專利名稱：一種啟動子及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動子及其應用。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物，世界上接近50%的人口以水稻為食，不斷提高水稻產(chǎn)量是育種家不斷追求的目標。分蘗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重是水稻產(chǎn)量的主要構(gòu)成要素。其中，粒重作為影響水稻產(chǎn)量的重要因素漸漸受到人們的重視。控制水稻粒重的基因是影響水稻粒重的重要因素，但其表達方式及其強弱卻受到基因本身啟動子的直接調(diào)控，表達方式的改變將會影響基因功能的表達程度，從而影響水稻粒重和產(chǎn)量的提高。在水稻馴化的過程中，不斷滿足著人類對糧食需求的同時，等位基因的數(shù)目在不斷減少，遺傳資源的狹窄嚴重制約水稻產(chǎn)量的進一步提高。我國水稻遺傳資源豐富，從這些豐富的資源中發(fā)掘、定位控制水稻粒重的新基因及其啟動子，不僅為培育高產(chǎn)水稻新品種提供理論支持，而且對加強我國水稻基因資源的保護，將資源優(yōu)勢變成經(jīng)濟優(yōu)勢具有重要戰(zhàn)略意義。近年來，隨著水稻分子設(shè)計育種技術(shù)的成功應用，迫切需要根據(jù)目前的水稻遺傳資源的情況，有效地從中選育出有增加粒重潛力的品種加以遺傳改良，或?qū)ζ淇刂屏Ｖ氐幕蚣捌鋯幼舆M行分離和研究，并將最終應用于水稻育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物控制粒重基因的啟動子及其應用。本發(fā)明所提供的植物控制粒重基因的啟動子，名稱為P-GS6，來源于稻屬普通栽培稻(O.sativa.)中一種控制粒重基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的 DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID No 1由1545個堿基組成，是GS6的啟動子部分，含有主要的調(diào)控區(qū)域，且存在多處典型CGTGCG和CANNTG結(jié)構(gòu)域，這些是油菜素內(nèi)脂信號傳遞過程中轉(zhuǎn)錄因子BZRl和BESl結(jié)合區(qū)域。含有上述啟動子的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增啟動子P-GS6中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。在所述表達盒中，所述植物胚乳特異性表達啟動子的下游連接結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者能夠干擾內(nèi)源基因表達的小RNA，用于驅(qū)動結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表達。所述重組表達載體是上述表達盒與質(zhì)粒、病毒或運載體表達載體所構(gòu)建的重組載體，所述重組表達載體為重組植物表達載體，所述重組植物表達載體含有上述表達盒并且能夠?qū)⑺龅谋磉_盒轉(zhuǎn)送進入植物宿主細胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。使用GS6啟動子構(gòu)建植物表達載體時，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用，比如，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛生素基因WDiquitin啟動子(ρ^ )等。 使用本發(fā)明的基因啟動子構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與基因 GS6編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明編碼提高水稻粒重的新基因的啟動子P-GS6 的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導、 農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化水稻細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的水稻細胞或組織培育成植株。本發(fā)明的提高水稻粒重新基因的啟動子P-GS6，研究表明該基因控制粒重的增加是由籽粒寬度的增加引起的。因此該基因啟動子對于水稻粒重分子機制的研究，水稻高產(chǎn)新品種的選育具有重要的理論及實際意義，并為改良作物的粒重提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應用空間和市場前景。


