專利名稱：用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’-脫氧鳥苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成2’ -脫氧鳥苷的方法。
背景技術(shù)：
2’ -脫氧鳥苷是合成寡脫氧核苷酸等抗病毒、抗腫瘤核酸藥物的重要原料。核苷類衍生物的傳統(tǒng)制造方法大多采用化學合成法，此法的缺點是化學合成步驟多，難度高，周期長且有異構(gòu)體產(chǎn)生。例如要對天然核苷進行化學修飾，往往需要先對堿基或核糖活性基團進行保護，反應(yīng)結(jié)束后還要去除保護基團，這樣合成反應(yīng)的總收率將會降低。用化學法直接將堿基與核糖縮合，會形成α異構(gòu)體，要獲得與天然相同的化合物，往往需要復(fù)雜的分離方法，而且收率較低?；瘜W合成要用到多種易燃易爆、有毒有害的有機溶劑，對環(huán)境的污染和對人身的傷害不容忽視。因此，近年來人們一直致力于生物酶法合成核苷及其類似物。酶法合成核苷藥物， 不需要保護基團，具有較高催化效率和立體特異性，通常酶法生產(chǎn)的核苷均為結(jié)構(gòu)。特別是嘌呤類核苷的化學合成遠比嘧啶類核苷復(fù)雜和困難。所述2’-脫氧鳥苷亦可以DNA為原料，用核酸酶水解生成脫氧核苷酸，然后再用磷酸單酯酶水解，使其生成脫氧核苷，然后從中分離出2'-脫氧尿苷。此方法成本高，而且DNA來源有限，大量生產(chǎn)會受到限制。JP11-137290文獻報道，日本橫關(guān)鍵三等應(yīng)用肺炎克雷伯氏菌 (Klebsillapneumoniae IF03321)核苷磷酸化酶的生產(chǎn)方法，但2，-脫氧鳥苷轉(zhuǎn)化率僅為 28%。他在 Molecular Catalysis B =Enzymatic, 2000 (10)文獻報道，使用產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenesAJ-11125)為酶源，以2’ -脫氧尿苷和鳥苷為底物，2’ -脫氧鳥苷轉(zhuǎn)化率僅為18%。其它亦有用胸苷和2、6_ 二氨基嘌呤生成2、6_ 二氨基2’-脫氧核苷， 再用腺苷脫氨酶處理得到2’ -脫氧鳥苷的方法，但路線太長，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’ -脫氧鳥苷的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明的方法，包括如下步驟(1)將乙酰短桿菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo· 04了2 接入培養(yǎng)
基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得的菌體作為核苷酸磷酸化酶備用；所述培養(yǎng)基為常規(guī)的，其組分和重量含量包括牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏 0. 5%, NaCl 0. 5%，pH 為 7. 0 ；(2)然后將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，脫氧核糖受體的含量為5 40mol/L，脫氧核糖供體濃度為5 40mol/L，磷酸緩沖液濃度為10 50mmol/ L，菌體的濕重加入重量為1 5%，40 65°C反應(yīng)1 4h，離心，獲得溶液含有2’-脫氧鳥苷的溶液，溶液經(jīng)HPLC檢測，2’-脫氧鳥苷的轉(zhuǎn)化率達60%，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集2’-脫
氧鳥苷；
所述的脫氧核糖受體選自鳥嘌呤、鳥苷或鳥苷酸，但由于鳥嘌呤在水中溶解度較低，其中以鳥苷酸為最佳；所述的脫氧核糖供體選自2’ -脫氧核糖、2’ -脫氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’ -脫氧尿苷或2’ -脫氧胞苷等，但從目前原料來源難易和價格因素考慮，選擇胸苷、2’ -脫氧尿苷或脫氧核糖較好。所述的乙酰短桿菌(Brevibacterium acetylicum) QD96，在已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會。保藏號為CGMCCNo. 0472，保藏日期為2000年7月5日，在中國專利 ZL 00125112.0中，該菌種的有關(guān)信息，已經(jīng)進行了充分的描述，本發(fā)明不再贅述。HPLC檢測條件色譜柱0DS2-C18柱(4. 6mmX250mm,5ym)流動相5(toimol/LKH2PO4(用H3PO4 調(diào) ρΗ5· 5)和 10% 甲醇。V(KH2PO4) V(甲醇) =9:1。流速L0ml/min檢測波長260nm進樣量20μ 1柱溫25°C。本發(fā)明使用乙酰短桿菌QD96的酶合成2’ -脫氧鳥苷，可低成本，高收率地獲得 2’ -脫氧鳥苷，其轉(zhuǎn)化率可達60%以上。


