專利名稱：預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗 (細(xì)胞苗)及其制備方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)鴨業(yè)是我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，在我國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有著非常重要的地位，然而鴨病的肆虐不但制約著我國養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)?；?、集約化方向的邁進(jìn)，而且影響著我國禽類產(chǎn)品的進(jìn)出口等國際化多邊貿(mào)易的發(fā)展，同時(shí)會給國家和地區(qū)帶來巨大的社會、 經(jīng)濟(jì)和人類生命財(cái)產(chǎn)損失。鴨病毒性肝炎是鴨群的常見疾病，對雛鴨有著較大的危害。鴨病毒性肝炎的防控直接影響著我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，一直以來都是我國畜牧業(yè)生產(chǎn)所關(guān)注的重中之重。鴨病毒性肝炎(Duck virus hepatitis, DVH)簡稱鴨肝炎，是由鴨甲型肝炎病毒 (Duck hepatitis A virus, DHAV，又稱鴨肝炎病毒)引起雛鴨的一種以肝臟呈現(xiàn)出血性炎癥為特征的急性烈性傳染病。本病的潛伏期為2-5d，人工感染時(shí)的潛伏期為Id。雛鴨發(fā)病時(shí)表現(xiàn)精神萎靡、縮頭、眼半閉呈瞌睡狀、不隨群走動、孤立于群外或行動呆滯、常蹲臥、共濟(jì)失調(diào)等，常在出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后數(shù)小時(shí)或數(shù)天死亡。有些急性病例雛鴨沒有任何癥狀，突然倒地死亡。少數(shù)病愈雛鴨生長緩慢，達(dá)不到正常的生長體重。鴨病毒性肝炎為小RNA病毒科Avih印atovirus病毒屬，無囊膜不分節(jié)段的正鏈 RNA病毒，無血凝性，對酸、熱有較強(qiáng)抵抗力。該病毒RNA全長77 7799，只有一個(gè)開放閱讀框，翻譯產(chǎn)生一個(gè)含22M個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白。因抗原性差異，DHAV可分為三個(gè)基因型，分別為DHAV-I，DHAV-2 (Taiwan)和DHAV-3 (Korea)，三個(gè)亞型之間無血清學(xué)交叉反應(yīng)。目前鴨病毒性肝炎在世界多數(shù)養(yǎng)鴨國家均有發(fā)生和流行，我國許多養(yǎng)鴨的省市均有該病的流行。對鴨病毒性肝炎的防控中，目前采用康復(fù)鴨血清、高免鴨血清及免疫種鴨的卵黃抗體治療本病可較好地控制本病流行。另外，疫苗已研制成三種氫氧化鋁DHV雞胚化弱毒苗(組織苗)、氫氧化鋁DHV雞胚化弱毒滅活苗(組織苗)及氫氧化鋁DHV雞胚化強(qiáng)毒滅活苗(組織苗)。從病原入手，進(jìn)一步研究分子致病機(jī)理和病毒變異機(jī)理，開發(fā)相應(yīng)疫苗是防控該病的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明提供了鴨甲型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株，是2010年10月，劉文軍、周遠(yuǎn)成在北京市房山區(qū)某鴨場的發(fā)病鴨體內(nèi)分離獲得的一株鴨病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，已于2010年12月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為 CGMCC No. 4457。鴨甲型肝炎病毒 3 型(Duck hepatitis A virus type 3) DHAV-FS ^CGMCC No. 4457簡稱鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株。鴨甲型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株是 2009 年 4 月，劉文軍、周遠(yuǎn)成在山東省濰坊市鴨場的發(fā)病鴨體內(nèi)分離獲得的一株鴨病毒性肝炎I型病毒(DHAV-I)，已于2010年4月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 3746。 鴨甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCC No. 3746 簡稱鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株。本發(fā)明還保護(hù)鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在制備鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株和鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在制備鴨病毒性肝炎疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)將鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗 (細(xì)胞苗)。本發(fā)明還保護(hù)將鴨甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCC No. 4457 和鴨甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV_SD 株 CGMCC No. 3746滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)。本發(fā)明還保護(hù)一種制備鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，得到的上清即為病毒液；所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞或DF-I細(xì)胞。所述將鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，收集上清液的方法可包括如下步驟①將鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為生產(chǎn)用種毒；②將生產(chǎn)用種毒接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為制苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過凍融破碎細(xì)胞，收集上清液。所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述宿主細(xì)胞時(shí)MOI均可為0. 