專利名稱：單鏈非編碼MicroRNA三及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種MicroRNA的乙肝重癥病人血漿中的表達(dá)水平及其在預(yù)測和診斷 乙型肝炎重癥化中的作用。
背景技術(shù)：
目前全球估計有3. 5億慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，有三分之一的人口感染過 HBV0在我國，乙型肝炎是最為嚴(yán)重、最廣泛的傳染病之一，感染率高達(dá)60%，約有1. 2億人 攜帶HBV。乙型肝炎的發(fā)病率居傳染病首位，死亡數(shù)居傳染病第三位。乙肝重型肝炎是一類表現(xiàn)為短期大量肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致肝功能衰竭的綜合癥，其死 亡率極高，發(fā)展迅速，兇險而且臨床預(yù)后差。并嚴(yán)重威脅人們身體健康的肝疾病，因此，早期 診斷，以便及時采取有效的治療措施尤其重要。MicroRNA是由機(jī)體內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄的約70nt的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)前體(pre-MicroRNA)被 Dicer酶切割后產(chǎn)生的約22nt的非編碼單鏈RNA片段，在進(jìn)化過程中高度保守，能通過與靶 基因mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，廣泛地負(fù)調(diào)控 靶基因的表達(dá)。MicroRNA作為一種新的基因干預(yù)工具，具有高效、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，為基因 調(diào)控的研究和基因治療的發(fā)展帶來了新的視角。MicroRNA非常穩(wěn)定，用于臨床診斷試劑的 研發(fā)具有重復(fù)性好、容易操作等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用單鏈非編碼MicrORNA200a制備診斷試 劑盒以診斷重癥肝炎。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種單鏈非編碼MicroRNA，單鏈非編碼 MicroRNA200a 為 SEQ ID NO 1 所示的序列。本發(fā)明還同時提供了上述單鏈非編碼MicroRNA在制備診斷乙型重癥肝炎的試劑 盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還同時提供了一種用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，包括PCR試劑、探針、 上游引物和下游引物；探針為SEQ ID NO :5所示的序列，上游引物為SEQ ID NO :3所示的 序列，下游引物為SEQ ID NO :4所示的序列。作為本發(fā)明的用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒的改進(jìn)PCR試劑為 IXTaqManUniversal PCR MasteMix。MicroRNA是一類高度保守的單鏈RNA (約22 23個核苷酸)，生物信息學(xué)分析表 明，每個microRNA可能調(diào)節(jié)數(shù)百個靶基因，提示microRNA可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動中眾 多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)及血管生成等一系列過程中發(fā)揮作 用。另外，MicroRNA的異常表達(dá)將會導(dǎo)致生理的異常和疾病的產(chǎn)生，相反疾病的產(chǎn)生也將 導(dǎo)致MicroRNA的表達(dá)水平的改變，人們可以利用它來反映疾病的程度并做出相應(yīng)的治療。MicroRNA序列測定相對簡單，通過基因工程技術(shù)可以比較容易地分離純化人類外周血中存在的MicroRNA，并對其進(jìn)行測序。到目前為止已經(jīng)報道了超過800個MicroRNA序 列，但是由于MicroRNA功能的復(fù)雜性，大部分MicroRNA的功能和用途仍屬未知，因此，尋找 和開發(fā)有用的MicroRNA用于臨床診斷和治療是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司根 據(jù)目前的研究現(xiàn)狀研發(fā)了 MicroRNA芯片(TaqMan MicroRNA Arrays)，它包含大部分已知 的MicroRNA的反轉(zhuǎn)錄引物，利用該芯片可以檢測出已知序列的這些MicroRNA表達(dá)水平的 變化情況。本發(fā)明利用該芯片對乙型肝炎重癥患者血漿中MicroRNA進(jìn)行檢測，以正常人為 對照，對患者作一個比較全面的MicroRNA圖譜，從中找出與乙型肝炎重癥化病情變化密切 相關(guān)的MicroRNA分子。利用該分子可研發(fā)預(yù)測和診斷肝炎重癥化診斷試劑。在本發(fā)明中，發(fā)明人通過檢測乙型肝炎重癥患者血漿中MicroRNA 200a的表達(dá)水 平，觀察乙型肝炎重癥狀態(tài)下MicroRNA的改變情況。本發(fā)明選取正常人和已被確診為乙型 肝炎重癥患者的血漿，從血漿中提取RNA，利用MicroRNA表達(dá)譜芯片(美國應(yīng)用生物系統(tǒng) 公司!"aq Human MicroRNA Array A(B))對 MicroRNA 進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MicroRNA 200a 在乙型肝炎重癥患者血漿中顯著上調(diào)，即，該MicroRNA在乙型肝炎重癥患者血漿中表達(dá)較 正常人明顯增高。提示MicroRNA 200a在乙型肝炎重癥化中起著重要的調(diào)控作用，同時該 MicroRNA可以作為乙型肝炎重癥化的診斷標(biāo)志物。采用本發(fā)明的方法來早期診斷乙型肝炎重癥化，具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明確認(rèn)了 MicrORNA200a作為診斷乙肝重型肝炎的潛在靶點(diǎn)，能用于快速檢 測和診斷。mi croRNA在血漿和血清中非常穩(wěn)定，它們有效保護(hù)以免接觸RNases，在嚴(yán)酷環(huán)境 的條件下仍能保持穩(wěn)定。因此，它們的穩(wěn)定性使得其實(shí)際值與在病人身上得到的測試值吻 合的很好。