專利名稱：普通型玉米銹病病原真菌的檢測引物及分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種普通型玉米銹病病原真菌的特異引物 及分子檢測方法。
背景技術(shù)：
玉米銹病是全球范圍內(nèi)越來越嚴(yán)重的一種玉米真菌病害。至今已報道的玉米銹病 有3種，即由玉米柄銹菌(Puccinia sorghi Schw.)引起的普通玉米銹病，由玉米多堆 柄銹菌(Puccinia polysora Underw.)引起的南方玉米銹病和由玉米殼銹菌[Physopella zeae (Mains) Cummins & Ramachar]引起的熱帶玉米銹病。普通型玉米銹病是玉米上發(fā)生 最為普遍的一種類型。我國玉米銹病發(fā)生范圍較廣，遍及南北主要玉米產(chǎn)區(qū)，主要有普通型銹病和南方 型銹病兩種類型，普通型銹病多發(fā)生在低溫高濕的東北、西北玉米區(qū)；南方型銹病在我國臺 灣、海南、云南元江最先發(fā)生。近年來，玉米銹病在我國的危害逐漸加重，如隨著雜交玉米的 推廣和玉米種植制度的變化，玉米銹病在我國海南、江蘇、河南、山東、山西、河北、浙江等省 大面積暴發(fā)，造成當(dāng)?shù)赜衩桩a(chǎn)量銳減。玉米銹病發(fā)病中度的田塊，可以減產(chǎn)10 20%，感病 較重的可以達到50%以上，部分地塊甚至絕收。玉米銹病真菌感染14天之后才能夠在玉米葉片觀察到病斑，但是此時進行農(nóng)藥 噴施，不足以控制病情的蔓延，如果能夠在玉米銹病病原菌感染早期，及時、準(zhǔn)確的進行檢 測鑒定，可以做到提前預(yù)防，如選擇敏感有效的殺真菌劑，以控制病情的流行大爆發(fā)。因此， 建立一種能夠快速、準(zhǔn)確的監(jiān)測和鑒別玉米銹病病菌的檢測方法對于我國玉米的安全生產(chǎn) 具有重大的意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)向植物病理學(xué)科的不斷滲透，特別是相關(guān)的分子標(biāo) 記技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，為植物病原菌的診斷檢測提供了新的途徑。PCR技術(shù)以其特異性強、 敏感性高的特點很早就被研究用于病原真菌的診斷。近年來的有關(guān)報道更是層出不窮，顯 示了很廣闊的應(yīng)用前景，如中國專利文獻CN1880476C中公開了一種松樹脂潰瘍病菌的分 子檢測方法；CN101643788 A中公開了一種馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物及其用法。但有 關(guān)玉米銹病菌的分子檢測研究目前國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性好的普通型玉米銹病病原真菌的檢 測引物，并給出了一種可快速、準(zhǔn)確鑒別檢測出普通型玉米銹菌的分子檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
針對普通型玉米銹病病原真菌的設(shè)計出一對檢測引物，其核苷酸序列如下(SEQ ID N0:2、3)
上游引物5，- TTTAGTAGTCTCTATCTCAACAACA-3，， 下游引物5，_ AAGACTCTTTTGCATGGTTT-3’。
與上述檢測引物相對應(yīng)的普通型玉米銹病病原真菌的DNA特征片段的核苷酸序 列如SEQ ID NO :1所示。所述上游引物和下游引物對普通型玉米銹病病原真菌特異性擴增出約48;3bp的產(chǎn)物。所述檢測引物可在對普通型玉米銹病病原真菌的鑒別和檢測中的應(yīng)用。一種普通型玉米銹病病原真菌的分子檢測方法，包括以下步驟
S提取玉米葉片基因組DNA;
g PCR擴增，分別在PCR薄壁管中依次放入
10'Buffer 2. 5 μ L、25mmol/LMgCL2 2. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2. 0 μ L、前述上游引物和 下游引物2mmol/L各2. 5μ L、玉米葉片基因組DNA 10 50ng、Taq DNA聚合酶1. 0U，最后 以無菌去離子水補齊至25 μ L ；離心IOsec后進行PCR擴增；擴增條件為第一循環(huán)95°C預(yù) 變性5min ；然后94°C變性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸90sec，共30個循環(huán)；最后一 循環(huán)，72°C延伸IOmin補齊末端，擴增完成；
S:上步所得PCR產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠上用IXTAE緩沖液中電泳分析，電壓為
4-5V/cm,電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)分析；
④在483bp處出現(xiàn)特異條帶，說明玉米葉片帶普通型玉米銹病病原真菌，反之，則不 攜帶該病原真菌。本發(fā)明具有積極有益的效果
1.本發(fā)明所用探針(引物)對玉米條銹菌具有很強的特異性，能夠用于區(qū)別玉米普通銹 病病菌和玉米南方銹病病菌及玉米大斑病菌，玉米小斑病菌，玉米彎孢霉菌等玉米上的常 見病菌；可用于玉米銹病的檢測，并且其靈敏度可達0. OOlng/μ L02.本發(fā)明檢測方法實用性好，操作簡便快速，且測試成本較低。


圖1為本發(fā)明引物(探針)在55°C退火溫度下特異擴增的電泳圖譜；其中，1 10 泳道分別是南方玉米銹病真菌孢子樣品1，玉米南方銹病真菌孢子樣品2，玉米南方銹病葉 片，玉米普通銹病真菌孢子，玉米普通銹病葉片，大斑病菌，小斑病菌，彎孢霉菌，玉米健康 葉片，無菌去離子水；玉米普通銹病特異引物擴增結(jié)果；
圖2為本發(fā)明中玉米普通銹病探針(引物)在55°C退火溫度下特異擴增的靈敏度電泳 圖譜；其中，1 8 泳道分別為 10ng/yL,lng/yL,0. Ing/μ L，0. Olng/μ L，0. 001ng/yL, 0. OOOlng/μ L，0. OOOOlng/μ L，0. OOOOOlng/μ L, CK:無菌去離子水。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中的試驗方法，如無特別說 明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試驗材料及試劑，如無特別說明，均購自常規(guī)生化 試劑公司。