001，培養(yǎng)時(shí)間均可為48-72小時(shí)；所述步驟①、步驟②和步驟③中培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48小時(shí)；所述步驟 ③中，可通過5000rpm(Thermo legend RT離心機(jī)，角轉(zhuǎn)子#333 離心30_40min收集上清液。所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞時(shí)，在所述接種前可先進(jìn)行如下擴(kuò)增培養(yǎng)(1)將凍存的BHK21細(xì)胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉淀；用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮沉淀，得到2X IO5細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，37°C,5% CO2靜置培養(yǎng)至每毫升含有1 X IO6 MM ； (2)在步驟(1)的基礎(chǔ)上消化細(xì)胞，然后重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使每毫升含有2X105 細(xì)胞，然后在如下條件下培養(yǎng)至每毫升含有IXlO6細(xì)胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、 37100轉(zhuǎn)/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力攪拌器，攪拌器貨號356907 ；攪拌桿貨號 356886)。所述細(xì)胞培養(yǎng)液具體可為95體積份的DMEM和5體積份的胎牛血清混合，加入雙抗(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml)。本發(fā)明還保護(hù)一種制備鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)的方法，是將以上任一所述
4方法制備的所述病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。所述滅活的方法具體如下在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為 0. 1%，37°C滅活M小時(shí)，得到滅活后病毒液。所述乳化的方法具體如下將3體積份油相、 1體積份水相和(質(zhì)量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0.01% (質(zhì)量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。本發(fā)明還保護(hù)另一種制備鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)的方法，包括如下步驟(1)將上述方法制備的鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到活性成分甲；(2)將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到活性成分乙；(3)將活性成分甲和活性成分乙混合，得到鴨病毒性肝炎疫苗。所述滅活的方法具體如下在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為 0. 1%，37°C滅活M小時(shí)，得到滅活后病毒液。所述乳化的方法具體如下將3體積份油相、 1體積份水相和(質(zhì)量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0.01% (質(zhì)量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。本發(fā)明還保護(hù)另一種制備鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)的方法，包括如下步驟將上述方法制備的鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液混合后作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。所述鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液可通過如下方法制備將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，收集上清液，該上清液即為病毒液；所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞或DF-I細(xì)胞。所述將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，收集上清液的方法可包括如下步驟①將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為生產(chǎn)用種毒；②將生產(chǎn)用種毒接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為制苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過凍融破碎細(xì)胞，收集上清液。所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述宿主細(xì)胞時(shí)MOI均可為0. 001，培養(yǎng)時(shí)間均可為48-72小時(shí)；所述步驟①、步驟②和步驟③中培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48小時(shí)；所述步驟 ③中，可通過5000rpm(Thermo legend RT離心機(jī)，角轉(zhuǎn)子#333 離心30_40min收集上清液。所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞時(shí)，在所述接種前可先進(jìn)行如下擴(kuò)增培養(yǎng)(1)將凍存的BHK21細(xì)胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉淀；用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮沉淀，得到2X IO5細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，37°C,5% CO2靜置培養(yǎng)至每毫升含有1 X IO6MM ； (2)在步驟(1)的基礎(chǔ)上消化細(xì)胞，然后重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使每毫升含有2X105 細(xì)胞，然后在如下條件下培養(yǎng)至每毫升含有IXlO6細(xì)胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、 37100轉(zhuǎn)/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力攪拌器，攪拌器貨號356907 ；攪拌桿貨號 3568860。