血清中microRNA表達(dá)譜的檢測技術(shù)已經(jīng)成熟，目前研究microRNA表達(dá)譜的常 用技術(shù)主要有Northern雜交、表達(dá)芯片、實(shí)時熒光定量PCR和Solexa測序等，方法快速、便 捷，精確度和靈敏度可滿足臨床需求。血清microRNA作為臨床診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，主要有以下優(yōu)點(diǎn)檢測的損傷小、 穩(wěn)定性好、靈敏度高，可應(yīng)用于疾病早期變化的檢測。目前尚未見用于診斷乙型肝炎重癥 化的microRNA，但是microRNA用于診斷其他疾病已經(jīng)獲得許多令人鼓舞效果例如血漿 miR-92被成功用作結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物，靈敏度可達(dá)89 %，特異性達(dá)到70 %，且腫瘤切 除后miR-92的表達(dá)量較術(shù)前顯著降低；早期診斷可以大大提高生存率和改善預(yù)后。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是MicroRNA表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果，正常人中MicroRNA 200a幾乎不表達(dá)，而 乙型肝炎重癥患者則明顯的高表達(dá)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1血漿中總RNA的提取選取浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，乙型肝炎重癥患者4例，同時選取4例年齡、 性別相匹配的正常人，抽取細(xì)1全血；即抽取乙型肝炎重癥患者的全血、正常人的全血各4 例。以TOsnRNA作為內(nèi)參，MicroRNA的相對表達(dá)水平用表示，檢測方法相同。實(shí)時熒光定量PCR根據(jù)美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供的TaqMan MicroRNA Arrays進(jìn)行操作。為了減少個體差異我們把不同組的血漿進(jìn)行混合(即，4例患者的血漿進(jìn)行混合， 4例正常人的進(jìn)行混合)。利用mirVana PARIS Kit來從血漿樣品中提取總RNA，提取方 法根據(jù)該試劑盒的說明書操作，過程依次如下1.將血漿樣品(最大體積625 μ L)(冰上凍融)與等體積的2Χ Denaturing Solution室溫混勻。如果血漿樣品少于lOOul，先加Cell Disruption Buffer到彡100 μ L， 再加入等體積的2X Denaturing Solution，立刻充分混勻(渦旋30s)，冰上孵育5min。2.加入試劑盒中所提供的酸化的酚/氯仿到上述混合液。3.渦旋震蕩30-60s混勻。4.室溫10，OOOXg離心5min分離出水相和有機(jī)相(水相在上層)。5.轉(zhuǎn)移位于上層的水相到新的EP管，并標(biāo)注體積。6.加入水相1. 25倍體積的100%乙醇(室溫)到水相，充分混勻。7.將過濾柱置于Collection Tube (收集管)中，吸取裂解物和乙醇的混合物(即 步驟6所得)到過濾柱上。8. 10，000 Xg 離心 30s。9.棄濾液，重復(fù)離心，直到所有的裂解物/乙醇混合物都濾過過濾柱為止。將過濾 柱重新置于收集管中。加入700yL MicroRNA Wash Solution 1到過濾柱。10，OOOXg離 心 15s。10.棄濾液，置過濾柱到相同的收集管。11.加入 500 μ L Wash Solution 2/3 到過濾柱。10，000 X g 離心 15s，棄濾液，置 過濾柱到相同的收集管。12.重復(fù)步驟11。13. 10，000X g 空離 Imin014.轉(zhuǎn)移過濾柱到新的收集管。15.加入IOOyL預(yù)熱(95 °C )的洗脫液或者無核酶水到過濾柱中央，閉蓋， 10，OOOXg離心30s，棄柱，收集總RNA，-20°C保存或更低溫度保存。以下實(shí)施例中所用的試劑均為常規(guī)試劑，能通過市購的方式獲得，例如，可購自美 國ABI公司。實(shí)施例2預(yù)擴(kuò)增1.進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)(1)凍融以下試劑Megaplex RT PrimersTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit componentsMgCl2反應(yīng)體系3 μ L(1 to 350ng) total RNA(實(shí)施例 1 所得)4. 5μ L of RT reaction mix(如表 1)(2)混合以下試劑(如表1所述)到1. 5ml微離管。表 權(quán)利要求
1.單鏈非編碼MicroRNA，其特征是單鏈非編碼MicroRNA200a為SEQ ID NO 1所示 的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的單鏈非編碼MicroRNA在制備診斷乙型重癥肝炎的試劑盒中的應(yīng)用。
3.一種用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，其特征是包括PCR試劑、探針、上游引物和 下游引物；所述探針為SEQ ID NO :5所示的序列，上游引物為SEQ ID NO :3所示的序列，下 游引物為SEQ ID NO :4所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，其特征是所述PCR試劑 % 1X TaqMan Universal PCR MasteMix。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單鏈非編碼MicroRNA，該單鏈非編碼MicroRNA200a為SEQ ID NO1所示的序列。本發(fā)明還同時公開了上述單鏈非編碼MicroRNA在制備診斷乙型重癥肝炎的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還同時公開一種用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，包括PCR試劑、探針、上游引物和下游引物；所述探針為SEQ ID NO5所示的序列，上游引物為SEQ ID NO3所示的序列，下游引物為SEQ ID NO4所示的序列。
文檔編號C12N15/11GK102140452SQ201010610278
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者劉東成, 李淑萍, 鄭敏, 陳 峰, 陳智 申請人:浙江大學(xué)