專利名稱：快速生長(zhǎng)的大口黑鱸微衛(wèi)星標(biāo)記篩選及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
大口黑鱸屬于我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一。本發(fā)明屬于魚類分子生物學(xué)DNA標(biāo) 記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及快速生長(zhǎng)的大口黑鱸微衛(wèi)星標(biāo)記篩選，及利用這些標(biāo)記輔助 大口黑鱸快速生長(zhǎng)品系的選育工作。
背景技術(shù)：
大口黑鱸(Microp terus salmoides L.)，俗名加外丨鱸，原產(chǎn)于北美洲，屬于鱸形 目、鱸亞目、太陽(yáng)魚科、黑鱸屬，具有生長(zhǎng)快、耐低溫、肉質(zhì)鮮美和易捕撈等特點(diǎn)，是重要的淡 水養(yǎng)殖魚類之一。從上世紀(jì)70年代開始推廣到世界各地，1983年從臺(tái)灣引種到廣東省， 現(xiàn)在全國(guó)大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖。2000年，廣東省大口黑鱸的養(yǎng)殖面積約為10萬(wàn)畝，產(chǎn)量 6.67萬(wàn)噸，全國(guó)大口黑鱸的年產(chǎn)量在10萬(wàn)噸左右。2004年，僅廣東大口黑鱸產(chǎn)量9.48 萬(wàn)噸，產(chǎn)值約12.86億元。但是目前我國(guó)引進(jìn)的大口黑鱸是由野生種家養(yǎng)馴化而成的，缺 少定向選育，加上引種20多年來不注重親本留種需遵守的操作規(guī)程，甚至有的苗種生產(chǎn) 單位為了生產(chǎn)上的方便，選擇個(gè)體小，性成熟早的個(gè)體作為親本，致使我國(guó)目前養(yǎng)殖大口黑 鱸種質(zhì)的質(zhì)量急劇下降，主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)速度下降、性成熟年齡普遍提前、餌料轉(zhuǎn)化效率 低、對(duì)環(huán)境不利影響和疾病的抵抗力也大幅下降，已嚴(yán)重制約我國(guó)大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。生長(zhǎng)速度是關(guān)系到養(yǎng)殖戶所養(yǎng)殖大口黑鱸產(chǎn)量的高低，效益的高低的關(guān)鍵。近年 來，由于大口黑鱸有小型化趨勢(shì)，市場(chǎng)價(jià)格也受到極大影響，大大影響了大口黑鱸養(yǎng)殖者的 信心，制約了大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。提高養(yǎng)殖魚類生長(zhǎng)速度的方法很多，如強(qiáng)化喂養(yǎng)，保 持良好水質(zhì)環(huán)境，控制合適的放養(yǎng)密度，挑選優(yōu)質(zhì)親魚進(jìn)行繁殖等。其中，挑選個(gè)體較大、身 體健壯的魚作繁殖用親本，其后代可能具有親本生長(zhǎng)快、抗病等優(yōu)良品質(zhì)，但這種方法對(duì)親 本的選擇目的性還不夠強(qiáng)，仍具有很多人為地因素和不確定的因素。大口黑鱸屬于肉食性 為主的魚類，掠食性強(qiáng)，餌料不足是會(huì)互相殘食，致使其生長(zhǎng)懸殊較大，僅從表型判斷大口 黑鱸親本質(zhì)量是否優(yōu)良還是不精確，但從DNA水平上進(jìn)行選擇，可以大大提高選擇的準(zhǔn)確 性，并可在早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的個(gè)體，篩選優(yōu)良親本，從而縮短育種周期，加快育種 進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)室通過研究，在人工養(yǎng)殖的大口黑鱸群體中對(duì)40個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò) 增，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析微衛(wèi)星位點(diǎn)在極端大個(gè)體組和極端小個(gè)體組中的基因型分布差異， 選擇差異顯著的16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)大口黑鱸隨機(jī)群體進(jìn)行基因型與性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié) 果表明關(guān)聯(lián)分析得到5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76和MiSaTPW117 )與體重、體長(zhǎng)和體高顯著或極顯著相關(guān)(P<0.05或P<0.01 )，同時(shí)對(duì)差異顯著的位點(diǎn)進(jìn) 行不同等位基因與生長(zhǎng)性狀的多重比較，找到了與體重、體長(zhǎng)和體高性狀相關(guān)的最有利等 位基因?yàn)镴ZL60的等位基因A、JZL67的等位基因B、JZL72等位基因A，MiSaTPW76的等 位基因B和MiSaTPW117的等位基因B。