專利名稱：一種檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及動(dòng)物疫病的預(yù)防控制。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)主要引起母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙 等為臨床特征的疾病。1991年，荷蘭學(xué)者Terpstra等人在感染豬體內(nèi)分離到歐洲型PRRSV， 命名為L(zhǎng)elystad病毒(LV)；同年，美國(guó)學(xué)者Benfield等人分離到美洲型PRRSV，命名為 VR-2332。該病毒1996年傳入中國(guó)并長(zhǎng)期存在，成為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要豬病病毒之一。近年來，我國(guó)學(xué)者相繼分離鑒定了美洲型PRRSV的CH-la、Si、HB-I和HB_2等毒 株。2006年6月份以來，我國(guó)多個(gè)省份的養(yǎng)豬場(chǎng)、戶爆發(fā)豬“高熱病”疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成 了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，中請(qǐng)人在研究該病的過程中，發(fā)現(xiàn)了其主要病原——高致病性PRRSV變 異株，這一類的高致病性PRRSV變異株以Nsp2基因第1594 1680位核苷酸連續(xù)缺失為特 征，并分離鑒定了代表性病毒株——NVDC-JXAl株(分類命名繁殖與呼吸綜合征病毒；保 藏編號(hào)CGMCC No. 1964)。2006年，申請(qǐng)人針NVDC-JXAl病毒株建立了特異性的RT-PCR檢測(cè)方法，用于檢 測(cè)該病毒感染。但是2009年以來，通過在自然界中不斷演化，我國(guó)高致病性PRRSV變異株 已經(jīng)在基因組序列上發(fā)生了一些變化；同時(shí)，由于CHl-R疫苗等毒株逐漸推廣使用，對(duì)原有 RT-PCR檢測(cè)方法造成了非特異性的干擾。這些情況的出現(xiàn)，使得原有的RT-PCR檢測(cè)方法和 試劑盒已經(jīng)不能有效地鑒別檢測(cè)田間流行的高致病性PRRSV變異株。本發(fā)明基于對(duì)2006年至2010年分離的多個(gè)高致病性PRRSV變異株基因序列分 析，針對(duì)分離毒株Nsp2基因序列的共同特征，設(shè)計(jì)了一系列PCR引物，并經(jīng)過優(yōu)化和試驗(yàn) 篩選，獲得了一對(duì)PCR引物。采用該引物組裝的RT-PCR試劑盒，可以檢測(cè)出當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的全 部高致病性PRRSV變異株，并且不受經(jīng)典PRRSV (是指Nsp2基因未發(fā)生第1594 1680位 核苷酸連續(xù)缺失的毒株)和CHl-R疫苗毒株的干擾，從而能夠特異、敏感地檢測(cè)出高致病性 PRRSV變異株。因此，該試劑盒能對(duì)高致病性PRRSV診斷和監(jiān)測(cè)起到重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)涉及針對(duì)高致病性PRRSV變異株NSP2基因片斷設(shè)計(jì)的RT-PCR引物對(duì)，用 于檢測(cè)高致病性PRRSV變異株(本發(fā)明中特指Nsp2基因第1594 1680位核苷酸連續(xù)缺 失為特征的毒株)。該引物對(duì)包括上游引物SEQ ID NO :1和下游引物SEQ ID NO :2的核苷 酸序列為SEQ ID NO :1:5' -CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3‘SEQ ID NO :2:5' -TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3‘本申請(qǐng)還提供一種能夠特異、敏感地檢測(cè)出高致病性PRRSV變異株的RT-PCR試劑盒，包含如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物對(duì)。試劑盒的其他組分均按照常規(guī)方 法配制，具體為1. RNA提取試劑由醋酸鈉溶液350 μ 1，酚/氯仿/異戊醇混合液3. 5ml，異丙醇 3. 5ml，75%乙醇12ml，無菌DEPC水450 μ 1，RNA酶抑制劑24 μ 1組成。2. RT-PCR反應(yīng)試劑由RT反應(yīng)液200 μ 1 (含反轉(zhuǎn)錄引物序列RT引物 5，-TCgCCCTAAT-3，) ,RNA 酶抑制劑 24 μ 1.AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 12 μ 1、PCR 反應(yīng)液 200 μ 1,0. 5U/ μ LTaq DNA聚合酶25 μ 1、礦物油300 μ 1組成。3.電泳檢測(cè)試劑包括50ΧΤΑΕ電泳緩沖液20ml、溴化乙錠溶液100 μ 1、上樣緩 沖液50 μ 1。4.陰性對(duì)照350 μ 1、陽(yáng)性對(duì)照350 μ 1,變性液7ml。