圖1為pGS6:⑶S載體結(jié)構(gòu)示意2為啟動子功能驗證結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、控制水稻粒重基因的啟動子P-GS6的獲得及其效果驗證一、控制水稻粒重基因的啟動子P-GS6的獲得本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種控制水稻粒重的新基因GS6，并對其上游序列進行克隆和鑒定，獲得啟動子P-GS6。我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)+52bp開始存在序列TGAGAG的重復具有重要的作用，我們利用啟動子預測軟件!Promoter scan對GS6啟動子進行分析，根據(jù)啟動子序列分析，轉(zhuǎn)錄起始位點上游不存在明顯的TATAbox，而+4位點存在典型的起始位點特征，推測該基因是依賴起始子(initiator，Inr)的基因轉(zhuǎn)錄，結(jié)果表明TSS位點周圍存在大量的順式作用元件，并且在TGAGAG序列重復區(qū)域周圍存在GT1 CONSENSUS (GTAAT)、 GTGANTG10 (GTGA)、S0RLIP5AT (GAGTGAG)和 SUREC0REATSULTR11 (GAGAC)等明顯的順式作用元件。由于TGAGAG序列重復數(shù)目的變化，順式作用元件GTGANTG10保守序列GTGA的數(shù)目有了明顯的變化，GTGA結(jié)構(gòu)域最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥晚花基因glO的啟動子，而glO是果膠酯裂解酶的同源基因。另外，其順式作用元件GT1C0NSENSUS (GTAAT)與轉(zhuǎn)錄起始位點的長度由于TGAGAG序列重復數(shù)目的改變而改變，而GTAAT結(jié)構(gòu)域則與光誘導相關(guān)，由此我們推測 GTAAT結(jié)構(gòu)與起始位點的變化影響到轉(zhuǎn)錄水平。設(shè)計引物擴增該啟動子，引物序列為PSF :5' AGTGGTGGCACAACACAATG 3'，PSR 5' GTTCCGGCGAGTGACGT 3'。以秈稻93-11 (購自國家種質(zhì)資源庫)的基因組基因為模板，以上述引物為引物進行PCR擴增。擴增體系為在20 μ 1 SSR反應體系中包括40ng DNA模板，0. 2 μ 1 Taq plus酶 (2· 5υ/μ 1)，10μ 1 GC buffer 1(2Χ),1.6μ 1 dNTPs (2· 5mM)，2pmol 引物。擴增程序為SSR擴增程序如下:94°C 4min -MV 45s，58°C 45s，72°C lmin30s, 35cycles ；最后 72°C延伸 IOmin0擴增得到約1. 5kb的片段，，分別選用2%的瓊脂糖凝膠電泳，以檢測PCR產(chǎn)物。測序表明，該片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。二、控制水稻粒重基因的啟動子P-GS6的效果驗證1、利用本發(fā)明啟動子啟動⑶S表達的重組載體(PGS6:⑶S載體)的構(gòu)建擴增本發(fā)明啟動子所用引物為GUSF =TAAGGATCCaRtRRtRRcacaacacaatR 和 GUSR GATAAGCTTacgtcactcgccggaac ；以秈稻 93-11 基因組 DNA 為模板，以 GUSF 和 GUSR 引物為引物進行 PCR 擴增，擴增程序為1. 94°C 4min ； 2. 94 °C 45sec ；3. 58 °C 45sec ；4. 68 °C lmin30sec go to 2 for 30 cycles ；5. 68°C IOmin 擴增得到約 1. 51Λ 的啟動子片段，經(jīng) BamHl 和 HindIII 酶切后插入載體 pCAMBIA1381 (GenBank 號AF234302 ；CAMBIA 公司)的 BamHl和HindIII酶切位點之間，得到重組載體，將通過分析測序，確定該重組載體⑶S蛋白翻譯時，未發(fā)生移框變異。將驗證正確的載體命名為PGS6::GUS，其載體示意圖如圖1所示。pGS6:⑶S中，⑶S基因需要依靠GS6啟動子的啟動表達。2、轉(zhuǎn)pGS6:⑶S植株的獲得及其表達檢測利用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化將pGS6: :GUS轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化粳稻中花17號愈傷組織，然后進行如下抗性愈傷的篩選及植株再生基因槍轟擊轉(zhuǎn)化后先將愈傷組織在含ang/L 2,4-D的NB 基本培養(yǎng)基(N6大量+B5鐵鹽+B5微量+B5有機+300mg/L酸水解酪蛋白+500mg/L谷氨酰胺+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+3g/L植物凝膠；可購自北京尤尼康生物科技有限公司， 產(chǎn)品編號N492)中，2548°C暗培養(yǎng)，恢復生長一周，再轉(zhuǎn)入NB篩選培養(yǎng)基(NB基本培養(yǎng)基 +50mg/L潮霉素+2mg/L 2,4-D)中，在25_28°C暗培養(yǎng)條件下，篩選30d左右，挑取抗性突起，再在含NB篩選培養(yǎng)基中，繼續(xù)25-28 °C暗培養(yǎng)篩選30d左右，在NB預分化培養(yǎng)基(NB基本培養(yǎng)基+50mg/L 潮霉素+5mg/L ABA+2mg/LNAA+lmg/L 6-BA)，2548°C光照培養(yǎng) 20d 左右， 在NB分化培養(yǎng)基中(NB基本培養(yǎng)基+50mg/L潮霉素+lmg/L NAA+2mg/L 6-BA)中2548°C 光照培養(yǎng)分化，最后轉(zhuǎn)到含50mg/L潮霉素的V2MS壯苗培養(yǎng)基(V2MS基本培養(yǎng)基+IOOmg/ 肌醇+0. 5mg/LNAA+0. 25mg/L多效唑+50mg/L潮霉素)中2548°C光照培養(yǎng)30 40d，然后移栽到土壤獲得轉(zhuǎn)PGS6:⑶S植株。