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)篩選到的5個(gè)具有優(yōu)勢(shì)等位基因的微衛(wèi)星標(biāo)記引物(JZL60、 JZL67、JZL72、MiSaTPW76和MiSaTPW117 )，建立快速、有效地鑒定具有優(yōu)良性狀的個(gè)體。利用本方法將生產(chǎn)中具有該5個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因的個(gè)體保留，以提高大口黑鱸的品種質(zhì)量。 該方法與傳統(tǒng)的方法相比，具有目的性強(qiáng)，作用效果直接的優(yōu)點(diǎn)。且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、檢 測(cè)成本低，便于廣泛推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明篩選到5個(gè)與大口黑鱸生長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)的等位基因，并建立一種快速、 準(zhǔn)確、有效地利用分子標(biāo)記檢測(cè)大口黑鱸優(yōu)良個(gè)體的方法，以早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的 個(gè)體，為篩選優(yōu)良親本提供參考。一、微衛(wèi)星標(biāo)記篩選
本申請(qǐng)人于2006年11月從廣州市順德南水大口黑鱸養(yǎng)殖基地選擇300對(duì)親魚，2007 年4月對(duì)選擇的親魚進(jìn)行人工繁殖，繁殖后代在同一養(yǎng)殖池中進(jìn)行養(yǎng)殖。同年12月份選擇 該養(yǎng)殖池中的大口黑鱸160尾，建立體重的正態(tài)分布圖，取15%的高值個(gè)體即體重為750g 以上的記為“極端大群體”，15%低值個(gè)體即體重為315g以下的記為“極端小群體”，從兩個(gè) 群體中各隨機(jī)選擇12尾用于與生長(zhǎng)相關(guān)微衛(wèi)星位點(diǎn)的初步篩選。然后從相同的養(yǎng)殖池中 隨機(jī)選擇121尾大口黑鱸用于生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析，此121尾大口黑鱸記為“隨機(jī)群體”。本申請(qǐng)人利用實(shí)驗(yàn)室擁有的具有多態(tài)性且分型效果好的40個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)極端 群體進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析40個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在極端大個(gè)體組和極端小個(gè) 體組中的基因型分布差異，選擇差異顯著的16個(gè)微衛(wèi)星對(duì)大口黑鱸隨機(jī)群體進(jìn)行基因型 與性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明關(guān)聯(lián)分析得到5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(JZL60、JZL67、JZL72、 MiSaTPff76和MiSaTPffl 17 )與體重、體長(zhǎng)和體高顯著或極顯著相關(guān)(Ρ<0· 05或P<0. 01 )，同時(shí)對(duì)差異顯著的位點(diǎn)進(jìn)行不同等位基因與生長(zhǎng)性狀的多重比較，找到了與體重、體長(zhǎng) 和體高性狀相關(guān)的最有利等位基因?yàn)镴ZL60的等位基因A、JZL67的等位基因B、JZL72 等位基因A，MiSaTPW76的等位基因B和MiSaTPW117的等位基因B。二、篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用
利用篩選到的5個(gè)具有優(yōu)勢(shì)等位基因的微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)待選擇個(gè)體或親本的大口黑 鱸DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行分析，將同時(shí)存在JZL60的 等位基因 A(227bp)、JZL67 的等位基因 BU62bp)、JZL72 等位基因 A(202bp)、MiSaTPff76 的等位基因B (257bp)和MiSaTPWl 17的等位基因B (214bp)的個(gè)體保留，去除不存在優(yōu) 勢(shì)等位基因的個(gè)體。利用本方法將生產(chǎn)中同時(shí)具有這5個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因的個(gè)體選作親本， 有目的的選擇優(yōu)良種質(zhì)，從而保證后代種質(zhì)優(yōu)良，可以大大提高大口黑鱸后代的生長(zhǎng)速度。 該方法與傳統(tǒng)的方法相比，具有目的性強(qiáng)，作用效果直接的優(yōu)點(diǎn)。且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、檢 測(cè)成本低，便于廣泛推廣使用。三、具體檢測(cè)方法 (一)微衛(wèi)星引物
權(quán)利要求