所述細(xì)胞培養(yǎng)液具體可為95體積份的DMEM和5體積份的胎牛血清混合，加入雙抗(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml)。所述滅活的方法具體如下在混合后的所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為0. 1%，37°C滅活M小時(shí)，得到滅活后病毒液。所述乳化的方法具體如下將3體積份油相、1體積份水相和(質(zhì)量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為 0.01% (質(zhì)量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。本發(fā)明提供的疫苗免疫雛鴨時(shí)，采用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為0. 2mL·本發(fā)明提供的疫苗免疫種鴨時(shí)，采用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為1ml。本發(fā)明提供了一株有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強(qiáng)毒株。將該毒株接種到敏感細(xì)胞上，收獲細(xì)胞液，滅活后乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗 (細(xì)胞苗)，有利于鴨病毒性肝炎的防控。本發(fā)明可以有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發(fā)，同時(shí)簡化了生產(chǎn)工藝，可規(guī)?；a(chǎn)并應(yīng)用于臨床。


圖1為鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株P(guān)CR檢測結(jié)果；泳道1為陽性對照，2為鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株，3為Marker5000，4為陰性對照。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、鴨肝炎病毒DHAV-FS毒株的發(fā)現(xiàn)和鑒定一、DHAV-FS 株的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明人從野外某鴨場(2010年10月，在北京市房山區(qū)的鴨場，由劉文軍、 周遠(yuǎn)成發(fā)現(xiàn))的發(fā)病鴨體內(nèi)分離獲得了一株鴨病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，將其命名為 DHAV-FS株，已于2010年12月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 4457。二、DHAV-FS 株的鑒定1、病毒形態(tài)DHAV-FS株的病毒粒子呈二十面體對稱，直徑約40nm。2、分子生物學(xué)鑒定提取DHAV-FS的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)GENBANK發(fā)表的DHAV全基因序列(GU250782)設(shè)計(jì)的一對特異性引物(Pl和P2)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為250bp的目的條帶。PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖1。測序結(jié)果如序列表的序列1所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與現(xiàn)有DHAV具有很高的同源性，但也有序列差異。結(jié)果表明DHAV-FS毒株為DHAV陽性。
上游引物 DHV-PGRl :5，-GGAGGTGGTGCTGAAA-3，；
下游弓丨物 DHV-PCR2 5，-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3，。3、血凝性DHAV-FS株對雞、兔、豬、豚鼠紅細(xì)胞均不凝集。4、對細(xì)胞的半數(shù)感染量(TCID5tl)DHAV-FS 株第 16 代的細(xì)胞毒為 107_2TCID5(1/ml、27 代的細(xì)胞毒為 107 °4TCID5(1/ml。5、對雞胚的半數(shù)感染量(EID5tl)DHAV-FS 株第 13 代的滴度為 107· 18EID5(l/0. 2mL·6、對雛鴨的致病力測定DHAV-FS 株 3 代對雛鴨的致病力測定，滴度為 104 25ID5(1/ml，103 8°LD5(1/ml。ID50 為半數(shù)感染量，LD50為半數(shù)致死量。7、穩(wěn)定性將DHAV-FS株在細(xì)胞傳32代，每0. Iml病毒含量均為IO7TCID5tl以上，DHAV-FS毒株在32代以內(nèi)是穩(wěn)定的，可以作為疫苗生產(chǎn)用種毒。8、免疫原性DHAV-FS株F1 !^32均具有良好的免疫原性，利于疫苗的研究。9、特異性將DHAV-FS株稀釋至104TCID5(1/ml，與等量抗鴨肝炎病毒特異性血清混合，室溫放置1小時(shí)后，接種SPF雞胚10個(gè)，觀察120小時(shí)。在M 120小時(shí)內(nèi)不引起特異性死亡， 且至少存活8個(gè)。實(shí)施例2、鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)的制備一、雞胚成纖維細(xì)胞系DF-I的培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞系DF-I 購自北京中原公司(ATCC細(xì)胞系編號為CRL_12203)。細(xì)胞培養(yǎng)液9體積份的DMEM和1體積份的FBS混合，加入雙抗(青霉素100U/ ml，鏈霉素 100U/ml)。1、細(xì)胞復(fù)蘇將DF-I細(xì)胞凍存管從液氮中取出，迅速在37°C水浴鍋中加溫，使細(xì)胞液融化。將凍存管在臺式離心機(jī)中SOOrpm離心5min，棄上清。將細(xì)胞沉淀在3ml培養(yǎng)基中吹打均勻 (6em直徑培養(yǎng)皿中)，放入(X)2恒溫培養(yǎng)箱中，37 °C、5% CO2靜置培養(yǎng)。2、細(xì)胞傳代使用電動吸引器，沿培養(yǎng)皿壁吸去廢液。PBS清洗1-2次，吸去廢液。沿培養(yǎng)皿壁加入胰酶，37°C消化。待到細(xì)胞形態(tài)變圓，吸去胰酶，用DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，使細(xì)胞均勻懸浮于培養(yǎng)基中，得到細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液均勻分為幾份，加入到新的培養(yǎng)皿中，加入新的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)。3、細(xì)胞凍存將細(xì)胞培養(yǎng)液置于離心管中，SOOrpm離心5min。