將上述獲得的轉(zhuǎn)pGS6 ⑶S植株進行如下PCR驗證采用PCR擴增潮霉素抗性基因(HYG)片段，檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株?？剐曰?HYG)檢測引物為HYG_F 5‘ -TACTTCTACACAGCCATC-3‘HYG_R 5' -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3‘(退火溫度 54°C )結(jié)果獲得5株P(guān)CR驗證陽性的轉(zhuǎn)pGS6:⑶S植株，并進行⑶S染色，轉(zhuǎn)基因陽性植株的穎殼在不同生長發(fā)育階段的組織GUS染色明顯。 ⑶S染色液配方，如表1所示表1.⑶S染色液配方_0. 5MEDTA100 μ 10. 5ΜNa2HPO4784 μ 1IMNaH2PO4185 μ 1IOOmMK4Fe(CN)625 μ 1IOOmMK3Fe(CN)625 μ 110%Triton-XlOO 50 μ 1X-Gluc100 μ 1加 ddH20 定容至 5ml_其中，X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-glucuronic acid)的配知方法為將 5. 24mg X-Gluc 溶于 100 μ 1 DMSO0實驗步驟1、將材料浸于90%丙酮，-20°C放置Ih ；2、抽真空(15Hg)狀態(tài)下，用磷酸鹽緩沖液洗兩次，每次5min ；50mmol/l的磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)配制方法A液取NaH2PO4. 2H20 3. 12g溶于蒸餾水，定溶至IOOml ；B液取Nei2HPO4. 12H20 7. 17g溶于蒸餾水，定溶100ml。取A液39ml 與B液61ml混合，定容至400ml，調(diào)PH至7. 0 ；3、37 °C，暗條件下一般溫育12 Mh，隨時觀察染色結(jié)果；4、待⑶S滲入材料中后，材料轉(zhuǎn)入透明液(乙醇乙酸=9 1)中，放置于室溫下3h。結(jié)果如圖2中a、b、C、d、e所示，轉(zhuǎn)基因陽性植株穎殼在不同生長發(fā)育階段的組織 GUS染色明顯，說明該基因在水稻穎殼發(fā)育過程中表達，參與了水稻穎殼發(fā)育的調(diào)控過程， GS6可以作為負調(diào)控因子直接在決定籽粒重量的重要部位穎殼中起作用。轉(zhuǎn)基因植株不同部位和發(fā)育時期的組織GUS染色表明GS6基因的啟動子P-GS6不是器官特異性表達啟動子，轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)時的根和芽，生長和伸長過程中的葉片、節(jié)間和枝梗等部位均有表達，說明GS6基因涉及水稻生長發(fā)育過程中的不同器官和組織，涵蓋水稻生長的不同的發(fā)育時期。
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有植物胚乳特異性表達啟動子功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的DNA分子的表達盒。
3.含有權(quán)利要求1所述的DNA分子的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌。
4.權(quán)利要求1所述的DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應用，所述轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因是以權(quán)利要求1所述的DNA分子為啟動子的啟動下表達的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述外源基因連接于權(quán)利要求1所述的DNA分子下游，通過植物表達載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到表達所述外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述權(quán)利要求1所述的DNA分子下游還連接有調(diào)控基因表達的調(diào)控元件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于所述外源基因為蛋白編碼基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因為正義RNA 基因和/或反義RNA基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啟動子及其應用。該啟動子，1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動子可以啟動外源基因在植物中表達，對水稻高產(chǎn)分子育種具有重要的理論及實際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應用和市場前景。
文檔編號C12N1/21GK102533756SQ20101061334
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者付永彩, 劉鳳霞, 孫傳清, 孫連軍, 朱作峰, 李曉嬌, 謝道昕, 譚祿賓 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學