圖 1:SEQIDN0:1圖 2:SEQIDN0:2圖3 RT-PCR檢測(cè)部分PRRSV病毒樣品的電泳結(jié)果。注1.高致病性PRRSV NVDC-JXAl株；2.高致病性PRRSV TJ-F92疫苗；3.高致病性PRRSV HuM-Fl 12疫苗；4.混 樣1 (勃林格MLV疫苗+高致病性PRRSV JXAl-R疫苗)；5.高致病性PRRSV 2009當(dāng)陽(yáng)分離 毒株；6.經(jīng)典PRRSV NM191病毒株；7.經(jīng)典PRRSV DX F5病毒株；8.經(jīng)典PRRSV VR2332病 毒株；9.經(jīng)典PRRSV HB2病毒株；10.經(jīng)典PRRSV CH-I R疫苗；11.經(jīng)典PRRSV勃林格MLV 疫苗；12. SPF豬血清LOl ；13.陰性對(duì)照；14.陽(yáng)性對(duì)照；15. DNA Marker0
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例1RT-PCR引物合成與篩選根據(jù)2006年至2010年分離鑒定的高致病性PRRSV的NSP2基因序列，設(shè)計(jì)一系列 上游引物BUl BU34，設(shè)計(jì)一系列下游引物BDl BD27。引物由相關(guān)公司按常規(guī)方法合成。 用這些引物兩兩組成引物對(duì)，分別進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，檢測(cè)各種有代表性的病毒樣品，包括A 高致病性PRRSV NVDC-JXA1株陽(yáng)性對(duì)照；B 高致病性PRRSV變異株陽(yáng)性組織； C 經(jīng)典PRRSV CH-IR疫苗；D 經(jīng)典PRRSV勃林格疫苗；E 陰性組織；F 陰性對(duì)照(純水)。通過多次測(cè)試，并比較檢測(cè)結(jié)果，最終確定了特異性最好，檢出率最高的引物對(duì) BU21&BD16，作為RT-PCR試劑盒的引物。具體核苷酸序列為SEQ ID NO :1:5' -CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3 ‘ (BU21 序列)SEQ ID NO :2:5' -TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3‘ (BD16 序列)表1上游引物備選序列
BUlCCTAACGGTTCGGAAGAAACTGTCBU3AGTGAGCCCGTACTTGTGCCCBU4AGTGAGCCCGTACTTGTGBU5ATGAGTGAGCCCGTACBU6GCGACGTGTCCCCAAGCTGBU7GACGTGTCCCCAAGCTGABU8GCGAGAACTCCCCAAGCTGBU9GCGAGAACTGCCCAAGCTGBUlOGACGTGGAACCAAGCTGABUllGACGGAACTGCAAGCTGABU12GAGTGAGCCCGTACTTGTGCBU13CTATGAGTGAGCCCGTACTTGBU14CCTATGAGTGAGCCCGTACBU15GCAGAACAAAGTCTGTCAMAGBU16TTGGAAGAGGTTGTCCTGGBU17GCACCCTGGTCCCTCCCBU18GTCAACTCATGCTGCACCCBU19GCCAGAGGACAAGCCTGTCBU20AMGCTTGCCAGAGGACAAGCCBU21CGCAGAACAMGTCTGTCMAAGBU22CMCCTCGCAGAACAAAGTCTGBU23GAGTTCAACCTCGCAGAACAAAGBU24GGGCGGCTGAGCAGGTCGBU25CCAGGCGACTTCAGAAATGATGBU26CTGCTAAAACTAGCCAACACCCBU27CTCATGTCCACTGGACTTGGC
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的RT-PCR引物對(duì)，其特征 在于其引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的RT-PCR 試劑盒，其特征在于包含如權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株RT-PCR引物對(duì)和RT-PCR試劑盒，可以特異、敏感地檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征流行病毒株。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102140526SQ20101060212
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者喬明明, 孫明, 曲萍, 王傳彬, 田克恭, 遇秀玲, 陳曦, 陳西釗 申請(qǐng)人:中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心