yōu)選組合為茄尼醇0. 3 0. Sg, β -胡蘿卜素0. 2 lg，L-酪氨酸0.2 lg，L-苯丙氨酸0.2 0. 9g，麥角固醇0. 15 0. 3g，硫胺素15 25g，核黃素 15 25g，泛酸鈣1 5g，煙酸10 20g，水1000ml，121°C下滅菌20min ；上述營(yíng)養(yǎng)源料配方為3倍濃縮的發(fā)酵基礎(chǔ)料，并含3 7% (ν/ν)的關(guān)鍵促進(jìn)因子， 121°C 下滅菌 25min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔酶Q10工業(yè)化生產(chǎn)方法，主要特點(diǎn)是根據(jù)輔酶Q10生物合成途徑和代謝調(diào)控機(jī)制，選擇合適的前體物和促進(jìn)劑作為關(guān)鍵促進(jìn)因子誘導(dǎo)輔酶Q10的積累，通過對(duì)種子、發(fā)酵培養(yǎng)基及輔酶Q10生物合成關(guān)鍵促進(jìn)因子進(jìn)行優(yōu)化，有效地促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，增大輔酶Q10代謝通量；采用三級(jí)發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)及補(bǔ)料-分批培養(yǎng)。應(yīng)用溶氧反饋-補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)，通過溶氧反饋補(bǔ)糖、中間變速流加營(yíng)養(yǎng)源料及連續(xù)流加磷水、氨水等策略實(shí)現(xiàn)對(duì)輔酶Q10的反饋調(diào)節(jié)，有效提高細(xì)胞密度，控制代謝流，并延長(zhǎng)產(chǎn)物合成期，輔酶Q10發(fā)酵水平有了大幅度的提升，本生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，發(fā)酵成本大大降低。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102168115SQ20101060122
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者吳軼, 朱友跑, 詹光煌, 陳必欽 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古金達(dá)威藥業(yè)有限公司, 廈門金達(dá)威集團(tuán)股份有限公司