小心棄上清，用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞。將重懸好的細(xì)胞分裝，每只凍存管不超過1.5ml。凍存管先置于4°C、30min，然后-20°C、2h，然后-80°C過夜，然后放入液氮罐中保存。二、病毒液的制備和TCID5tl的測定1、病毒液的制備鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株接種DF-I細(xì)胞；細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)(約48 小時(shí))，收獲細(xì)胞液，反復(fù)凍融3次，收取上清(病毒液)。2、病毒液的TCID5tl測定(1)準(zhǔn)備細(xì)胞取生長良好的DF-I細(xì)胞，消化后用10% FBS DMEM制備細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X IO5個(gè)/ml，然后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0. Iml/孔。37°C、5 % CO2培養(yǎng)使其鋪滿單層。(2)準(zhǔn)備病毒將步驟1制備的病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋。(3)病毒液的TCID5tl測定96孔板中細(xì)胞長滿單層后，將培養(yǎng)液吸出，加入病毒稀釋液，每個(gè)梯度8-16孔，每孔0. lml,37°C,5% CO2培養(yǎng)96小時(shí)后觀察病變孔數(shù)并記錄。各個(gè)稀釋度的CPE結(jié)果見表 1。表1各個(gè)稀釋度的CPE結(jié)果
權(quán)利要求
1.鴨甲型肝炎病毒3型(Duckhepatitis A virus type 3) DHAV-FS株，其保藏號為 CGMCC No. 4457。
2.鴨甲型肝炎病毒3型(Duck h印atitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No. 4457 在制備鴨病毒性肝炎疫苗中的應(yīng)用。
3.鴨甲型肝炎病毒3型(Duck h印atitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No. 4457 和鴨甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCC No. 3746 在制備鴨病毒性肝炎疫苗中的應(yīng)用。
4.將鴨甲型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCCNo. 4457滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗。
5.將鴨甲型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCCNo. 4457 和鴨甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD ^ CGMCCNo. 3746滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗。
6.制備鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨甲型肝炎病毒 3 型(Duck hepatitis A virus type 3) DHAV-FS 株 CGMCC No. 4457 在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，收集上清液，該上清液即為病毒液；所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞或DF-I 細(xì)胞。
7.一種制備鴨病毒性肝炎疫苗的方法，是將權(quán)利要求6所述方法制備的鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。
8.一種制備鴨病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步驟(1)將權(quán)利要求6所述方法制備的鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到活性成分甲；(2)將鴨甲型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD 株 CGMCCNo. 3746的病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到活性成分乙；(3)將活性成分甲和活性成分乙混合，得到鴨病毒性肝炎疫苗。
9.一種制備鴨病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求6所述方法制備的鴨甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鴨甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis Avirus type 1)DHAV-SD株CGMCC No. 3746的病毒液混合后作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述鴨甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD株CGMCC No. 3746的病毒液是通過如下方法制備的 將鴨甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCCNo. 3746 在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，收集上清液，該上清液即為病毒液；所述宿主細(xì)胞為BHK21 細(xì)胞或DF-I細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明提供了鴨甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株，CGMCC No.4457。本發(fā)明提供的毒株為具有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強(qiáng)毒株。將該毒株接種到敏感細(xì)胞上，收獲細(xì)胞液，滅活后乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗(細(xì)胞苗)，有利于鴨病毒性肝炎的防控。本發(fā)明可以有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發(fā)，同時(shí)簡化了生產(chǎn)工藝，可規(guī)模化生產(chǎn)并應(yīng)用于臨床。
文檔編號C12N7/00GK102174476SQ201010611929
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者劉文軍, 周遠(yuǎn)成, 孫蕾, 李晶, 畢玉海 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所