圖1為脫氧鳥苷反應(yīng)六種標準品HPLC圖譜。圖2為實施例1的脫氧鳥苷反應(yīng)液1的HPLC圖譜。
具體實施例方式實施例1在250ml三角瓶中裝入50ml培養(yǎng)基，其中，含牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏 0. 5%,NaCl 0. 5%,pH 7. 0，于118°C滅菌30min，冷卻后接入乙酰短桿菌QD96，于30°C振蕩 (200r/min)培養(yǎng)16h，將培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min冷凍離心30min，再用0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7. 0)洗滌，再離心，所得之菌體冷藏保存，作為核苷酸磷酸化酶備用。在IOOml圓底燒瓶中，裝入50ml底物溶液，其中含鳥苷酸和胸苷濃度各為40mol/ L，磷酸緩沖液為25mmol/L，菌體加入量為5% (濕重)，在恒溫水浴中60°C攪拌反應(yīng)池， 反應(yīng)完畢，冷凍離心去除菌體和少量胸腺嘧啶沉淀物。然后將溶液經(jīng)HPLC檢測其中含 24mmol/L脫氧鳥苷，其轉(zhuǎn)化率達60% (見圖幻。經(jīng)陰離子交換樹脂分離，可獲得0. 26g脫氧鳥苷。其中，陰離子交換樹脂分離的方法，為公知的方法，在中國專利ZL98110601.3， ZL0213639. 2等中已經(jīng)有詳細的報道。實施例2在IOOml圓底燒瓶中裝入50ml底物溶液，其中含鳥苷酸和2’-脫氧尿苷濃度各為 40mmol/L，磷酸緩沖液為25mmol/L，菌體加入量為5% (濕重)，以后操作同實施例1。將反應(yīng)后溶液經(jīng)HPLC檢測，其中含^mmol/L脫氧鳥苷，其轉(zhuǎn)化率65%。
權(quán)利要求
1.用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’-脫氧鳥苷的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)培養(yǎng)乙酰短桿菌(Brevibacteriumacetylicum)QD96-CGMCCNo. 0472 ；(2)然后將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脫氧核糖受體、 脫氧核糖供體和磷酸緩沖液，反應(yīng)，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集2’ -脫氧鳥苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脫氧核糖受體選自鳥嘌呤、鳥苷或鳥苷酸，所述的脫氧核糖供體選自2’ -脫氧核糖、2’ -脫氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’ -脫氧尿苷或2’ -脫氧胞苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脫氧核糖受體為鳥苷酸，所述的脫氧核糖供體為胸苷、2’ -脫氧尿苷或脫氧核糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的方法，其特征在于，所述底物溶液中，脫氧核糖受體的含量為5 40mol/L，脫氧核糖供體濃度為5 40mol/L，磷酸緩沖液濃度為10 50mmol/L，菌體的濕重加入重量為1 5%，40 65°C反應(yīng)1 4h。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種應(yīng)用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’-脫氧鳥苷的方法，包括如下步驟(1)培養(yǎng)乙酰短桿菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo.0472；(2)然后將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脫氧核糖受體、脫氧核糖供體和磷酸緩沖液，反應(yīng)，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集2’-脫氧鳥苷。本發(fā)明使用乙酰短桿菌QD96的酶合成2’-脫氧鳥苷，可低成本，高收率地獲得2’-脫氧鳥苷，其轉(zhuǎn)化率可達60％以上。
文檔編號C12P19/32GK102174618SQ20101061173
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者周長林, 曹靜, 李喻, 邱志云, 邱蔚然, 陸長德 申請人:南通秋之友生物科技有限公司, 江蘇秋之友核酸藥物工程技術(shù)研究中心有限公司