實施例1田間玉米銹病監(jiān)測對比試驗 (1)樣品采集
2009年2月17日，海南省三亞市沖坡鎮(zhèn)，8月沈日，吉林省長春市，9月M日，重慶市 錢江新華，分別隨機采取10、7、4株玉米葉片樣本，-80°C保存?zhèn)溆谩?2)按下述核苷酸序列合成普通型銹病檢測引物(下同) 上游引物5，- TTTAGTAGTCTCTATCTCAACAACA-3，，
下游引物5，_ AAGACTCTTTTGCATGGTTT-3’。(3)玉米銹菌檢測
①提取玉米葉片基因組DNA;
②PCR擴增，25μ L反應(yīng)體系分別在PCR薄壁管中依次放入
10'Buffer 2. 5 μ L、25mmol/LMgCL2 2. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2. 0 μ L、上述普通型玉米 銹病菌上游引物和下游引物2mmol/L各2. 5 μ L、玉米葉片基因組DNA 10 50ng、Taq DNA 聚合酶1. 0U,最后用無菌去離子水補齊至25 μ L ；離心IOsecJf PCR薄壁管放入PCR儀中擴 增；擴增條件為第一循環(huán)95°C預(yù)變性5min ；然后94°C變性45seC，55°C退火45seC，72°C 延伸90sec，共30個循環(huán)；最后一循環(huán)，72°C延伸IOmin補齊末端，擴增完成；
③PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上用1 X TAE緩沖液中電泳分析，電壓為4-5V/cm，電泳 結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)分析。④使用普通型玉米銹病菌上游引物及下游引物的玉米葉片DNA擴增的結(jié)果顯 示吉林的7個樣本共有5個樣本在483bp出現(xiàn)了一條特異帶，其檢出率為71. 4%，海南和重 慶的14個樣本均沒有條帶。該結(jié)果證實引物的特異性，可以準(zhǔn)確鑒別玉米普通銹病病菌， 該結(jié)果也與當(dāng)年玉米銹病菌田間病情普查的結(jié)果基本一致，能夠準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)報當(dāng)年玉米病 害流行爆發(fā)的情況。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種普通型玉米銹病病原真菌的檢測引物，其核苷酸序列如下 上游引物5，- TTTAGTAGTCTCTATCTCAACAACA-3，，下游引物5，_ AAGACTCTTTTGCATGGTTT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述普通型玉米銹病病原真菌的特異引物，其特征在于，與所述檢 測引物相對應(yīng)的普通型玉米銹病病原真菌的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述普通型玉米銹病病原真菌的特異引物，其特征在于，所述上游 引物和下游引物對普通型玉米銹病病原真菌特異性擴增出約48;3bp的產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1所述檢測引物在對普通型玉米銹病病原真菌的鑒別和檢測中的應(yīng)用。
5.一種普通型玉米銹病病原真菌的分子檢測方法，包括以下步驟 X提取玉米葉片基因組DNA;PCR擴增，分別在PCR薄壁管中依次放入 10'Buffer 2. 5 μ L、25mmol/LMgCL2 2. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2. 0 μ L、權(quán)利要求 1 所述 上游引物和下游引物2mmol/L各2. 5 μ L、玉米葉片基因組DNA 10 50ng、Taq DNA聚合酶 1.0U，最后以無菌去離子水補齊至25μ L ；離心IOsec后進行PCR擴增；擴增條件為第一循 環(huán)95°C預(yù)變性5min ；然后94°C變性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸90sec，共30個循 環(huán)；最后一循環(huán)，72°C延伸IOmin補齊末端，擴增完成；S上步所得PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上用IXTAE緩沖液中電泳分析，電壓為 4-5V/cm,電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)分析；④在483bp處出現(xiàn)特異條帶，說明玉米葉片帶普通型玉米銹病病原真菌，反之，則不 攜帶該病原真菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種普通型玉米銹病病原真菌的特異引物及分子檢測方法。該特異引物包括上游引物5’-TTTAGTAGTCTCTATCTCAACAACA-3'，下游引物5’-AAGACTCTTTTGCATGGTTT-3'；采用上述引物，經(jīng)PCR擴增(擴增參數(shù)95℃預(yù)變性5min；然后94℃變性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，共30個循環(huán)；72℃延伸10min)、瓊脂糖凝膠電泳，通過擴增產(chǎn)物(片段長度約480bp)檢測田間玉米的帶菌情況。本發(fā)明所用引物對玉米條銹菌具有很強的特異性；可用于玉米銹病的檢測，其靈敏度可達0.001ng/μL；本發(fā)明檢測方法實用性好，操作簡便快速。
文檔編號C12Q1/68GK102146439SQ201010606639
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者張磊, 楊文博, 王明鳳, 蔣士君, 袁紅霞, 許君, 邢國珍, 鄭文明 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)