1.快速生長(zhǎng)的大口黑鱸微衛(wèi)星標(biāo)記篩選，其特征是選擇300對(duì)親魚，對(duì)選擇的親魚進(jìn)行人工繁殖，繁殖后代在同一養(yǎng)殖池中進(jìn)行養(yǎng)殖，選 擇大口黑鱸160尾，建立體重的正態(tài)分布圖，取15%的高值個(gè)體即體重為750g以上的記為 “極端大群體”，15%低值個(gè)體即體重為315g以下的記為“極端小群體”，從兩個(gè)群體中各隨 機(jī)選擇12尾用于與生長(zhǎng)相關(guān)微衛(wèi)星位點(diǎn)的初步篩選，然后從相同的養(yǎng)殖池中隨機(jī)選擇121 尾大口黑鱸用于生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析，此121尾大口黑鱸記為“隨機(jī)群體”；利用實(shí)驗(yàn)室擁有的具有多態(tài)性且分型效果好的40個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)極端群體進(jìn)行擴(kuò) 增，擴(kuò)增結(jié)果運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析40個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在極端大個(gè)體組和極端小個(gè)體組中的基 因型分布差異，選擇差異顯著的16個(gè)微衛(wèi)星對(duì)大口黑鱸隨機(jī)群體進(jìn)行基因型與性狀的關(guān) 聯(lián)分析，結(jié)果表明關(guān)聯(lián)分析得到5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76和 MiSaTPffl 17，與體重、體長(zhǎng)和體高顯著或極顯著相關(guān)，如P<0. 05或P<0. 01，同時(shí)對(duì)差異 顯著的位點(diǎn)進(jìn)行不同等位基因與生長(zhǎng)性狀的多重比較，找到了與體重、體長(zhǎng)和體高性狀相 關(guān)的最有利等位基因?yàn)镴ZL60的等位基因A、JZL67的等位基因B、JZL72等位基因A， MiSaTPff76的等位基因B和MiSaTPW117的等位基因B。
2.快速生長(zhǎng)的大口黑鱸微衛(wèi)星標(biāo)記篩選的應(yīng)用，其特征是利用篩選到的5個(gè)具有優(yōu)勢(shì)等位基因的微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)待選擇個(gè)體或親本的大口黑 鱸DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行分析，將同時(shí)存在JZL60的 等位基因 A(227bp)、JZL67 的等位基因 BU62bp)、JZL72 等位基因 A(202bp)、MiSaTPff76 的等位基因B (257bp)和MiSaTPW117的等位基因B (214bp)的個(gè)體保留，去除不存在優(yōu)勢(shì) 等位基因的個(gè)體，利用本方法將生產(chǎn)中同時(shí)具有這5個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因的個(gè)體選作親本，有 目的的選擇優(yōu)良種質(zhì)，從而保證后代種質(zhì)優(yōu)良，可以大大提高大口黑鱸后代的生長(zhǎng)速度； 具體檢測(cè)方法 (一)微衛(wèi)星引物
全文摘要
快速生長(zhǎng)的大口黑鱸微衛(wèi)星標(biāo)記篩選及其應(yīng)用，屬于魚類分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及快速生長(zhǎng)的大口黑鱸微衛(wèi)星標(biāo)記篩選，及利用這些標(biāo)記輔助大口黑鱸快速生長(zhǎng)品系的選育工作。篩選到5個(gè)與大口黑鱸生長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)的等位基因，并建立一種快速、準(zhǔn)確、有效地利用分子標(biāo)記檢測(cè)大口黑鱸優(yōu)良個(gè)體的方法，以早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的個(gè)體，為篩選優(yōu)良親本提供參考。利用本方法將生產(chǎn)中同時(shí)具有這5個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因的個(gè)體選作親本，有目的的選擇優(yōu)良種質(zhì)，從而保證后代種質(zhì)優(yōu)良，可提高生長(zhǎng)速度。該方法與傳統(tǒng)的方法相比，具有目的性強(qiáng)，作用效果直接的優(yōu)點(diǎn)。且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、檢測(cè)成本低，便于廣泛推廣使用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102127599SQ20101060506
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月26日
發(fā)明者葉星, 李勝杰, 樊佳佳, 白俊杰, 馬冬梅 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所